袁 銘， 肖 漓， 許曉光， 高 鈺， 錢葉勇， 石炳毅

(中國人民解放軍第309 醫(yī)院全軍器官移植研究所，北京100091)

缺血再灌注(ischemia-reperfusion，I/R)引起的急性損傷腎組織中可發(fā)現(xiàn)明顯的中性粒細(xì)胞浸潤，同時(shí)伴有相關(guān)黏附分子如CD11b、CD54、CD62L 和P-選擇素等增加，它們在組織炎癥損傷過程中起著重要作用［1-2］。國內(nèi)外研究證實(shí)地奧司明(diosmin，DOSM)具有抗炎癥反應(yīng)作用，它可能通過降低一些內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，在血管內(nèi)皮細(xì)胞水平抑制白細(xì)胞的激活、遷移與黏附，減少炎癥介質(zhì)的釋放，減輕脂質(zhì)過氧化損傷［3-5］;本實(shí)驗(yàn)以SD 大鼠腎I/R模型為基礎(chǔ)，以DOSM 作為干預(yù)手段，測定腎臟組織中髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)和血中中性粒細(xì)胞CD11b、CD54 和CD62L 的表達(dá)水平的變化。

材 料 和 方 法

1 材料

同齡健康雄性SD 大鼠180 只，體重200 ～220 g(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，SCXK 京2007-0001)。DOSM 由南京正大天晴藥業(yè)股份有限公司饋贈(zèng)。大鼠MPO ELISA 試劑盒為R＆D 產(chǎn)品?？笴D62L-FITC、抗CD11b-FITC 和抗CD54-PE 單克隆抗體均為ABGAb 產(chǎn)品。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及I/R 模型制備［5］SD 大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)(sham operation，SO)組、I/R 組和DOSM +I/R 組。3 組分別于術(shù)后1 h、3 h、6 h、12 h、24 h 和48 h 從下腔靜脈采血后處死10 只大鼠，全血置于-80 ℃冰箱保存以備檢測。取腎臟組織2.5 g，用磷酸鹽緩沖液5 mL 制成勻漿，離心后取上清液置于-80 ℃冰箱保存待測。

2.2 腎臟組織中MPO 的測定 嚴(yán)格按照ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行定量測定。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測CD11b、CD54 和CD62L 在中性粒細(xì)胞表面的表達(dá) 在每個(gè)流式檢測管中加入50 μL 的熒光標(biāo)記稀釋后的Ⅰ抗(抗體用緩沖液稀釋成合適的濃度);在空白管中加入50μL 緩沖液。每管分別加入100 μL 全血，并輕輕混勻。避光孵育15 ～30 min，進(jìn)行直接免疫熒光染色。每管分別加入2 mL 紅細(xì)胞裂解液，混合均勻。室溫避光孵育10 min，異裂解紅細(xì)胞，此孵育時(shí)間不要超過15 min。室溫1 500 r/min，離心5 min，并棄去上清液。用2 mL 緩沖液洗滌細(xì)胞2 次。重懸細(xì)胞后上流式細(xì)胞儀分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean ±SD)表示，多組間比較用單因素方差分析，使用SPSS 12.0 軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 腎臟組織勻漿中MPO 活性的變化

SO 組腎組織勻漿中MPO 活性組內(nèi)各時(shí)點(diǎn)比較無顯著差異;與SO 組相比，I/R 組MPO 活性在1 h、3 h 和6 h 各時(shí)點(diǎn)明顯升高，而在12 h 和24 h 開始下降，但仍高于同時(shí)點(diǎn)SO 組(P ＜0.01，48 h 組除外);DOSM+I/R 組MPO 活性也于1 h、3 h 和6 h 各時(shí)點(diǎn)明顯升高，且在6 h 左右達(dá)高峰，此后在12 h、24 h 和48 h 明顯降低，與 I/R 組相比差異顯著(P ＜0.05 或P ＜0.01)，與SO 組相比無顯著差異，見圖1。

Figure 1. Changes of MPO activity in rat kidney tissues from different groups. Mean±SD. n =10. ＊＊P ＜0.01 vs SO group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs I/R group.圖1 各組大鼠腎組織MPO 活性變化

2 不同時(shí)點(diǎn)大鼠血中性粒細(xì)胞CD11b、CD54 和CD62L 的表達(dá)

2.1 DOSM 對CD11b 的影響 結(jié)果見表1。CD11b在各組內(nèi)自1 h 至6 h 均逐漸升高，并于6 h 達(dá)高峰，此后逐漸降低。在相同時(shí)點(diǎn)，I/R 組均顯著高于SO組，差異顯著(P ＜0.01)，各時(shí)點(diǎn)DOSM +I/R 組顯著低于I/R 組(P ＜0.05 或P ＜0.01)。

2.2 DOSM 對CD54 的影響 結(jié)果見表2。CD11b在各組內(nèi)自1 h 至24 h 均逐漸升高，并于24 h 達(dá)高峰，此后逐漸降低。在相同時(shí)點(diǎn)，I/R 組均顯著高于SO 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)，各時(shí)點(diǎn)DOSM+ I/R 組顯著低于I/R 組(P ＜0.05 或P ＜0.01)。各時(shí)點(diǎn)DOSM+ I/R 組與SO 組比較，除3 h 和24 h之外無顯著差別。

