宋冬梅，朱益波，周麗麗，鄭麗雪，齊 斌，*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長春130118;2.常熟理工學(xué)院發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，蘇州食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇常熟215500)

谷胱甘肽(glutathione，GSH)是在γ－谷氨酰半胱氨酸合成酶(GSH I)和谷胱甘肽合成酶(GSHⅡ)的連續(xù)催化下合成的含巰基活性三肽，具有解毒、抗氧化和抗衰老等重要的生理功能［1－3］，在食品、醫(yī)藥和生物等領(lǐng)域有著廣泛地應(yīng)用［4－7］。但是我國GSH的生產(chǎn)滿足不了市場的需求。近年來，GSH生產(chǎn)研究的熱點(diǎn)是利用DNA重組技術(shù)構(gòu)建高產(chǎn)GSH的重組菌。Murata等［8］構(gòu)建了具有較高GSH催化活性的重組 Escherichia coli。沈立新等［9］構(gòu)建了含 GSH I及GSHⅡ基因的質(zhì)粒pTrc－gsh，并在E.coli中得到了活性表達(dá)。Liao等［10］構(gòu)建的E.coli GSH I和GSH Ⅱ基因融合表達(dá)質(zhì)粒，提高了胞內(nèi)GSH含量。這些研究在一定程度上提高了重組菌GSH的產(chǎn)量，但總的來說都不理想。GSH I是GSH合成途徑的關(guān)鍵酶和限速酶［11］，構(gòu)建高GSH I活性的菌株將有助于提高重組菌GSH的產(chǎn)量。本文從實(shí)驗(yàn)室保存的一株高產(chǎn)GSH的Saccharomyces cerevisiae 2－10515出發(fā)，采用PCR技術(shù)擴(kuò)增得到GSH I基因，并在E.coli中實(shí)現(xiàn)表達(dá)，同時(shí)利用生物信息學(xué)方法對GSH I基因序列和結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析和預(yù)測，為進(jìn)一步提高GSH I表達(dá)量和活性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

S.cerevisiae 2－10515、E.coli JM109、E.coli BL21(DE3)、質(zhì)粒pET－28a 本實(shí)驗(yàn)室保藏;DNA限制性內(nèi)切酶Sac I和HindⅢ、Taq DNA聚合酶、T4 DNA Ligase、pMD19－T 載體、DNA Marker、質(zhì)粒小量提取試劑盒、DNA純化及膠回收試劑盒等 TaKaRa公司;其他試劑 均為國產(chǎn)分析純;YEPD培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基 配方見文獻(xiàn)［12］。

高速臺式離心機(jī)Legend Micro 17R Thermo公司;PCR儀、Gel Doc XR、水平電泳系統(tǒng)、垂直電泳系統(tǒng)、凝膠電泳成像儀 Bio－RAD公司;恒溫金屬浴Eppendorf公司;SW－CJ－ZF凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司;恒溫培養(yǎng)箱 太倉市華美生化儀器廠;電子天平 Mettler公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)Gene bank里已公布的S.cerevisiae S288c的gsh I基因設(shè)計(jì)引物，分別在上游和下游引物中引入酶切位點(diǎn)Sac I和HindⅢ:

P1(Forward):CACGAGCTCATGGGACTCTTAGCTTT酶切位點(diǎn)Sac I

P2(Reverse):CCCAAGCTTTTAACATTTGCTTTCTA酶切位點(diǎn)HindⅢ

1.2.2 克隆載體的構(gòu)建 采用周小玲等人［13］的方法提取S.cerevisiae 2－10515的基因組 DNA，以其為模板，P1和P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到gsh I基因。PCR 反應(yīng)參數(shù)為:95℃ 5min;94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 2min(30cycles);72℃ 10min。將gsh I連接到克隆載體pMD19－T上，構(gòu)建克隆質(zhì)粒 pMD19－T－gsh I，并轉(zhuǎn)化E.coli JM109，得到E.coli JM109(pMD19－T－gsh I)，提取克隆質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證，送上海生工生物有限公司測序。

1.2.3 E.coli重組表達(dá)載體的構(gòu)建 分別用限制性內(nèi)切酶Sac I和HindⅢ酶切克隆質(zhì)粒pMD19－T－gsh I和質(zhì)粒pET－28a，酶切產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化，16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α。抽提重組質(zhì)粒，經(jīng)酶切驗(yàn)證后測序。

將重組表達(dá)質(zhì)粒 pET－28a－gsh I熱激轉(zhuǎn)化到E.coli BL21(DE3)。

1.2.4 GSH I的誘導(dǎo)表達(dá) 挑取單菌落接入LB培養(yǎng)基(含100mg/mL Amp)，37℃培養(yǎng)至 OD550為 0.5左右時(shí)，在34℃，IPTG(0.1mmol/L)條件下，誘導(dǎo)表達(dá)。

