楊曉暉，吳桐，左軍

(1．哈爾濱譽(yù)欣醫(yī)藥科技有限公司，黑龍江 哈爾濱 150086;2．黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

苦參栓的主要成分為苦參總堿，具有消炎、抑制細(xì)胞免疫和體液免疫的作用。采用苦參栓陰道給藥能加速糜爛面愈合，同時(shí)使宮頸分泌物減少，使創(chuàng)面修復(fù)及陰道流液時(shí)間明顯縮短。

其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為國家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS3－B－0094－89，其中含量測定采用滴定法，但是經(jīng)過多次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)所測得值很小，認(rèn)為是方法本身存在問題，無法檢測本品種，所以擬采用準(zhǔn)確度較高的高效液相色譜法進(jìn)行本品的含量測定。本實(shí)驗(yàn)對此方法進(jìn)行驗(yàn)證。

1 材料

1．1 儀器與試劑

高效液相色譜儀(安捷倫1260型);賽多利斯BP211D分析天平;色譜柱(BDS，大連依利特，C18，250mm ×4．6mm，5μm);乙腈為色譜純;水為重蒸水;其余試劑均為分析純。

1．2 試藥 苦參栓(陜西摩美得制藥有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2．1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以0．2%磷酸－三乙胺－乙腈(98∶0．2∶2)為流動(dòng)相;檢測波長為 210nm。理論板數(shù)按氧化苦參堿峰計(jì)算應(yīng)不低于2000。

2．2 對照品溶液的制備 精密稱取苦參堿對照品、氧化苦參堿對照適量，分別加流動(dòng)相使溶解，制成每1ml含苦參堿0．01mg，氧化苦參堿0．04mg的溶液，即得。

2．3 供試品溶液的制備 取本品10粒，切碎，混合均勻，精密稱定0．2g，置25ml容量瓶中，加甲醇適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，置冰水浴中30min使基質(zhì)析出，濾過，放置室溫，精密量取續(xù)濾液1ml，加甲醇至15ml，混勻，通過中性氧化鋁柱(100～200目，5g，內(nèi)徑1cm)，用甲醇30ml洗脫，收集洗脫液，80℃水浴蒸干，殘?jiān)恿鲃?dòng)相適量使溶解，并轉(zhuǎn)移至10ml量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得。

2．4 測定法分別精密吸取上述對照品溶液與供試品溶液各20μl，注入液相色譜儀，測定，記錄色譜圖，按照外標(biāo)法以峰面積計(jì)算苦參堿和氧化苦參堿含量的總和，即得。

3 方法學(xué)驗(yàn)證

3．1 專屬性試驗(yàn)

按照處方比例制備不加苦參總堿原料的空白陰性樣品，按上述含量測定方法進(jìn)行操作，在上述色譜條件下進(jìn)行測定。在該系統(tǒng)下苦參峰、氧化苦參堿的出峰位置上陰性樣品均沒有出現(xiàn)色譜峰，結(jié)果表明，本方法中，空白基質(zhì)對含量的測定無干擾。

3．2 線性試驗(yàn)

3．2．1 苦參堿的線性試驗(yàn)

精密稱取苦參堿對照品約6mg，置10ml容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，再取1ml置25ml容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液，分別取0．5ml、1ml、3ml、5ml、7ml置 10ml容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，制備成苦參堿對照品溶液，分別吸取上述5種溶液及貯備液各20μl注入高效液相色譜儀中，照高效液相色譜法(《中國藥典》2010年版一部附錄ⅥD)測定，以苦參堿的質(zhì)量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程:Y=17095X－27.503，r=0．9999，苦參堿在 0．02 ～0．49μg 范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。結(jié)果見表1。

表1 苦參堿線性試驗(yàn)結(jié)果

3．2．2 氧化苦參堿的線性試驗(yàn)

