乳制品中β-內(nèi)酰胺酶快速檢測(cè)方法的研究

劉 芳，李傳禮，何永盛，張毅杰，楊 平

（深圳市計(jì)量質(zhì)量檢測(cè)研究院，廣東深圳518131）

抗生素殘留是乳品行業(yè)面臨的一個(gè)重要安全問(wèn)題[1-3]。以青霉素為代表的β-內(nèi)酰胺類抗生素可用于治療牛乳房炎和其他細(xì)菌感染性疾病[4]，然而過(guò)度使用或?yàn)E用會(huì)導(dǎo)致其通過(guò)乳牛機(jī)體的血液殘留于牛奶中。我國(guó)對(duì)生鮮乳中抗生素的含量作出了嚴(yán)格規(guī)定[5]，然而部分不法商販和奶農(nóng)把β-內(nèi)酰胺酶加入到牛奶中，掩蓋其抗生素殘留超標(biāo)的事實(shí)，這可能會(huì)使消費(fèi)者對(duì)青霉素等抗生素類藥物耐藥性增高[6]。為了保障人民群眾身體健康，有必要建立快速有效的方法來(lái)檢測(cè)乳制品中的β-內(nèi)酰胺酶。研究者已建立了多種方法檢測(cè)乳制品中的β-內(nèi)酰胺酶[7-10]，但這些方法均存在著一定的不足。碘量法的靈敏度和重現(xiàn)性較差；酸測(cè)定法存在假陽(yáng)性和假陰性的問(wèn)題；液相色譜法的樣品前處理步驟繁瑣，檢測(cè)儀器昂貴；微生物法的檢測(cè)周期較長(zhǎng)。與之相比，利用試劑盒建立的快速檢測(cè)方法不需要經(jīng)過(guò)復(fù)雜的樣品前處理，操作簡(jiǎn)便，結(jié)果精確而且直觀易懂[11]，因此也越來(lái)越多地被應(yīng)用到β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)當(dāng)中。目前對(duì)β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)的研究多集中在以一種或兩種檢測(cè)方法對(duì)某一類乳制品中的β-內(nèi)酰胺酶進(jìn)行檢測(cè)，為β-內(nèi)酰胺酶在不同種類乳制品中建立相應(yīng)的檢測(cè)方法并分別確定其最低檢出限的報(bào)道尚不多見。Charm試劑盒法作為一種免疫分析方法，利用β-內(nèi)酰胺酶可分解β-內(nèi)酰胺類抗生素的原理，通過(guò)配體-受體識(shí)別法快速檢測(cè)與β-內(nèi)酰胺酶反應(yīng)后殘留的青霉素的含量，從而可以間接檢測(cè)樣品中是否含有β-內(nèi)酰胺酶。本研究嘗試?yán)肅harm試劑盒建立一種快速檢測(cè)方法，測(cè)定β-內(nèi)酰胺酶在不同種類乳制品中的最低檢出限，并以杯碟法作為比較，利用這兩種方法進(jìn)行樣品的檢測(cè)，為建立不同種類乳制品中β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)方法提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藤黃微球菌（Micrococcus luteus） CMCC（B）28001，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心；β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)品（0.54U/mg）、青霉素G標(biāo)準(zhǔn)品 sigma公司；舒巴坦 Fluorochem公司；抗生素鑒定培養(yǎng)基Ⅱ 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；牛津杯 深圳新拓?fù)渖锟萍加邢薰荆籆harm試劑盒、孵育器和讀數(shù)儀 北京博歐實(shí)德生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的前處理 液態(tài)奶樣品可直接使用；酸奶樣品用磷酸鹽緩沖液（p H7.4）按1∶4（v/v）的比例進(jìn)行稀釋；奶粉和奶酪樣品用磷酸鹽緩沖液（pH7.4）按1∶7（m/v）的比例進(jìn)行稀釋。

1.2.2 快速檢測(cè)法測(cè)定乳制品中β-內(nèi)酰胺酶最低檢出限 準(zhǔn)確稱取一定量的β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)品，以前處理后的乳制品為溶劑，配制成濃度為1.0×10-4～1.0×10-3U/mL的加標(biāo)樣液，從不同濃度的加標(biāo)樣液中取出300μL至1.5mL離心管，加入60μL青霉素陽(yáng)性質(zhì)控液，配成待檢溶液，室溫下反應(yīng)3min。用移液槍取出300μL待檢溶液，滴加至檢測(cè)條的凹槽中，56℃孵育8min，取出后3min內(nèi)判讀結(jié)果。根據(jù)加標(biāo)樣液的檢測(cè)結(jié)果確定每個(gè)樣品在快速檢測(cè)法中的β-內(nèi)酰胺酶檢出限，以每類乳制品中檢出限的最大值作為該類乳制品在快速檢測(cè)法中的β-內(nèi)酰胺酶最低檢出限。

