杠柳苷對急性淋巴細(xì)胞白血病作用機(jī)制研究

楊東光，周晉，王振坤，葉向梅，李洋，王洪玲，曹峰林

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中心血液實驗室，黑龍江 哈爾濱 150081)

香加皮(cortex periplocae)為蘿摩科(A sclepiadaceae)植物杠柳(Periploca Sepium Bunge)的根皮［1］，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》。主產(chǎn)于東北和華北地區(qū)，含有甾醇、甙類、酯類等多種化學(xué)成分［2－3］?！吨腥A人民共和國藥典》記載，香加皮主要功能為祛風(fēng)濕、強(qiáng)筋骨，常用于風(fēng)寒濕痹、腰膝酸軟、心悸氣短、下肢浮腫的治療。香加皮提取物杠柳苷(Periplocin from cortex periplocae，CPP)是從香加皮正丁醇萃取純化得到的抗腫瘤單體化合物［4］，又名杠柳毒苷、蘿蘑毒苷、五加皮苷G等，已經(jīng)有研究報道對多種實體腫瘤細(xì)胞株增殖具有較強(qiáng)的抑制作用，但其對白血病細(xì)胞株的療效及機(jī)制尚未見報道。CPP的化學(xué)結(jié)構(gòu)為C36H56O13，屬強(qiáng)心苷類［5］化合物，近年來的研究發(fā)現(xiàn)，這類藥物具有顯著和靶向性的抗腫瘤效應(yīng)［6］。本實驗探討CPP對人類急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)細(xì)胞株Jurkat是否具有抑制作用，并從誘導(dǎo)凋亡、抑制HIF－1α和糖酵解三方面探討CPP對ALL的作用機(jī)制。

1 實驗材料與方法

1．1 細(xì)胞株與藥物

人類ALL細(xì)胞株Jurkat使用含10%胎牛血清(杭州四季青)和濃度為100 IU/M青鏈霉素(Invitrogen)的1640培養(yǎng)基中(Gibco)，置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中長期培養(yǎng)。CPP由華北制藥廠提供。

1．2 CASY快速細(xì)胞計數(shù)法評估CPP對各細(xì)胞的敏感性

取對數(shù)生長期的Jurkat，以5×104個/孔濃度將細(xì)胞懸液接種于6孔培養(yǎng)板，每孔接種950μl懸液，分別加入50μl CPP，終濃度為0．05μM。并分別設(shè)置空白對照組，空白對照組加入等體積完全培養(yǎng)基，置于37℃飽和濕度5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)72h，分別于24、48、72h收集細(xì)胞，無菌PBS洗3次。CASY快速細(xì)胞計數(shù)法進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)及細(xì)胞存活率檢測，評估CPP對各組細(xì)胞的抑制作用。

1．3 Annexin－V/PI雙染檢測細(xì)胞凋亡

收集經(jīng)過不同濃度CPP處理24h、48h和72h的Jurkat細(xì)胞，用預(yù)冷的1×PBS洗2次。每管用1×binding buffer把細(xì)胞調(diào)整成1×106個/ml濃度，取100μl加入5μl的AnnexinV－FITC溶液進(jìn)行染色，輕輕混勻，再加入5μl的PI溶液染色。雙染后在室溫避光靜止15min后每管再加入1×binding buffer 400μl，在1h內(nèi)上流式細(xì)胞儀進(jìn)行凋亡檢測。每份樣品同設(shè)3份，求平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。

1．4 實時定量PCR

采用TRIzol分別對細(xì)胞株的總RNA進(jìn)行抽提，然后逆轉(zhuǎn)mRNA至cDNA。應(yīng)用primer Express 2．0軟件(ABI公司)設(shè)計qRT－PCR引物，并交由上海生工合成，引物序列見表1。應(yīng)用 FastStart Universal SYBR Green PCR Master(羅氏)試劑盒，依據(jù)上海生工提供的退火溫度設(shè)定反應(yīng)條件，進(jìn)行目的基因擴(kuò)增。所有對目的基因的檢測，均重復(fù)3次，取平均值。使用2－△△CT計算處理前后基因變化的比值。

表1 Hh信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路基因引物

1．5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

應(yīng)用CASY快速細(xì)胞計數(shù)法對50nM的CPP連續(xù)作用72h的Jurkat細(xì)胞生長進(jìn)行了評估。盡管CPP作用后，Jurkat細(xì)胞依然具有生長的趨勢，但與對照組相比，其生長仍然顯著受到抑制，如圖1所示。

圖1 Jurkat細(xì)胞在CPP 50nM作用下生長曲線

采用濃度為 0、12．5nM、25nM、50nM、100nM 的CPP連續(xù)應(yīng)用于Jurkat細(xì)胞48h，采用方差分析對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計。實驗結(jié)果表明，CPP誘導(dǎo)Jurkat凋亡呈劑量依賴性(F=147．18，P ＜0．001)，其凋亡率隨著劑量的增加明顯增加，如圖2所示。