精密稱取氧化苦參堿對照品約10mg，置5ml容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，再取1ml置25ml容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液，分別取 1ml、3ml、5ml、7ml置 10ml容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，制備成氧化苦參堿對照品溶液，分別吸取上述4種溶液及貯備液各20μl注入高效液相色譜儀中，照高效液相色譜法(《中國藥典》2010年版一部附錄ⅥD)測定，以氧化苦參堿的質(zhì)量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程:Y=14945X－6．5856，r=1．0，氧化苦參堿在 0．16 ～1．64μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。結(jié)果見表2。

表2 氧化苦參堿線性試驗(yàn)結(jié)果

3．3 定量限試驗(yàn)

分別取已知濃度的苦參堿和氧化苦參堿對照品溶液用流動(dòng)相進(jìn)行一系列的稀釋，精密吸取各稀釋液20μl注入液相色譜儀，以信噪比10∶1的濃度為定量限度，測得苦參堿的定量限為3．11ng，氧化苦參堿的定量限為 9．07ng。

3．4 回收率試驗(yàn)

取苦參堿對照品5mg，置100ml容量品中，加甲醇稀釋至刻度，作為苦參堿加樣對照品母液。取氧化苦參堿對照品5mg，置25ml容量品中，加甲醇稀釋至刻度，作為氧化苦參堿加樣對照品母液。精密稱取已知含量的樣品(陜西摩美得制藥有限公司，苦參堿含量10．75mg/g，氧化苦參堿含量 50．41mg/g)0．1g，共 9份，置25ml容量瓶中加甲醇適量使溶解，并用甲醇稀釋至刻度，搖勻。至冰水浴中冷卻30min使基質(zhì)析出，濾過，放置室溫，精密量取續(xù)濾液1ml，分別向其中加入苦參堿加樣對照品母液 0．8ml、1．0ml、1．2ml，再向其中加入氧化苦參堿加樣對照品母液0．8ml、1.0ml、1．0ml，分別制備成供試品溶液，使其濃度為正常量的80%、100%、120%，然后分別加甲醇至15ml，混勻，通過中性氧化鋁柱(100 ～200 目，5．0g，內(nèi)徑1cm)，用甲醇30ml洗脫，收集洗脫液，80℃水浴蒸干，殘?jiān)恿鲃?dòng)相適量使溶解，并轉(zhuǎn)移至10ml量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，濾過，得續(xù)濾液，照高效液相色譜法(《中國藥典》2005年版一部附錄Ⅵ D)測定。并按照以下公式計(jì)算回收率。

結(jié)果:苦參堿平均回收率為 98．59%，RSD為1.6% ＜2．0%，氧化苦參堿平均回收率為99．17%，RSD為1．5% ＜2．0%，說明本方法測定樣品中苦參堿、氧化苦參堿含量的準(zhǔn)確度良好。

3．5 中間精密度試驗(yàn)

不同分析人員不同時(shí)間測定同一批樣品。結(jié)果:不同分析人員之間的RSD為0．47%，小于2．0%，說明本方法的精密度良好。

3．6 重復(fù)性試驗(yàn)

分別精密稱取同一批樣品6份，按樣品含量測定方法測定，結(jié)果:平均二者含量總和為93．88mg/粒，RSD為0．47%，說明本方法的重復(fù)性良好。

3．7 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

取樣品按照制備方法制備成供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12h 進(jìn)行測定，考察供試品溶液主峰面積的變化情況。結(jié)果，12h內(nèi)主峰面積的RDS均小于2．0%，說明樣品溶液在10h內(nèi)穩(wěn)定。

3．8 樣品檢測

分別取樣品按照上述方法進(jìn)行測定，結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測定

4 討論

本法采用HPLC法測定苦參栓中的含量，方法準(zhǔn)確、方便、快捷，提高了苦參栓的質(zhì)量控制方法，有利于栓劑在生產(chǎn)中的質(zhì)量控制，提高產(chǎn)品的質(zhì)量穩(wěn)定性。