胡曉嵐，湯麗倩，張 翀，朱金梁，馮乾健，陳青俊，虞英民，安 然，歐菊芳

(1.杭州澳醫(yī)保靈藥業(yè)有限公司，浙江杭州310022;2.國家輕工業(yè)食品質(zhì)量監(jiān)督檢測杭州站，浙江杭州310009)

蜂花粉為工蜂采集花粉，用唾液和花蜜混合后形成，包括工蜂采集而成的團(tuán)粒和人工粉碎而成的粉末［1］。蜂花粉中含有豐富的營養(yǎng)成分，如必需氨基酸、不飽和脂肪酸、維生素、多酚類和黃酮類、多糖等活性物質(zhì)。蜂花粉具有多種保健功能，能增強(qiáng)機(jī)體免疫力，防止動脈硬化、高血脂、高血壓、靜脈曲張等疾?。?］。蜂花粉的生物活性與其含有的豐富的黃酮類成分有關(guān)［3］。對蜂花粉的總黃酮含量進(jìn)行檢測，目前主要的方法有:電導(dǎo)滴定法［4］、毛細(xì)管電泳法［5］、液相色譜法［6］、比色法［7］、分光光度法［8］。本文以分光光度法測定蜂花粉中的總黃酮含量，以探索國產(chǎn)不同產(chǎn)地、不同品種蜂花粉中總黃酮含量的差別。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

在2008～2011年期間采集的79份不同產(chǎn)地、不同品種的蜂花粉。采集的花粉保存于-18℃的冷庫中;無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉 分析純;蘆丁對照品 中國藥品生物制品檢定所，純度92.5%。

UV2550紫外分光光度計 蘇州島公司;FA2004電子天平 上海電子天平廠。

1.2 黃酮測定方法

1.2.1 試液制備 精確稱取蜂花粉樣品1～3g(精確至0.0001g)，加70%乙醇40m L，加熱回流2h提取樣品中的黃酮，冷卻，濾過，將濾液置于50m L容量瓶中，以70%乙醇洗滌殘渣，將洗滌液并入容量瓶，用70%乙醇定容至刻度，搖勻，從中精確吸取2m L，置于10m L容量瓶，用70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，待測。

1.2.2 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密量取200μg/m L蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品使用液0、1、2、3、4、5、6m L，分別置于 25m L 容量瓶中，各加水至6.0m L，加5%亞硝酸鈉溶液和10%硝酸鋁溶液各1m L，搖勻，放置6分鐘，加氫氧化鈉試液10m L，加水至刻度，搖勻，放置15min，510nm作為測定波長，分光光度法測定標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光值，以吸光值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 試液測定 精確量取按“1.2.1”所示方法制備的試液2m L，置于25m L容量瓶中，實驗方法同1.2.2，將結(jié)果帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得試液中的黃酮濃度。

1.2.4 分析方法的確定

1.2.4.1 波長的確定 黃酮與亞硝酸鈉和硝酸鋁反應(yīng)形成絡(luò)合物，在可見光區(qū)具有吸收峰［8］。本文按照“1.2.2”所述的方法使標(biāo)準(zhǔn)溶液顯色，在400～600nm的波長范圍內(nèi)對溶液進(jìn)行掃描。

1.2.4.2 黃酮提取方法 精確稱取油菜花粉樣品1～3g(精確至0.0001g)，分別采用“70%乙醇，加熱回流2h”、“70%乙醇，加熱回流4h”、“無水乙醇，加熱回流2h”和“無水乙醇，超聲30min”4種方法進(jìn)行提取，加熱回流的溫度為90℃，超聲波功率為100W，再按前述方法對提取液中的黃酮含量進(jìn)行測定。

表1 黃酮的不同提取方法Table 1 Protocols for extracting of flavones

1.2.4.3 絡(luò)合物穩(wěn)定性 按“1.2.1”配制樣品溶液，按照“1.2.3”所述的方法使溶液顯色，經(jīng)過 5、10、15、20、30m in的放置后分別測定溶液的吸光值。

1.2.5 方法精密度 選擇油菜花蜂花粉和玉米花蜂花粉，分別對其中的黃酮含量進(jìn)行測定，以6次測定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)誤來衡量測定方法的精密度。

1.2.6 方法回收率 選擇油菜花蜂花粉，分別按本底值1.5、1.0、0.8倍的量加入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，每一加量重復(fù)3次，分別測定提取液中的黃酮含量，根據(jù)測定結(jié)果計算回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)研究

