孟亮 葛華 蔣紅軍 趙東暉 車行素

血管重構（Vascular remodeling，VR）是血管為適應體內外環(huán)境變化而發(fā)生的形態(tài)結構和功能改變的動態(tài)反應過程，包括細胞增殖、遷移、凋亡和細胞基質的合成、降解及重排等一系列的動態(tài)變化，與高血壓、動脈粥樣硬化以及血管術后再狹窄等多種心血管疾病密切相關。缺血、缺氧和機械損傷等引起的血管平滑肌細胞損傷、凋亡和壞死是血管重構類疾病的常見病理改變[1]。在病理條件下，壞死的血管平滑肌細胞能夠分泌多種炎性因子，并刺激周圍正常細胞，引起細胞增殖。我們在前期研究中發(fā)現，壞死的血管平滑肌細胞上清液能夠顯著增強正常血管平滑肌細胞的增殖能力[2]，但機制不明確。本實驗擬采用壞死細胞培養(yǎng)上清液作為條件培養(yǎng)液，進一步探討壞死細胞培養(yǎng)上清液的促炎和促進細胞增殖的機制，以期為心血管疾病的恢復及治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞株與試劑

人主動脈平滑肌細胞（上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所）；IL-1、IL-1RA（Prospec 公司），MTT、DMSO（Sigma 公司），總 RNA提取試劑盒、TIAN Script cDNA第一鏈合成試劑盒（北京天根生化科技有限公司），細胞核細胞漿蛋白抽提試劑盒（碧云天公司），NF-kB抗體、IkB抗體（Santa Cruz公司），引物委托生工生物（上海）有限公司合成，其他試劑均為國產分析純。

1.2 細胞培養(yǎng)

將人主動脈平滑肌細胞接種于含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素的低糖DMEM培養(yǎng)液中，在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，細胞貼壁生長。2～3 d更換一次培養(yǎng)基，待細胞生長至80%～90%融合時進行傳代。

1.3 壞死細胞培養(yǎng)上清液的制備及實驗分組

按照文獻[2]的方法，將無血清無糖培養(yǎng)基通入5%CO2、10%H2、85%N2混合氣體飽和 15min， 即制成無血清無糖低氧溶液。將對數生長期的血管平滑肌細胞接種于此條件溶液后，置于含上述混合氣體的厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后離心收集細胞培養(yǎng)上清液，即為壞死血管平滑肌細胞上清液。實驗設置壞死上清干預組(NCS)、IL-1干預組(IL-1)、壞死上清與IL-1RA聯合干預組（NCS+IL-1RA）以及無血清低糖DMEM培養(yǎng)的對照組（Control）。

1.4 細胞增殖檢測

取對數生長期的血管平滑肌細胞以5000個/孔的濃度接種至96孔細胞培養(yǎng)板，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。待細胞貼壁后無血清同步化于G0期。換液為各組條件培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h。每孔加入20μL濃度為5 mg/mL的MTT，細胞培養(yǎng)箱中孵育4h，吸去上清，加入200μL DMSO溶解細胞形成的結晶。酶標儀上測定各組細胞在490 nm處的OD值，分析細胞增殖情況。

1.5 RT-PCR

培養(yǎng)48 h后收集各組細胞。TRIzol法提取總RNA，按照cDNA第一鏈合成試劑盒說明書中的方法進行反轉錄。以管家基因β-actin為內參，進行PCR反應，MCP-1的上、下游引物為：5'-CAATCAATGCCCCAGTCACCT-3'，5'-AATCCTGAACCCACTTCTGCTT-3'；擴增片段長度為177 bp。IL-6的上、下游引物序列分別為：5'-AATAACCACCCCT GACCCAAC-3'，5'-CCAGAAGAAGGAATGCCCATT-3'；擴增片段長度為198 bp。IL-8的上、下游引物序列為：5'-AGGAATTGAATGGGTTTGC-3'，5'-CTGTGAGGTAAGATGGTGGCTAA-3'；擴增片段長度為229 bp。β-actin的上、下游引物序列為：5'-ACGTTGACATC CGTAAAGAC-3'，5'-GAAGGTGGACAGTGAGGC-3’；擴增片段長度為200 bp。采用2×Taq PCR Master Mix試劑盒進行PCR反應，反應體系為：cDNA 模板 2μL，上、下游引物各1μL，2×Taq PCR Master-mix 10μL，ddH2O 補足總體積至20μL。 反應條件為：95 ℃預變性 5min，95 ℃變性20 sec；57℃退火 20 sec；72℃延伸 30 sec，共 30個循環(huán)，最后72℃延伸5min，反應結束后于1.5%瓊脂糖凝膠上進行電泳，利用凝膠成像系統將圖片掃描入電腦并進行灰度分析。

1.6 IL-6、MCP-1和IL-8表達檢測

培養(yǎng)48h后收集各組細胞的上清液，采用ELISA檢測各組IL-6、MCP-1和IL-8的表達。按照試劑盒說明書中的方法繪制標準曲線，根據各組樣品在450 nm處的吸光值計算IL-6、MCP-1和IL-8的含量，每個樣品重復3次。

1.7 Western blot

按試劑盒說明書抽提各組細胞的核蛋白及胞漿蛋白，BCA法定量蛋白。利用上樣緩沖液調平蛋白，100℃煮沸5min使蛋白變性。配置聚丙烯酰胺凝膠，進行SDS-PAGE。電泳結束后，電轉移至PVDF膜上。將PVDF膜置于5%脫脂奶粉中封閉，加入一抗后4℃孵育過夜，TTBS洗膜4次，加入稀釋的二抗后，37℃孵育45min。ECL底物發(fā)光法曝光膠片，并掃描入電腦，以β-actin為內參進行灰度分析。

