黃 珂 陳艷紅

近年來，在兒童腫瘤中應用以細胞因子誘導殺傷(cytokine-induced killer，CIK) 細胞輸注為主導的細胞過繼免疫治療已經(jīng)逐漸受到重視。與CIK細胞殺傷激活關(guān)系密切的細胞間黏附分子-1( intercellularadhesionmolecule-1，ICAM-1，CD54)的研究越來越得到關(guān)注。腫瘤細胞表達的 ICAM-1與 CIK 細胞上表達的淋巴細胞功能相關(guān)抗原-1(lymphocyte function associated antigen-1，LFA-1) 相互作用是 CIK 細胞殺傷、識別腫瘤細胞的主要機制。本研究擬檢測兒童腫瘤細胞 ICAM-1 表達水平并分析其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選擇我院2008年1月1日-2012 年12 月31日收治的兒童腫瘤患者共85例，分為實體瘤和非實體瘤(白血病)。實體瘤35例，其中淋巴瘤10 例，肝母細胞瘤2例，神經(jīng)母細胞瘤4例，橫紋肌肉瘤2 例，尤文氏肉瘤4例，原始神經(jīng)胚層腫瘤4 例，腎母細胞瘤9 例。非實體瘤指急性白血病(acute leukemia，AL)50例，包括急性淋巴細胞白血病(acutelymphocytic leukemia，ALL) 20 例和急性髓系白血病(acute myelocytic leukemia，AML) 30 例。AML中部分分化性粒細胞性白血病(M1)、分化性粒細胞性白血病(M2)、早幼粒細胞性白血病(M3) 型共 18 例，粒單細胞性白血病(M4)、單核細胞性白血病(M5)型共12 例。所有患兒均進行骨髓象形態(tài)學和細胞化學、細胞免疫分型檢測和確診。選取健康移植供者骨髓20 例作為對照組。

1.2 研究方法

1.2.1 檢測方法 ①實體瘤：手術(shù)切取患兒腫瘤實體組織制取的石蠟切片，采用免疫細胞化學方法檢測切片組織的 ICAM-1 表達水平。組織切片常規(guī)二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水，放入新配制的 3% 過氧化氫甲醇 37℃孵育10 min，阻斷滅活內(nèi)源性過氧化物酶，蒸餾水洗 3 次。微波修復抗原，滴加血清封閉液 20 min。滴加 ICAM-1 一抗4℃冰箱孵育 60 min，用 PBS 沖洗3～5 min，滴加生物素標志的 IgG 二抗37℃孵育20 min，滴加SABC(鏈霉卵白素+ 辣根酶標記生物素) 20 min，DAB染色液 10 min顯色，蘇木精染色液染色 5 min，常規(guī)進行脫水、透明、干燥、封片。②白血?。喝×魇郊毎麅x(FACSCalibur)專用試管 1 支，加入多甲藻黃素-葉綠素-蛋白質(zhì)復合物(Percp)標記的 CD45 單克隆抗體10 μl/孔，再加入藻紅蛋白(PE )標記 ICAM-1 單克隆抗體10 μl/孔，加入 EDTA-K2抗凝的骨髓 50 μl/孔，低速渦流混勻，37℃避光反應 20 min。加入BD FACS lysing solution溶血素 1 ml，混勻，37℃避光保存10 min。37℃條件下取180 g 離心 5 min，棄上清液，再加入 PBS 2 ml，均勻混合后取180 g 離心 5 min，棄去上清液。加入 1% 多聚甲醛 0.5 ml，均勻混合，在1～4 ℃ 保存，待檢測。FACSCalibur 流式細胞儀的開機、關(guān)機等操作嚴格按照說明書進行。開機后啟動 FACSComp 軟件，標準熒光微球(calibration beads)校正儀器后，以 CellQuest Pro數(shù)據(jù)獲取分析軟件獲取數(shù)據(jù)。每管檢測10 000 個細胞，采用 CD45 / SSC 設(shè)門，分析白血病細胞群中 ICAM-1 陽性表達水平。③對照組：分別取正常骨髓淋巴細胞、粒細胞及單核細胞檢測的 ICAM-1 表達水平。

1.2.2 判斷標準 根據(jù)顯微鏡下觀察到的棕黃色陽性細胞數(shù)進行判斷，陰性(-):未觀察到棕黃色陽性細胞；出現(xiàn)棕黃色陽性細胞本研究均定義為陽性。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件包對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。ICAM-1(CD54)表達采用百分數(shù)表示，應用描述性統(tǒng)計方法分析?；純汉驼和褐蠭CAM-1(CD54)表達水平的比較采用列聯(lián)表資料χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 ICAM-1(CD54)在患兒腫瘤組織中的表達

肝母細胞瘤ICAM-1檢出100.0%(2/2)，其他檢出ICAM-1的腫瘤有淋巴瘤、橫紋肌肉瘤、神經(jīng)母細胞瘤、尤文氏肉瘤，而腎母細胞瘤和原始神經(jīng)外胚層腫瘤未檢出ICAM-1。急性淋巴細胞白血病和急性髓系白血病檢出率分別為50.0%(10/20)和53.3%(16/30)。見表1。

表1 兒童腫瘤組織中ICAM-1(CD54)的表達水平

2.2 白血病患兒和正常兒童ICAM-1表達的比較

ALL 患兒骨髓細胞的 ICAM-1 陽性表達率為50.0%(10/20)，與對照組骨髓中淋巴細胞上 ICAM-1 陽性表達率(65.0%)比較無顯著差異，χ2=0.921，P=0.337。AML ( M1、M2 和 M3) 患兒骨髓細胞的 ICAM-1 陽性表達率為66.7% (12/18)，顯著高于對照組骨髓中粒細胞上 ICAM-1 的陽性表達率(10.0%)(χ2=15.292，P=0.000);AML ( M4、M5) 患兒骨髓細胞的 ICAM-1 陽性表達率為 33.3%(4/12)，顯著低于正常對照組骨髓中單核細胞上 ICAM-1 的陽性表達率(75.0%)(χ2=5.398，P=0.020)。