2.1.1 測定波長 實驗結(jié)果表明，絡(luò)合反應(yīng)的生成物在波長510.40nm處吸光值最大，故本實驗選定510nm作為測定波長。

圖1 絡(luò)合物紫外掃描圖Fig.1 UV scan of the conjugate

2.1.2 黃酮提取方法 從表2可以看出，不同方法對黃酮提取率高低影響順序依次為:4＞1＞3＞2，但是“方法4”的提取液有時會含有沉淀。綜合考慮，本文最終選擇“方法1”作為整個實驗的提取方法。

表2 與不同提取方法相對應(yīng)的黃酮含量Table 2 Content of flavones extracted by different protocols

2.1.3 絡(luò)合物穩(wěn)定性 從表3中可以看出，絡(luò)合物在15m in內(nèi)較穩(wěn)定，故將放置時間定為15m in。

表3 絡(luò)合物穩(wěn)定性實驗結(jié)果Table 3 Results of the test on stability of the complex

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線 從圖2中可以看出，蘆丁在0.2～1.2mg質(zhì)量范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性相關(guān)方程:y=0.525x-0.00771，R2=0.9995。

圖2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.2 Standard curve of rutin

2.1.5 精密度 6次測定的結(jié)果表明油菜花蜂花粉和玉米花蜂花粉中黃酮含量的平均值分別為2.79%和0.50%;測定精密度分別為1.53%和2.36%。

表4 精密度測定結(jié)果Table 4 Results of the precision test

2.1.6 回收率 3個添加水平共9次測試的結(jié)果顯示，蘆丁在油菜花蜂花粉中的添加回收率介于94.5%～98.0%，平均回收率96.7%。

2.2 樣品測定

按“1.2”所述方法檢測2008～2011年收集的全國79份15個品種蜂花粉樣品，檢測結(jié)果見表6。

表5 回收率實驗結(jié)果(70%回流2h)Table 5 Results of the test on recovery

表6 不同產(chǎn)地、不同品種蜂花粉總黃酮含量測定結(jié)果Table 6 Results of the test on content of flavones in bee pollens of different varieties collected from different regions

續(xù)表

從表6中可以看出，在所有79個批次樣品中，總黃酮含量最高的來自油菜花蜂花粉(3.49%)，含量最低的來自玉米花蜂花粉(0.49%)。

以品種為分析目標(biāo)，對所有樣品的總黃酮含量做差異顯著性分析，發(fā)現(xiàn)含量最高的是油菜花蜂花粉(平均達(dá)到3.15%)，其次是玫瑰花蜂花粉和五味子花蜂花粉(平均達(dá)到2.20%和2.04%)，15個品種中總黃酮含量最低的是芝麻花蜂花粉(平均為0.52%)(表7)。

對于油菜花蜂花粉，在所涉及的6個省區(qū)內(nèi)，采自青海、新疆、浙江、內(nèi)蒙古、安徽5個省區(qū)的樣品，其總黃酮含量無明顯差異，但它們均明顯高于采自甘肅省的樣品(表8)。同樣對于油菜花蜂花粉，在所涉及的4個年份內(nèi)，2008～2010年采集的樣品，其總黃酮含量無明顯差異，但它們均明顯高于2011年采集的樣品(表9)。以上統(tǒng)計結(jié)果表明產(chǎn)地和采集年份對油菜花蜂花粉總黃酮含量有影響，但影響程度有限。

表7 不同品種蜂花粉總黃酮含量Table 7 Content of flavones in bee pollens of different varieties

表8 不同省區(qū)油菜花蜂花粉總黃酮含量Table 8 Content of flavones in bee pollens collected from cole in different provinces

表9 不同年份油菜花蜂花粉總黃酮含量Table 9 Content of flavones in bee pollens collected from cole in different years

如果不考慮品種和采集年份，總黃酮含量最高的蜂花粉是產(chǎn)自青海的(平均達(dá)到2.91%)，其次是產(chǎn)自新疆的(平均達(dá)到2.55%)，再其次是產(chǎn)自廣東的(平均達(dá)到1.93%)，產(chǎn)自黑龍江和海南的蜂花粉總黃酮含量最低(兩者均為0.64%)。以產(chǎn)地為目標(biāo)，對所有樣品的總黃酮含量做差異顯著性分析，發(fā)現(xiàn)盡管差異幅度較大，但大多并無統(tǒng)計學(xué)意義(表10)。

