江 濤，徐 涵，康 凱，柳先麗，舒曉亮，謝良民

(1.廣西中醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院營養(yǎng)科，廣西南寧 530023;2.同濟大學附屬東方醫(yī)院營養(yǎng)科，上海 200120)

腸道微生態(tài)改變可引起腸黏膜炎性反應，腸黏膜炎性反應后進一步損傷腸黏膜，而細菌和內(nèi)毒素易通過損傷的腸黏膜抵達黏膜下層，進一步加劇炎癥反應，嚴重可誘發(fā)多器官功能障礙［1］。雙歧桿菌是人體腸道中最重要的益生菌，對維持腸道微生態(tài)平衡和腸黏膜屏障功能具有重要作用，雙歧桿菌黏附素由多結構和功能的蛋白質(zhì)、短肽、糖蛋白、糖脂和多糖分子構成，這些分子分布在雙歧桿菌的細胞壁、鞭毛、莢膜和小絲狀體，黏附素不但可以介導母菌對靶細胞的黏著，激發(fā)黏附的細胞信號轉導，而且可以通過與致病菌競爭腸道黏膜表面特定的結合位點，抑制致病菌與腸道黏膜的結合。應激反應時雙歧桿菌有可能通過黏附素的作用，減輕腸黏膜炎性反應和損傷，本研究目的在于探討應激條件下，雙歧桿菌黏附素對腸黏膜炎性反應的影響。

1 材料與方法

1.1 動物應激模型

健康雄性 Sprague-Dawley大鼠48只，平均體質(zhì)量為(155±17)g，經(jīng)適應性喂養(yǎng)3 d后隨機分為應激組和應激+黏附素組，每組24只，將應激組和應激+黏附素組大鼠置于3～6 cm半徑的鐵質(zhì)圓桶狀小艙內(nèi)，單籠飼養(yǎng)，限制活動，每天接受6 h束縛應激，持續(xù)21 d，造成大鼠應激模型。

1.2 實驗動物分組

將應激模型大鼠按隨機數(shù)分組法分為應激組和應激+黏附素組進入實驗期，每組24只，大鼠在潔凈的動物室，不銹鋼籠單只飼養(yǎng)，應激+黏附素組大鼠進食能全素(紐迪希亞公司)+黏附素5 mg/kg灌胃，應激組大鼠進食能全素+5 mg/kg生理鹽水，兩組大鼠每日給予相同熱量、氮量熱量(125.4 kJ/kg，氮量0.2 g/kg)的腸內(nèi)營養(yǎng)(能全素，紐迪希亞公司)供給，每只大鼠需要的腸內(nèi)營養(yǎng)一次性放入單個不銹鋼杯(不銹鋼籠配帶)供自由進食，黏附素和等量生理鹽水在給大鼠喂飼腸內(nèi)營養(yǎng)前一次性灌胃，記錄進食量和體質(zhì)量變化，在造模前(正常參數(shù))、造模后(造成應激模型后)、實驗第3天和實驗第8天，分別選取6只大鼠在麻醉下，股動脈采血5 ml在 3 000 r/min，下離心 10 min，取血清，置于－80℃冰箱冷凍保存待測，取出小腸末端距回盲部10 cm的小腸組織用于病理分析和腸黏膜炎性因子含量的檢測。

1.3 雙歧桿菌黏附素的提取及純化

將青春型雙歧桿菌1 027株接種于硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基，置厭氧培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)48 h，在液體培養(yǎng)條件下，雙歧桿菌的黏附素是一種分泌性蛋白質(zhì)，分布于細菌耗盡培養(yǎng)液的上清部分，離心收集培養(yǎng)液上清部分，經(jīng)300 g/L硫酸銨沉淀，在4℃下8 000 r/min離心 30 min收集沉淀物，沉淀經(jīng)Superdex75柱凝膠過濾和Q-SepharoseFF離子交換色譜純化，收集第一峰，其相對分子質(zhì)量為16 000 Da，凍干保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 檢測指標

檢測兩組大鼠造模前、造模后、實驗第3天和第8 天血漿IL-6、IL-10、TNF-α 和IFN-γ 水平。用酶聯(lián)免疫吸附法檢測 IL-6、IL-10、TNF-α 和 IFN-γ(ELISA 試劑盒，RnD Ltd.USA)。