1.2.5 SDS－PAGE檢測 按《分子克隆》［14］操作說明進(jìn)行SDS－PAGE電泳后，考馬斯亮藍(lán)R－250染色，脫色過夜，觀察結(jié)果。

1.2.6 GSH I酶活性的測定 取5mL培養(yǎng)液12000×g離心5min，棄上清，用50mmol/L，pH7.0的磷酸緩沖液洗滌，離心后收集菌體。用同樣的磷酸緩沖液4mL懸浮菌體后超聲波破碎［15］，加入GSH前體反應(yīng)液(谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸濃度均為40mmol/L，MgCl2和ATP濃度均為50mmol/L，GSH I濃度為2g/L)4mL，37℃反應(yīng) 30min，沸水浴 2min以終止反應(yīng)，用ALLOXAN試劑法［16］測GSH的生成量。酶活力單位(U)定義為37℃，pH7.0條件下，每分鐘催化合成1μg GSH所需的酶量。

1.2.7 GSH I的結(jié)構(gòu)分析 利用DNAMAN軟件推導(dǎo)出目的基因的氨基酸序列，分析其與Gene bank數(shù)據(jù)庫中其它物種同源蛋白氨基酸序列的一致性。

通過蛋白分析專家系統(tǒng)(ExPASy，http://ca.expasy.org/)提供的分析工具分別預(yù)測蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、一級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)。

利用3D－JIGSAW模擬GSH I的三級結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因克隆

以S.cerevisiae 2－10515基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物純化后電泳結(jié)果見圖1。圖1顯示:目的條帶在2000bp附近，與預(yù)計(jì)的條帶大小相吻合。

圖1 gsh I基因的PCR純化產(chǎn)物Fig.1 PCR purification product of gsh I

2.2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建

成功構(gòu)建的表達(dá)載體pET－28a－gsh I的結(jié)構(gòu)示意圖如圖2。將其用Sac I和HindⅢ酶切鑒定，結(jié)果如圖3。經(jīng)酶切的重組質(zhì)粒含有單一的約2Kb插入片段，這表明gsh I基因已插入質(zhì)粒pET－28a中。測序結(jié)果證明閱讀框插入位點(diǎn)正確。

圖2 重組表達(dá)載體pET－28a－gsh I結(jié)構(gòu)示意圖Fig.2 Construction of recombinant expression plasmid pET－28a－gsh I simple

圖3 重組質(zhì)粒pET－28a－gsh I/Sac I+HindⅢ酶切鑒定Fig.3 pET－28a－gsh I digested by Sac I and Hind Ⅲ

2.3 SDS－PAGE電泳分析

SDS－PAGE電泳后考馬斯亮藍(lán)染色，脫色過夜，觀察結(jié)果如圖4所示:2、3、4泳道與陰性對照(1泳道)相比，在81Ku附近有一條明顯的蛋白條帶，除去載體上的his－tag(分子量約為3ku)，其實(shí)際的蛋白質(zhì)分子量約為78ku，與預(yù)測的GSH I蛋白大小相符，很可能為表達(dá)的GSH I蛋白，該蛋白以融合蛋白的形式存在。

圖4 SDS－PAGE分析圖譜Fig.4 SDS－PAGE analysis of expression products

2.4 酶活力的測定

重組菌的GSH I活力測定結(jié)果見圖5，34℃誘導(dǎo)4h時(shí)，其活力達(dá)到46.09U/mg濕菌，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，GSH I活力并沒有增加，最佳誘導(dǎo)時(shí)間為4h。優(yōu)化各種表達(dá)條件，酶活力無明顯改善。

圖5 重組菌GSH I酶活力曲線Fig.5 GSH I enzymatic activity curve of recombinant strain

2.5 GSH I基因的結(jié)構(gòu)分析

2.5.1 Blast分析結(jié)果 該基因全長為2037bp，編碼678個(gè)氨基酸。對GSH I氨基酸序列進(jìn)行同源多重序列比對(如圖6)發(fā)現(xiàn):序列中部為保守序列，其關(guān)鍵氨基酸都在該保守序列中;與Gene bank中S.cerevisiae S288c、Macaca mulatta、Musmusculus、Branchiostoma floridae同源基因的氨基酸序列一致性分別為99%、42%、42%、41%。