1.2.3 杯碟法測(cè)定乳制品中β-內(nèi)酰胺酶最低檢出限

準(zhǔn)確稱取一定量的β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)品，配制濃度為1.5×10-3U/mL的β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)溶液，同時(shí)以前處理后的乳制品為溶劑，配制濃度為1.0×10-5～5.0×10-5U/mL的加標(biāo)樣液，參照《乳及乳制品中舒巴坦敏感β-內(nèi)酰胺酶類藥物檢驗(yàn)方法——杯碟法》進(jìn)行檢測(cè)和結(jié)果判定。根據(jù)加標(biāo)樣液的檢測(cè)結(jié)果確定每個(gè)樣品在杯碟法中的β-內(nèi)酰胺酶檢出限，以每類乳制品中檢出限的最大值作為該類乳制品在杯碟法中的β-內(nèi)酰胺酶最低檢出限。

1.2.4 樣品中β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè) 從市場(chǎng)上購(gòu)買不同品牌的液態(tài)奶、酸奶、奶粉、奶酪等乳制品以及原料奶作為樣品，分別用快速檢測(cè)法和杯碟法進(jìn)行檢測(cè)，以此比較兩種方法的β-內(nèi)酰胺酶檢出率。

1.2.5 β-內(nèi)酰胺酶的耐熱性和耐久性實(shí)驗(yàn) 以液態(tài)奶為溶劑配制濃度范圍為8.0×10-5～5.0×10-4U/mL的β-內(nèi)酰胺酶加標(biāo)樣液，于室溫下放置一周，期間每天均用快速檢測(cè)法對(duì)不同濃度加標(biāo)樣液中β-內(nèi)酰胺酶的殘留活性進(jìn)行檢測(cè)。另外，配制濃度范圍為8.0×10-5～8.0×10-4U/mL的β-內(nèi)酰胺酶加標(biāo)樣液，模擬巴氏殺菌（65℃ 30min或75℃ 15s）以及保持滅菌（115℃10min）的條件，對(duì)加標(biāo)樣液進(jìn)行加熱處理，用快速檢測(cè)法檢測(cè)β-內(nèi)酰胺酶的殘留活性，研究這些處理方式對(duì)β-內(nèi)酰胺酶活性的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 快速檢測(cè)法中β-內(nèi)酰胺酶最低檢出限的測(cè)定

選取液態(tài)奶、酸奶、奶粉和奶酪各10種產(chǎn)品進(jìn)行快速檢測(cè)法的加標(biāo)實(shí)驗(yàn)。加標(biāo)乳制品中β-內(nèi)酰胺酶的濃度控制在1.0×10-4～1.0×10-3U/mL之間，以每類乳制品中β-內(nèi)酰胺酶檢出限的最大值作為該類乳制品在快速檢測(cè)法中的最低檢出限。表1的檢測(cè)結(jié)果顯示，液態(tài)奶中β-內(nèi)酰胺酶的檢出限最低，而其他乳制品由于在前處理中以磷酸鹽緩沖液按一定的比例進(jìn)行了稀釋，所以折算后的β-內(nèi)酰胺酶檢出限均比液態(tài)奶高。

表1 不同乳制品在快速檢測(cè)法中的β-內(nèi)酰胺酶最低檢出限Table 1 Detection limit ofβ-lactamase in different dairy product base on Charm detection method

2.2 杯碟法中β-內(nèi)酰胺酶最低檢出限的測(cè)定

同樣選取液態(tài)奶、酸奶、奶粉和奶酪各10種樣品進(jìn)行杯碟法的加標(biāo)實(shí)驗(yàn)。加標(biāo)乳制品中β-內(nèi)酰胺酶的濃度控制在1.0×10-5～5.0×10-5U/mL之間，實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如表2所示。與快速檢測(cè)法得出的結(jié)果類似，液態(tài)奶樣品中β-內(nèi)酰胺酶的檢出限低于其他三類乳制品，而在杯碟法中每類乳制品測(cè)得的β-內(nèi)酰胺酶最低檢出限都要低于快速檢測(cè)法中對(duì)應(yīng)的測(cè)定值。

表2 不同乳制品在杯碟法中的β-內(nèi)酰胺酶最低檢出限Table 2 Detection limit ofβ-lactamase in different dairy product based on cylinder plate method

2.3 兩種方法對(duì)樣品的檢測(cè)

從市場(chǎng)上購(gòu)買不同品牌的液態(tài)奶、酸奶、奶粉、奶酪樣品以及數(shù)批原料奶，運(yùn)用快速檢測(cè)法和杯碟法分別對(duì)這些樣品進(jìn)行檢測(cè)。表3的檢測(cè)結(jié)果顯示，液態(tài)奶、酸奶、奶粉和奶酪樣品均未檢出β-內(nèi)酰胺酶，而50個(gè)原料奶樣品中有一個(gè)檢出β-內(nèi)酰胺酶呈陽(yáng)性，兩種檢測(cè)方法得出的結(jié)果完全一致，說(shuō)明兩種方法均能滿足實(shí)際樣品檢測(cè)的需要。

