楊 攀，袁永俊，*，王 健，胡麗麗，代亞民，代 斌

(1.西華大學(xué)生物工程學(xué)院，四川成都610039;2.四川省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢測院，四川成都610031)

固定化酵母又叫固定化活細(xì)胞或固定化增殖細(xì)胞，是指用適當(dāng)?shù)妮d體材料和科學(xué)的方法將活酵母固定在載體上，使該細(xì)胞能在適宜的條件下不斷生長繁殖，從而能促使有機物質(zhì)連續(xù)地進(jìn)行反應(yīng)［1］。固定化酵母細(xì)胞的應(yīng)用，使乙醇萃取發(fā)酵得到迅速的發(fā)展。Minier和 Coma較早提出了乙醇發(fā)酵的方案［2］，他們將酵母細(xì)胞固定化，并在培養(yǎng)基中加入十二烷醇進(jìn)行內(nèi)部隨程萃取發(fā)酵，結(jié)果葡萄糖轉(zhuǎn)化比較徹底，乙醇產(chǎn)率也比較高。本研究在游離酵母細(xì)胞和固定化酵母細(xì)胞中加入十二烷醇萃取劑，并通過測定內(nèi)部隨程發(fā)酵和外部隨程發(fā)酵后殘?zhí)呛恳约凹?xì)胞生的OD值作為指標(biāo)分析，探討十二烷醇對酵母游離細(xì)胞和固定化細(xì)胞的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

十二烷醇、葡萄糖、海藻酸鈉 成都科隆試劑有限公司;安琪牌活性干酵母 湖北安琪酵母股份有限公司。

電子天平 北京塞多利斯天平有限公司;SHB-A型水浴恒溫振蕩器 榮華有限公司;UV-2600型紫外可見分光光度計 龍泥科上海有限公司;PHS-25型酸度計 成都方舟科技開發(fā)公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酵母細(xì)胞的固定化 按每100mL蔗糖加入3～4g活性酵母的比例，在2%蔗糖水中32℃條件下活化2h。加入糖度為10Be的麥芽汁培養(yǎng)基［3］，放入搖床中在28℃，120r/min條件下增殖24h。將增殖后的培養(yǎng)液無菌條件下用離心管分裝，在3000r/min、4℃下離心10min棄去上清液，加入適量無菌生理鹽水，將其振蕩打散以清洗菌體，重復(fù)三次，最后一次用無菌水混合菌體制備菌懸液(每1mL菌懸液中含有0.2g 濕菌體)［4］。與 3% 的海藻酸鈉溶液［5］混合均勻，利用注射器吸取混合液，無菌條件下滴入2%CaCl2溶液，形成球狀顆粒。冷凍或常溫下靜置2h以上，使其充分固化后，再用無菌水洗滌三遍［6］。

1.2.2 固定化酵母的增殖 每50g固定化酵母顆粒中加100mL增殖培養(yǎng)基，搖床30℃，120r/min，震蕩培養(yǎng) 24h［7］。

1.2.3 細(xì)胞生長OD值的測定 細(xì)胞生長狀況的測定采用分光光度計法，在600nm處測吸光度［8］。

游離細(xì)胞生長測定:吸取1mL樣品菌液于微量離心管中，1200r/min離心1min，棄上清夜，再充分震蕩將菌體完全分散，定容至10mL，搖勻，以蒸餾水為對照，在600nm處測定OD值。

固定化細(xì)胞生長測定;將一粒固定化小球溶于含有7mL磷酸溶液的試管中(8%KH2PO4+7%K2HPO4，pH6.5)，震蕩 2h 溶解，4000r/min 離心10min，生理鹽水定容至10mL，以蒸餾水為對照，在600nm處測定OD值。

1.2.4 殘?zhí)菧y定方法 剩余殘?zhí)堑臏y定采用斐林試劑法［9］。

2 結(jié)果與分析

內(nèi)部隨程萃取是指萃取劑在反應(yīng)器中與培養(yǎng)基直接接觸，以便將產(chǎn)物萃取到溶劑中去。外部隨程萃取是指將培養(yǎng)液引出反應(yīng)器，萃取劑和培養(yǎng)液在另外的萃取裝置中接觸，從而萃取產(chǎn)物的過程［10］。

2.1 萃取劑對游離細(xì)胞發(fā)酵的影響(內(nèi)部隨程萃取發(fā)酵系統(tǒng))

從圖1可以看出，隨著萃取劑濃度的增加，細(xì)胞生長OD值下降，萃取劑對游離細(xì)胞毒害增加，4條細(xì)胞生長曲線分散，差別比較大，酵母細(xì)胞的生長受到較大抑制。造成這種現(xiàn)象的原因可能是有機溶劑對細(xì)胞存在“相”毒性和“分子”毒性，“相”毒性由兩相界面引起，“分子”毒性由溶解于水中的有機溶劑作用而引起［11］。由于游離的酵母細(xì)胞在培養(yǎng)基中直接和萃取劑接觸，萃取劑的濃度越大，根據(jù)擴(kuò)散現(xiàn)象，進(jìn)入細(xì)胞里面的濃度也越大，產(chǎn)生的毒害作用越強，細(xì)胞生長就會下降。