圖6 GSH I的Clustal多重序列比對Fig.6 Multiple alignment of GSH I by Clustal

2.5.2 GSH I蛋白質(zhì)的理化性質(zhì) 利用ExPASy中ProtParam預(yù)測GSH I的理論分子量為78281.6u;等電點(diǎn)為5.87;含有9個(gè)半胱氨酸;其中第164位和第642位半胱氨酸有形成二硫鍵的可能性;該蛋白質(zhì)的性質(zhì)不穩(wěn)定，在溶液中的不穩(wěn)定指數(shù)為42.19，高于閾值40;脂溶性指數(shù)為77.52;親水指數(shù)(GRAVY)為－0.507，為親水性蛋白。其成熟肽N端為蛋氨酸時(shí)，在哺乳動(dòng)物網(wǎng)狀紅細(xì)胞體外表達(dá)的半衰期為30h，在酵母和大腸桿菌中表達(dá)的半衰期分別為20、10h。

2.5.3 GSH I的二級結(jié)構(gòu) 利用ExPASy中PredictProtein分析蛋白的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)，該蛋白沒有信號肽，為非分泌蛋白;在253～272aa、285～308aa和484～511aa處有三個(gè)跨膜區(qū);α－螺旋∶延伸鏈:β－折疊∶無規(guī)則卷曲 =35.10∶16.52∶8.85∶39.53，表明蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的主要結(jié)構(gòu)元件是α－螺旋和無規(guī)則卷曲，具有較多的無規(guī)則卷曲，不利于其穩(wěn)定;mRNA的二級結(jié)構(gòu)在起始密碼子處形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)。

2.5.4 GSH I的三級結(jié)構(gòu) 將GSH I的氨基酸序列提交到3D－JIGSAW服務(wù)器預(yù)測GSH I三級結(jié)構(gòu)，用Pymol軟件打開，如圖7所示，發(fā)現(xiàn)酶結(jié)構(gòu)較松散，側(cè)鏈間相互作用不強(qiáng)，這與ProtParam的預(yù)測結(jié)果相一致。

圖7 GSH I三級結(jié)構(gòu)圖Fig.7 3D structure of GSH I

3 結(jié)論與討論

已有學(xué)者在S.cerevisiae和Pichia pastoris中表達(dá)了 GSH I［17－18］，但這些報(bào)道中 GSH I 的表達(dá)量不高，酶活力也較低，使得構(gòu)建好的菌株無法達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)的要求。S.cerevisiae是高產(chǎn)GSH的菌株，將其GSH I在E.coli中表達(dá)，有望構(gòu)建高活性的GSH I重組菌，為工業(yè)化生產(chǎn)GSH奠定基礎(chǔ)。本研究成功克隆了S.cerevisiae 2－10515的gsh I基因，將編碼GSH I的基因定向克隆到pET－28a載體上，構(gòu)建了重組菌株 E.coli BL21(DE3)/pET－28a－gsh I，34℃ 誘導(dǎo) 4h時(shí)，活力達(dá)到 46.09U/mg 濕菌，高于 Fan［17］、饒志明［18］等構(gòu)建的重組菌株。

利用生物信息學(xué)方法分析S.cerevisiae 2－10515 GSH I序列可知:a.gsh I基因轉(zhuǎn)錄出的mRNA在5＇端起始部位區(qū)形成了發(fā)卡結(jié)構(gòu)，有研究證實(shí)這種發(fā)卡結(jié)構(gòu)會遮蔽SD序列和起始密碼子部位能阻止30s核糖體亞基的結(jié)合，從而減慢翻譯起始頻率［19］，降低相應(yīng)蛋白質(zhì)的表達(dá)量。B.GSH I在溶液中的不穩(wěn)定指數(shù)為 42.19，高于閾值 40;GSH I親水指數(shù)為－0.507，為親水性蛋白;該酶分子中含有較多的無規(guī)則卷曲，結(jié)構(gòu)比較松散。這些都說明GSH I穩(wěn)定性較差［20］，不利于活性的提高。所以，從基因水平對S.cerevisiae 2－10515進(jìn)行分子改造能進(jìn)一步提高該酶的表達(dá)量和活性。

Huang［21］通過對 mRNA 結(jié)構(gòu)的改造，消除了起始密碼子附近mRNA的二級結(jié)構(gòu)，從而提高了木聚糖酶的表達(dá)量;Jeong［22］、Mahadevan［23］等通過同源建模及結(jié)構(gòu)分析，利用定點(diǎn)突變增加了酶的穩(wěn)定性。這些研究都為后續(xù)對S.cerevisiae GSH I分子改造提供了很好的基礎(chǔ)。本文在 E.coli中成功表達(dá)了S.cerevisiae來源的GSH I，為工業(yè)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ);并對其進(jìn)行了初步的生物信息學(xué)分析，為后續(xù)研究指明了方向。

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