2 結果

2.1 壞死細胞上清液對細胞增殖能力的影響

以OD值表示各組細胞的增殖能力，NCS組和IL-1組細胞增殖能力均顯著高于對照組（P<0.01），NCS+IL-1 β組細胞增殖能力顯著低于NCS組和IL-1 組，差異具有顯著性（P<0.01）（圖 1）。

圖1 細胞增殖能力的比較Fig.1 Comparison of cell proliferation

2.2 壞死細胞上清液對MCP-1、IL-6和IL-8 mRNA表達的影響

RT-PCR結果表明，NCS組和IL-1組MCP-1、IL-8、IL-6的表達均顯著高于對照組，差異具有統計學意義（P<0.05）。 NCS+IL-1組 MCP-1、IL-6和IL-8的表達均顯著低于NCS組和IL-1組，差異具有統計學意義（P<0.05）（圖 2）。

2.3 壞死細胞上清液對MCP-1、IL-6、IL-8的影響

ELISA檢測結果提示，各組MCP-1、IL-6和IL-8的分泌情況與mRNA的表達結果基本一致，即NCS組和IL-1組顯著高于對照組，差異具有統計學意義（P<0.05）。NCS+IL-1RA 組 MCP-1、IL-6和 IL-8的分泌顯著低于NCS組和IL-1組，差異具有統計學意義（P<0.05）（圖 3）。

2.4 壞死細胞上清液對NF-kB活性的影響

NCS組和IL-1組核蛋白中NF-kB的表達顯著高于對照組（P<0.05），NCS+IL-1RA組則顯著低于NCS組和IL-1組（P<0.05）。與對照組相比，NCS組和IL-1組的表達顯著降低（P<0.01），NCS+IL-1組顯著高于 NCS組和IL-1組（P<0.05）（圖 4）。

圖2 MCP-1、IL-6和IL-8 mRNA的表達Fig.2 mRNA expression of MCP-1,IL-6 and IL-8

圖3 MCP-1、IL-6和IL-8的表達Fig.3 Expression of MCP-1,IL-6 and IL-8

圖4 各組NF-kB的活性Fig.4 NF-kB activity

3 討論

正常生理條件下，血管平滑肌細胞的增殖和凋亡保持動態(tài)平衡，病理條件下內環(huán)境中某些因子的改變會導致血管平滑肌細胞的增殖失控，是臨床常見心血管疾病的主要病理基礎。血管平滑肌細胞存在兩種不同的表型，即收縮型和合成型。收縮型在神經及激素的影響下調節(jié)血管壁張力，維持組織的血流量；合成型血管平滑肌細胞能夠在血管壁的形成和損傷修復，以及生長因子的刺激下，進行分裂和增殖。在生長因子、細胞外基質、機械性作用力和細胞間的相互作用下，收縮型血管平滑肌細胞向合成型轉變，是血管平滑肌細胞病理性增殖的主要表現[3]。

IL-1調控多種炎癥因子和生長因子的表達，是冠狀動脈重構過程中主要的活性細胞因子之一[4]，在血管損傷后的新生內膜中表達增加，表明IL-1在新生內膜的形成過程中發(fā)揮著重要作用[5-6]。內皮細胞、平滑肌細胞和巨噬細胞分泌IL-1β，進一步誘導了細胞因子的表達，激活細胞黏附和增殖能力，是動脈粥樣硬化和術后再狹窄等病變的關鍵[7]，IL-1β基因敲除小鼠，動脈粥樣硬化癥狀明顯減輕[8]，表明IL-1β在重塑類血管病變中發(fā)揮著重要作用。壞死的血管平滑肌細胞能夠釋放IL-1α和β，并促進周圍細胞產生促炎因子[9]。本實驗中，壞死細胞上清液和IL-1都顯著促進正常細胞增殖和炎性因子的表達；而在壞死上清中加入IL-1RA，則明顯抑制了其促增殖和促炎性分子分泌的作用。據此推測，壞死的血管平滑肌細胞可能釋放大量IL-1，進而促進了周圍正常細胞的增殖以及炎性因子的表達。

單核細胞趨化蛋白-1（Monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）和IL-8是主要作用于單核細胞和中性粒細胞的趨化因子，分別促進單核細胞和中性粒細胞的遷移和轉化，能夠損傷內皮細胞，分泌炎性因子，加劇血管壁內的炎癥反應，在動脈粥樣硬化等血管疾病的發(fā)生和發(fā)展中起著關鍵作用[10-11]。本實驗中，NCS組和 IL-1組MCP-1、IL-6和IL-8的表達增加，而壞死上清中加入IL-1RA能夠降低其表達，提示壞死細胞可能通過釋放IL-1而加重周圍正常細胞的炎性反應。

NF-kB是炎癥反應的核心調節(jié)因子，血管炎癥反應過程中的許多基因都是受NF-kB激活的。NF-kB可介導細胞產生各種細胞因子、黏附分子和生長因子，影響細胞周期和凋亡，促使平滑肌細胞增生并向內膜下遷移[12]。本實驗中，NCS組和IL-1組NF-kB活性增強，而NCS中加入IL-1RA顯著抑制了NF-kB的活性，表明壞死細胞可能通過釋放IL-1而激活NF-kB，進一步誘導了多種細胞因子的釋放。

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