2.4 β-內(nèi)酰胺酶的耐久性實(shí)驗(yàn)

用液態(tài)奶配制濃度范圍為8.0×10-5～5.0×10-4U/mL的β-內(nèi)酰胺酶加標(biāo)樣液，于室溫下放置一周，期間每隔24h用快速檢測(cè)法對(duì)不同濃度加標(biāo)樣液中β-內(nèi)酰胺酶的殘留活性進(jìn)行檢測(cè)。從表4的檢測(cè)結(jié)果可以看出，加標(biāo)樣液放置2d后其β-內(nèi)酰胺酶活性有所下降，最低檢出限由1.0×10-4U/mL提高至2.0×10-4U/mL，但隨后放置至第7d為止，其最低檢出限仍與放置2d后的檢測(cè)結(jié)果相同，而有研究報(bào)道[12]也顯示β-內(nèi)酰胺酶放置4d后仍具有很強(qiáng)的抗生素降解能力，這表明存放時(shí)間對(duì)β-內(nèi)酰胺酶活性的影響并不大。

表3 快速檢測(cè)法和杯碟法對(duì)樣品的檢測(cè)結(jié)果Table 3 Detection results of dairy products by Charm detection method and cylinder plate method

表4 放置時(shí)間對(duì)β-內(nèi)酰胺酶活性的影響Table 4 Influence of storage time to the enzymatic activity ofβ-lactamase

2.5 β-內(nèi)酰胺酶的耐熱性實(shí)驗(yàn)

用液態(tài)奶配制濃度范圍為8.0×10-5～8.0×10-4U/mL的β-內(nèi)酰胺酶加標(biāo)樣液，模擬巴氏殺菌和保持滅菌的條件對(duì)加標(biāo)樣液進(jìn)行加熱處理，研究這些處理對(duì)β-內(nèi)酰胺酶活性的影響，試驗(yàn)的結(jié)果如表5所示。75℃加熱處理15s的巴氏殺菌方式并沒(méi)有對(duì)加標(biāo)樣液中β-內(nèi)酰胺酶的活性造成影響，而另外一種巴氏殺菌方式（65℃ 30min）則使β-內(nèi)酰胺酶的活性有所降低，導(dǎo)致加標(biāo)樣液中β-內(nèi)酰胺酶的最低檢出限由原來(lái)的1.0×10-4U/mL提高至4.0×10-4U/mL，這與Korycka等[13]的研究結(jié)果相吻合。保持滅菌（115℃，10min）的處理方式對(duì)β-內(nèi)酰胺酶的活性影響最大，經(jīng)過(guò)這種處理后，即使加標(biāo)樣液中β-內(nèi)酰胺酶的濃度高達(dá)8.0×10-4U/mL時(shí)也不能被檢測(cè)出含有β-內(nèi)酰胺酶。

表5 加熱處理對(duì)β-內(nèi)酰胺酶活性的影響Table 5 Influence of heating treatment to the enzymatic activity ofβ-lactamase

3 結(jié)論

3.1 本研究利用快速檢測(cè)法和杯碟法分別測(cè)定了不同乳制品中β-內(nèi)酰胺酶的最低檢出限。不同乳制品中β-內(nèi)酰胺酶在快速檢測(cè)法中的檢出限為1.5×10-4～1.6×10-3U/mL（U/g），在杯碟法中則為2.0×10-5～1.6×10-4U/mL（U/g），兩種方法對(duì)β-內(nèi)酰胺酶的最低檢出限均能滿足樣品檢測(cè)的需要，兩者在樣品檢測(cè)中的β-內(nèi)酰胺酶檢出率也相同。

3.2 快速檢測(cè)法操作簡(jiǎn)單，節(jié)省時(shí)間，無(wú)需大型設(shè)備儀器，對(duì)β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性均與杯碟法相當(dāng)，因此很適合在基層單位中作為檢測(cè)β-內(nèi)酰胺酶的主要手段。杯碟法對(duì)β-內(nèi)酰胺酶的檢出限雖然比快速檢測(cè)法稍低，但其耗時(shí)長(zhǎng)，操作復(fù)雜，對(duì)試驗(yàn)的要求嚴(yán)格，較難滿足快速檢測(cè)乳制品中β-內(nèi)酰胺酶的需要，可以作為快速檢測(cè)法檢測(cè)結(jié)果的確證方法。

3.3 β-內(nèi)酰胺酶的耐久性和耐熱性實(shí)驗(yàn)表明，乳制品的存放時(shí)間對(duì)β-內(nèi)酰胺酶的活性影響不大，但加熱殺菌工藝則較為明顯地降低了β-內(nèi)酰胺酶的活性，可能會(huì)降低β-內(nèi)酰胺酶在乳制品中的檢出率。由此可見，為了杜絕β-內(nèi)酰胺酶在乳制品中的非法添加使用，應(yīng)從原料奶的質(zhì)量安全進(jìn)行監(jiān)控，從而保障人民群眾喝上放心奶。

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