2.3 DOSM 對CD62L 的影響 結(jié)果見表3。CD62L在各組內(nèi)自1 h 至3 h 升高，并于3 h 達(dá)高峰，此后逐漸降低。在相同時(shí)點(diǎn)，I/R 組均顯著高于SO 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0. 05 或P ＜0.01)，各時(shí)點(diǎn)DOSM + I/R 組顯著低于I/R 組(P ＜0.05 或P ＜0.01)。自1 h 至12 h DOSM + I/R 組高于SO 組(P ＜0.05 或P ＜0.01)，此后2 組之間無顯著差異。

表1 不同時(shí)點(diǎn)大鼠血中性粒細(xì)胞表面CD11b 的表達(dá)Table 1. The expression of neutrophil adhesion molecule CD11b in rat blood after kidney ischemia(%.Mean±SD.n=10)

表2 不同時(shí)點(diǎn)大鼠血中性粒細(xì)胞表面CD54 的表達(dá)Table 2. The expression of neutrophil adhesion molecule CD54 in rat blood after kidney ischemia(%.Mean±SD.n=10)

表3 不同時(shí)點(diǎn)大鼠血中性粒細(xì)胞表面CD62L 的表達(dá)Table 3. The expression of neutrophil adhesion molecule CD62L in rat blood after kidney ischemia(%.Mean±SD.n=10)

討 論

腎臟I/R 損傷的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)極其復(fù)雜的病理生理過程，其發(fā)病機(jī)制涉及中性粒細(xì)胞浸潤、氧化應(yīng)激損傷、細(xì)胞凋亡等，并有眾多炎性介質(zhì)和免疫因子的參與［6-7］。我們曾研究發(fā)現(xiàn)在腎I/R 病理過程中促炎癥細(xì)胞因子腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6 和IL-8 的產(chǎn)生顯著增加，而抗炎癥細(xì)胞因子IL-10 的產(chǎn)生卻減少［5］，同時(shí)腎組織的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)顯著增強(qiáng)［4］。因此減少中性粒細(xì)胞對組織細(xì)胞的黏附及相關(guān)炎癥介質(zhì)的釋放對減輕I/R 損傷具有一定的作用［1］。

MPO 主要存在于中性粒細(xì)胞的噬天青顆粒中，是中性粒細(xì)胞的特異性酶，能催化產(chǎn)生多種活性氧化物質(zhì)，導(dǎo)致氧化應(yīng)激和氧化性組織損傷，其激活程度與中性粒細(xì)胞的浸潤程度密切相關(guān)。CD54 又稱為細(xì)胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)，是免疫球蛋白超家族的一員，是一組跨膜的單鏈糖蛋白，主要分布在白細(xì)胞、巨嗜細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等，是最重要的白細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞間黏附分子之一。CD11b 是整合素家族中β2 亞族的一員，主要在中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞上表達(dá)，通過與內(nèi)皮細(xì)胞表面的黏附分子如ICAM-1、E-選擇素結(jié)合而介導(dǎo)白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞間相互作用。CD11b 受體密度上調(diào)是炎癥反應(yīng)的重要標(biāo)志，可促進(jìn)中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞黏附于內(nèi)皮細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)。CD62L 為L-選擇素，表達(dá)于大多數(shù)中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和嗜酸粒細(xì)胞，它介導(dǎo)白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞最初的滯留和滾動(dòng)，尤其重要的是CD62L 還介導(dǎo)白細(xì)胞遷移到炎癥部位，介導(dǎo)中性粒細(xì)胞相互之間的作用。

DOSM 是黃酮類化合物中的一種天然成分，在可食用植物、水果和蔬菜中，特別是在柑橘類水果的果皮中含量豐富，有增加靜脈張力、促進(jìn)淋巴回流、降低毛細(xì)血管通透性及增加毛細(xì)血管阻力的作用。目前臨床上常將DOSM 單用或與橙皮苷復(fù)合作為血管保護(hù)藥和靜脈張力增強(qiáng)藥應(yīng)用于慢性靜脈功能不全、靜脈潰瘍和急性痔瘡的治療［8］。DOSM 可通過降低一些內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，在毛細(xì)血管水平抑制白細(xì)胞的激活、遷移與黏附，減少炎癥介質(zhì)的釋放，從而降低毛細(xì)血管的通透性。那么DOSM 是否具有抑制MPO 以及中性粒細(xì)胞表面CD11b、CD54及CD62L 等分子的表達(dá)而發(fā)揮抗炎作用?本實(shí)驗(yàn)以大鼠腎臟I/R 為基礎(chǔ)，以DOSM 為干預(yù)治療措施，觀察到:(1)DOSM+I/R 組MPO 活性與I/R 組相比明顯下降，與SO 組相比無顯著差異，表明DOSM 可顯著降低缺血再灌注腎臟組織MPO 的活性，提示DOSM 減少了中性粒細(xì)胞的浸潤，從而發(fā)揮抗炎作用。(2)中性粒細(xì)胞CD11b、CD54 及CD62L 的表達(dá)在相同時(shí)點(diǎn)I/R 組顯著高于SO 組，而在DOSM 組則顯著低于I/R 組，說明DOSM 可顯著降低CD11b、CD54 及CD62L 的表達(dá)。

本研究顯示，腎I/R 后給予DOSM 治療可顯著減低MPO 活性，并顯著降低中性粒細(xì)胞表面CD11b、CD54 及CD62L 等的表達(dá)，從而減少中性粒細(xì)胞對組織細(xì)胞的黏附浸潤，抑制I/R 損傷的炎癥反應(yīng)。

(致謝:南京正大天晴藥業(yè)股份有限公司提供資助!)

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