圖1 萃取劑濃度對細(xì)胞生長OD值的影響Fig.1 Effect of extraction solvent’s concentration on cell’s growth

從圖2可以看出，隨著萃取劑濃度增加，糖的降解率降低，這正與圖1中細(xì)胞生長下降的現(xiàn)象相符合，萃取劑濃度高時酵母菌的生長受到抑制，葡萄糖沒有被酵母菌充分利用，從而導(dǎo)致殘?zhí)堑暮亢芨?，在發(fā)酵40h左右時，殘?zhí)呛孔罡哌_(dá)8%左右，沒添加萃取劑的殘?zhí)呛績H為1.5%，兩者差別大。

圖2 萃取劑濃度對殘?zhí)菨舛鹊挠绊慒ig.2 Effect of extraction solvent’s concentration on residual sugar

2.2 萃取劑對固定化細(xì)胞的影響(內(nèi)部隨程萃取發(fā)酵系統(tǒng))

從圖3變化可以看出，隨著萃取劑濃度的增加，萃取劑對固定化細(xì)胞的毒害仍然存在，但是相比較游離細(xì)胞來說明顯有所改善，內(nèi)部隨程萃取發(fā)酵時高濃度的十二烷醇與培養(yǎng)液存在“相”現(xiàn)象，有機溶劑會部分?jǐn)U散到培養(yǎng)液中，由于兩者在同一裝置中，培養(yǎng)液中萃取劑的濃度會維持在一個穩(wěn)定的狀態(tài)，培養(yǎng)液中的有機溶劑分子就會滲透到細(xì)胞內(nèi)，對細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，對發(fā)酵產(chǎn)生了一定影響。相比游離細(xì)胞，細(xì)胞固定化，可以較大程度地減少有機溶劑和生物細(xì)胞的接觸，減小了“分子”毒性的影響，因而有效地緩解有機溶劑的毒害作用。4條細(xì)胞生長曲線已經(jīng)稍微接近，證明固定化細(xì)胞對萃取劑的毒性有良好的抵抗能力。

圖3 萃取劑濃度對細(xì)胞生長OD值的影響Fig.3 Effect of extraction solvent’s concentration on cell’s growth

從圖4可以進(jìn)一步看出，固定化細(xì)胞所帶來的實際效果，由于細(xì)胞的生長不再像之前那樣受萃取劑的嚴(yán)重毒害，降糖效果比較良好，各條降糖曲線相對比較接近，固定化細(xì)胞內(nèi)部隨程萃取發(fā)酵系統(tǒng)已經(jīng)有了較好的結(jié)果，殘?zhí)呛渴Ｏ铝?%左右，但是，仍然可以看到萃取劑對細(xì)胞的毒害以及其他方面的抑制作用存在。

圖4 萃取劑濃度對殘?zhí)菨舛鹊挠绊慒ig.4 Effect of extraction solvent’s concentration on residual sugar

2.3 萃取劑對固定化細(xì)胞的影響(外部隨程萃取發(fā)酵系統(tǒng))

從圖5和圖6可以看出，隨著萃取劑濃度的增加，萃取劑對固定化細(xì)胞毒害再次降低，各條曲線進(jìn)一步接近。而殘?zhí)堑淖兓厔萸€幾乎有合攏的趨勢，殘?zhí)窃诎l(fā)酵40h后基本上是在1%左右。從細(xì)胞生長OD值和殘?zhí)堑淖兓厔輧蓚€指標(biāo)，足以證明萃取劑對固定化細(xì)胞外部隨程萃取發(fā)酵系統(tǒng)的影響已經(jīng)達(dá)到令人滿意的效果。因為固定化細(xì)胞外部隨程萃取時，由于萃取劑和培養(yǎng)液在兩個裝置中，消除了“相”毒性的存在，同時由于培養(yǎng)液中的萃取劑僅為萃取結(jié)束后培養(yǎng)液返回時攜帶的少量溶劑，“分子“毒性降低到了最小，因此對細(xì)胞的毒害作用很小。從殘?zhí)堑暮繉Ρ染涂梢缘贸鰜怼２煌瑵舛鹊妮腿┢錃執(zhí)呛坎顒e很小。

圖5 萃取劑濃度對細(xì)胞生長OD值的影響Fig.5 Effect of extraction solvent’s concentration on cell’s growth

圖6 萃取劑濃度對殘?zhí)菨舛鹊挠绊慒ig.6 Effect of extraction solvent’s concentration on residual sugar

3 結(jié)論

3.1 采用不同濃度的萃取劑對游離酵母細(xì)胞和固定化酵母細(xì)胞的毒害性進(jìn)行分析，從生長曲線和殘?zhí)呛績蓚€指標(biāo)考察，隨著萃取劑濃度的增加，對游離的細(xì)胞的毒害也在增加，生長曲線很散，酵母生長受到抑制，使得殘?zhí)呛恳脖容^大。

3.2 萃取劑對固定化細(xì)胞毒害性相對較小，外部隨程發(fā)酵效果比內(nèi)部隨程發(fā)酵效果更明顯，從生長曲線和殘?zhí)呛恐垒腿┑挠绊懞苄?。因此對固定化?xì)胞采取外部隨程發(fā)酵是最佳的方法。

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