腸黏膜 IL-6、IL-10、TNF-α 和 IFN-γ 含量測定。取空腸近端2 cm小腸，用生理鹽水沖洗，用手術刀刮取200～300 mg的腸黏膜制成勻漿，將得到的組織勻漿與9倍體積的生理鹽水稀釋，然后在800×g下離心分離10 min得到上清液，檢測組織勻漿上清液中的 IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ(ELISA 試劑盒，RnD Ltd.USA)含量，結果表示為pg/g濕重。

1.5 統(tǒng)計學分析

2 結 果

2.1 腸黏膜和血漿IL-6和IL-10水平的變化

與造模前比較，造模后應激組和應激+黏附素組腸黏膜和大鼠血漿IL-6水平明顯升高(P=0.002)，而 IL-10 差異無統(tǒng)計學意義(P=0.073，0.085);實驗第3天和第8天，應激組大鼠腸黏膜和血漿IL-6水平明顯高于造模前(P=0.001)，血漿IL-10水平差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，而應激+黏附素組大鼠腸黏膜和血漿IL-6和IL-10水平與造模前相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。與造模后和應激組比較，實驗第3天和第8天，應激+黏附素組大鼠腸黏膜和血漿IL-6水平明顯降低(P＜0.05)，而 IL-10水平明顯升高(P＜0.05)，而應激組IL-6和IL-10濃度差異與造模后比較，無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)，見表1、2。

表1 大鼠血漿炎性因子水平變化Tab.1 Comparison of inflammation factor levels in rat blood and intestinal mucosal between two groups(n=24)

2.2 腸黏膜和血漿TNF-α和IFN-γ水平的變化

與造模前比較，造模后應激組和應激+黏附素組腸黏膜和大鼠血漿TNF-α和IFN-γ濃度明顯升高(P均 =0.000)，而 IL-10差異無統(tǒng)計學意義(P=0.064，0.093);實驗第 3 天和第 8 天，應激組大鼠腸黏膜和血漿IFN-γ和TNF-α濃度明顯高于造模前(P均=0.000)，而應激 +黏附素組大鼠腸黏膜和血漿TNF-α和IFN-γ水平與造模前相比差異無統(tǒng)計學意義(P均 ＞0.05)。與造模后和應激組比較，實驗第3天和第8天，應激+黏附素組大鼠腸黏膜和血漿 TNF-α和IFN-γ水平明顯降低(P 均＜0.05)，而應激組TNF-α和IFN-γ濃度差異與造模后比較無統(tǒng)計學意義(P 均 ＞0.05)，見表 2。

3 討 論

腸黏膜在保護機體免受食物抗原、微生物的損害、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定起著重要作用［2］。應激條件下腸黏膜受損，腸源性炎性介質(zhì)和細胞因子釋放增加，嚴重時可引起炎癥反應綜合征［4］。IL-6、TNF-α、IFN-γ 是一組由單核巨噬細胞、內(nèi)皮細胞產(chǎn)生的細胞因子，這些細胞因子在腸黏膜應激后大量釋放，并隨血流在局部或作用于遠端組織，進一步加劇炎性反應和腸黏膜損傷［3］。研究表明，雙歧桿菌對受損的腸黏膜有修復的作用，可降低 TNF-α 和 IFN-γ在腸黏膜的分泌［4］。本實驗結果顯示，應激組大鼠腸黏膜和血漿IL-6、TNF-α和IFN-γ水平明顯高于造模前，而應激+黏附素組腸黏膜和血漿 IL-6、TNF-α和 IFN-γ水平明顯低于造模后和應激組，提示應激導致腸黏膜和血液炎性反應明顯加劇，給予雙歧桿菌黏附素炎癥反應明顯緩解，這可能是黏附素抑制了細胞因子的表達及其介導的炎性反應。IL-10是具有抗炎癥反應的白細胞介素，通過抑制T細胞經(jīng)腸道微生物刺激分泌的促炎癥反應物質(zhì)如IL-6、TNF-α 和 IFN-γ［5］。雙歧桿菌還可刺激腸道細胞產(chǎn)生IL-10，實現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)［6］，本實驗結果顯示應激+黏附素組IL-10水平高于應激組和造模后，表明黏附素通過刺激大鼠IL-10的合成或分泌，從而下調(diào)炎性反應。本實驗中腸黏膜和血漿IL-6、TNF-α、IL-10水平升高或降低是相似的，表明應激狀態(tài)的大鼠，腸黏膜和血液的炎性反應水平具有一致性。

應激條件下，雙歧桿菌黏附素可調(diào)節(jié)炎性介質(zhì)和細胞因子的釋放，減輕炎癥反應，修復損傷的腸黏膜，對腸黏膜具有保護功能。

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