3 討論

細胞間黏附分子(ICAM-1)屬細胞黏附分子免疫球蛋白超家族[1]，是重要的炎性細胞因子，在炎癥發(fā)生與發(fā)展中起著重要作用。當組織發(fā)生炎癥反應時，內(nèi)皮細胞受侵襲時其表面的ICAM-1經(jīng)活化后可與白細胞表面的αLβ2及巨噬細胞表面的αMβ2相結(jié)合，使白細胞固著于炎癥部位的脈管內(nèi)皮，進而分泌水解酶而穿出脈管壁，促使病變的擴散。目前ICAM-1在腫瘤細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移及機體抗免疫功能對抗腫瘤的作用中已引起相關(guān)領(lǐng)域的廣泛重視。研究認為，兒童白血病患者中ICAM-1表達發(fā)生異常改變，與白血病的發(fā)生、發(fā)展及預后情況有密切聯(lián)系。ICAM-1的表達異常通過細胞毒性T細胞、NK殺傷細胞作用，ICAM-1依賴的主要組織相容性復合體類抗原免疫識別的影響而發(fā)揮作用。

機體在抗腫瘤免疫中起主要作用的是細胞免疫，ICAM-1與其配體抗淋巴細胞功能相關(guān)抗原-1( LFA-1) 結(jié)合后，主要通過激活 T 細胞、促使B淋巴細胞的分化、增強CIK細胞的腫瘤殺傷作用。CIK 細胞能同時表達CD3+和CD56+膜蛋白分子，具有T淋巴細胞強大的抗瘤活性和NK細胞的非MHC限制性殺瘤特點，殺傷活性可以達到 84.7%，比NK、LAK 細胞抗腫瘤作用更強[2]。CIK細胞作用機理是通過不同的機制識別腫瘤細胞，釋放顆粒酶/穿孔素等毒性顆粒，導致腫瘤細胞裂解[3]。CIK細胞在培養(yǎng)過程中表達FasL(Ⅱ型跨膜糖蛋白)，通過與腫瘤細胞膜表達的Fas(Ⅰ型跨膜糖蛋白)結(jié)合，誘導腫瘤細胞凋亡。體外培養(yǎng)的CIK細胞可以分泌多種細胞因子，如IFN-γ、TNF-α、IL-2等，不僅對腫瘤細胞有直接抑制作用，還可通過調(diào)節(jié)機體免疫系統(tǒng)反應性間接殺傷腫瘤細胞[4]。

腫瘤細胞上 ICAM-1 表達數(shù)量決定了其對CIK 細胞的殺傷是否敏感。本次研究顯示，ICAM-1 在AML 骨髓細胞上的表達與對照組比較差異明顯;在 M1、M2和 M3 型AML 骨髓細胞上表達高于對照組，而 M4 和 M5 型 AML 骨髓細胞上表達顯著低于對照組。這與熊稀霖等[2]的研究結(jié)果基本一致，M1、M2和 M3 型AML對CIK細胞抗腫瘤作用效果明顯。國外研究認為，CIK 細胞的細胞毒活性可被抗 LFA-1 或 ICAM-1 的單克隆抗體所阻滯，這進一步提示細胞表面黏附分子ICAM-1在 CIK 細胞識別腫瘤過程中起關(guān)鍵作用[2]。

也有研究顯示[5]，ICAM-1與LFA-1和Mac-1結(jié)合可以抑制細胞毒性T細胞和自然殺傷細胞的激活與信號的傳遞，使細胞毒性T細胞、自然殺傷細胞和巨噬細胞殺傷腫瘤細胞的活性降低，導致腫瘤細胞逃避機體的細胞免疫監(jiān)視。同時，ICAM-1過度活化可產(chǎn)生大量的sICAM-1進入血液，通過對ICAM-1依賴的主要組織相容性復合體類抗原免疫識別競爭性抑制作用，使腫瘤細胞躲避機體的免疫監(jiān)視，發(fā)生腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。表達 ICAM-1 的腫瘤細胞與淋巴細胞的黏附性增強，隨著淋巴細胞移動，引起腫瘤細胞的擴散和轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)[6-7]，大腸癌、肺癌細胞表面ICAM-l的過度表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。胃癌細胞表面高表達ICAM-1分子，其產(chǎn)生的sICAM-l可促進癌細胞的血源性轉(zhuǎn)移。

總之，兒童腫瘤細胞ICAM-1分子的表達與CIK細胞免疫殺傷腫瘤細胞有關(guān)，高表達 ICAM-1分子的腫瘤細胞易受到CIK 細胞抗腫瘤作用?；純耗[瘤細胞ICAM-1分子高表達也可能發(fā)生腫瘤遠處轉(zhuǎn)移。參考兒童腫瘤ICAM-1的水平，可對病情進行合理地判斷，選擇適宜的免疫治療方案。高表達ICAM-1的腫瘤患兒應考慮積極使用 CIK 細胞免疫治療[8]。

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[2] 熊稀霖,黎 陽,王 林,等.兒童腫瘤及急性白血病中 ICAM-1(CD54)的表達及在CIK 細胞免疫治療中的臨床意義〔J〕.中國實驗血液學雜志,2012,20(2):282.

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