圖2 不同濃度杠柳苷誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞調(diào)亡

經(jīng)不同濃度的CPP連續(xù)作用于Jurkat細(xì)胞株12h后，本實驗對標(biāo)本的目的基因進(jìn)行了有效擴(kuò)增。同時，熔解曲線表明，qRT－PCR的擴(kuò)增特異性強(qiáng)，無明顯的引物二聚體或其他非特異性雜帶出現(xiàn)(見圖3)。結(jié)果表明，CPP對糖酵解相關(guān)基因的表達(dá)具有顯著抑制作用，該抑制作用呈劑量依賴性，即隨著CPP濃度的增大，各基因的表達(dá)逐漸下降(P＜0．05)(見圖4)。

圖3 目的基因的溶解曲線與擴(kuò)增曲線

圖4 不同濃度杠柳苷抑制糖酵解相關(guān)基因表達(dá)

3 討論

已有研究顯示，香加皮提取物對體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞有顯著的細(xì)胞毒性，證實香加皮提取物通過誘導(dǎo)人乳腺癌MCF7細(xì)胞、人胃癌BGC－823細(xì)胞凋亡而產(chǎn)生明顯的增殖抑制活性，作用強(qiáng)度呈濃度和時間依賴性。杠柳苷(CPP)是從香加皮正丁醇萃取純化得到的抗腫瘤單體化合物，已經(jīng)有研究報道［7－10］，CPP對食管癌、結(jié)腸癌、胃癌、肝癌、乳腺癌多種實體腫瘤細(xì)胞株增殖具有較強(qiáng)的抑制作用，并能顯著誘導(dǎo)上述腫瘤細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯。

鑒于CPP對白血病細(xì)胞的作用效果及其機(jī)制尚不清楚，本研究首先應(yīng)用casy快速細(xì)胞計數(shù)法檢測CPP是否對ALL細(xì)胞株Jurkat具有抑制作用。本實驗發(fā)現(xiàn)，Jurkat是CPP作用較為敏感的白血病細(xì)胞株之一。為了驗證CPP抗急性淋巴細(xì)胞白血病是否通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡起作用，本實驗采用不同濃度的CPP連續(xù)作用急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株48h，并采用流式細(xì)胞術(shù)監(jiān)測細(xì)胞的凋亡率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CPP可誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡，凋亡率隨CPP藥物濃度增加而增大，即CPP誘導(dǎo)急性淋巴細(xì)胞白血病凋亡劑量呈依賴性。實驗結(jié)果證明，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是CPP對抗急性淋巴細(xì)胞白血病的機(jī)制之一。

ALL是兒童急性白血病的主要類型，約占其中的80% ～85%，成人ALL亦較多見。ALL細(xì)胞對化療藥物耐藥，尤其是對糖皮質(zhì)激素(GC)耐藥是導(dǎo)致兒童和成人ALL療效和預(yù)后差異的主要原因。最近的研究發(fā)現(xiàn)，糖酵解的異常活化是急性淋巴細(xì)胞白血病耐藥的一個重要原因。糖皮質(zhì)激素耐藥細(xì)胞的糖消耗量顯著增加，而抑制糖酵解能增加耐藥的急性淋巴細(xì)胞白血病患者的白血病細(xì)胞對糖皮質(zhì)激素的敏感性。以糖酵解為靶向?qū)⒂型{(diào)節(jié)急性淋巴細(xì)胞白血病糖皮質(zhì)激素耐藥。

HIF－1α是與惡性腫瘤生長進(jìn)程密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，它以異源二聚體的形成存在?？赏ㄟ^增強(qiáng)血管新生，促進(jìn)細(xì)胞能量代謝，抗細(xì)胞凋亡等機(jī)制在腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移以及腫瘤治療耐藥等方面發(fā)揮重要作用。與正常組織相比，惡性腫瘤對葡萄糖的攝取及代謝均處于增高狀態(tài)，糖代謝增加是許多惡性腫瘤組織的顯著性特征，依賴于腫瘤自身調(diào)節(jié)機(jī)制，以滿足腫瘤快速生長的需要。Glutl是葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的成員之一，是哺乳動物細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖的載體。Glutl在缺氧狀態(tài)下表達(dá)明顯增加，與HIF－1α一起作為內(nèi)源性缺氧標(biāo)記物來檢測腫瘤內(nèi)的缺氧情況，成為研究惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的重要指標(biāo)之一。已糖激酶(Hexokinase，HK)是糖酵解的第一個限速酶，它能催化葡萄糖磷酸化生成6－磷酸葡萄糖。若抑制該酶的活性，則抑制了腫瘤細(xì)胞的糖酵解使腫瘤細(xì)胞不能獲得足夠的磷酸葡萄糖。在缺氧條件下，ALL細(xì)胞株Jurkat的HIF－1α mRNA和蛋白表達(dá)均顯著增強(qiáng)，從而誘發(fā)HIF－1α一系列下游基因的激活，使該白血病細(xì)胞獲得生存優(yōu)勢。50nM CPP能顯著抑制HIF－1α下游的靶基因，糖酵解的關(guān)鍵酶－已糖激酶II以及Glutl的mRNA表達(dá)。我們的實驗結(jié)果證實，CPP能誘導(dǎo)急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞凋亡，并可能是通過HIF－1α－HKII這條通路抑制急性淋巴細(xì)胞白血病的糖酵解途徑，殺傷白血病細(xì)胞。

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