3 討論與結(jié)論

3.1 魏永生等［9］比較了索氏提取法、熱回流法、冷浸法，比較了不同提取法對于蜂花粉總黃酮的提取效果。本文對熱回流法和超聲提取法的提取率同樣做了比較。從減少有毒溶劑的使用和便于溶劑回收的角度，兩種提取均用乙醇作為溶劑，研究結(jié)果表明在預(yù)設(shè)的提取流程下超聲法對總黃酮的提取率并不低，甚至略高于熱回流提取法，但超聲法在提取時往往會產(chǎn)生沉淀而熱回流法的提取液可以直接用于測定，結(jié)合時效性方面的考慮，本文最終確認(rèn)“70%乙醇，加熱回流2h”是提取的最佳選擇。

表10 不同產(chǎn)地蜂花粉總黃酮含量Table 10 Content of flavones in bee pollens from different regions

3.2 本文對2008～2011年間采自23個的不同省份的15個品種共79個批次的國產(chǎn)蜂花粉中總黃酮含量進(jìn)行了測定。從品種上看，總黃酮含量最高的當(dāng)屬油菜花蜂花粉(平均達(dá)到3.15%)。張紅城等［10］和董捷等［11］分別對6個和8個品種的蜂花粉的總黃酮含量做了比較，其結(jié)果均顯示油菜花蜂花粉是總黃酮含量最高的品種。在這一點(diǎn)上，本文的研究結(jié)果與前人完全一致。按照總黃酮含量高低，本文所涉及的15個品種的排列順序為:油菜花＞玫瑰花≥五味子花＞雜花≥虞美人花≥向日葵花=蠶豆花≥子瓜花≥黨參花≥蕎麥花≥荷花≥玉米花=茶花≥南瓜≥芝麻花。同樣地，按照總黃酮含量高低，張紅城等［10］的6個品種的排列順序為:油菜＞杏花＞蕎麥＞茶花＞向日葵花 ＞荷花;董捷等［11］的8個品種的排列順序為:油菜＞五味子＞杏花＞蕎麥＞玫瑰＞茶花＞向日葵花＞荷花。對照本文和前人的研究結(jié)果，可以認(rèn)定油菜花和五味子花的蜂花粉屬于總黃酮含量較高的品種，而茶花和荷花的蜂花粉總黃酮含量往往較低。至于玫瑰花、向日葵花和蕎麥花，本文的排列順序與前人的有所不同。本文所涉及的品種相對較多，除了在前人已經(jīng)比較過的油菜、玫瑰、五味子、向日葵花、蕎麥花、荷花、茶花等7個品種之外，本文還對虞美人、蠶豆、子瓜、黨參、玉米、南瓜、芝麻等7個品種做了比較。

3.3 本文以油菜花蜂花粉為例，分析了產(chǎn)地和采集年份對同一品種蜂花粉總黃酮含量的影響。從分析結(jié)果可以看出，蜂花粉的總黃酮含量在同一品種內(nèi)是相對穩(wěn)定，產(chǎn)地和年份因素對總黃酮含量檢測結(jié)果均有影響，但影響程度有限。這一結(jié)論建立在2008～2011年從6省區(qū)采集的15份樣品的分析上，因此具有一定的可信度。

3.4 產(chǎn)地因素對蜂花粉總黃酮含量究竟有無實質(zhì)影響，是人們一直以來感興趣的一個問題，如果不考慮品種和采集年份，正如表8所顯示的那樣，總黃酮含量盡管看似差異較大，但這種差異大多并無統(tǒng)計學(xué)意義，這是主要因為同一省區(qū)的蜂花粉中往往包含總黃酮含量差別較大的若干不同品種。更為精確的分析只有建立在更大樣品量的基礎(chǔ)上，因此今后須進(jìn)一步加大各省區(qū)的樣品采集量，這樣才能有效解答上述疑問。本文通過對不同年份從全國各省區(qū)采集的不同品種的79個批次的蜂花粉樣品的檢測，使人們對國內(nèi)市場上蜂花粉品種黃酮含量分布情況有了初步了解，為蜂花粉資源的合理開發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)。

［1］蜜蜂產(chǎn)品術(shù)語.GB/T20573-2006［S］.

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［3］王開發(fā).花粉營養(yǎng)價值與食療［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2008.

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