邵秉一， 于 洋， 付 欣， 廖 立， 楊德琴△， 金 巖

(1重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，2重慶市口腔疾病與生物醫(yī)學(xué)研究中心，重慶400015;3 第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔組織病理學(xué)教研室，陜西 西安710032)

骨質(zhì)疏松是一種骨密度降低、骨脆性增加、骨板結(jié)構(gòu)紊亂、易發(fā)骨折的全身代謝性疾病［1］。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松是其中最為常見的一種類型。婦女絕經(jīng)后，體內(nèi)雌激素水平下降，能夠激活T 淋巴細胞并釋放多種細胞因子，如活化的CD4+T 淋巴細胞能分泌腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、γ 干擾素(interferon-γ INF-γ)、核因子κB 受體活化因子配體等重要的促破骨細胞生長的炎癥因子，導(dǎo)致骨密度降低［2-4］。骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs)是存在于骨髓中的多能干細胞，其具有的免疫調(diào)節(jié)功能在骨骼的發(fā)育與改建中發(fā)揮著重要的作用。BMMSCs 能抑制機體多種重要免疫細胞的增殖，如T 淋巴細胞、B 淋巴細胞和NK 細胞［5-6］。Mazar 等［7］發(fā)現(xiàn)BMMSCs 在體外能通過細胞凋亡膜分子受體(Fas/FasL)信號途徑誘導(dǎo)活化的T 淋巴細胞凋亡以躲避免疫系統(tǒng)的攻擊。Kentaro 等［8］發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)注射的異種BMMSCs 能通過Fas/FasL 誘導(dǎo)淋巴細胞凋亡引起免疫耐受。這些實驗證明了BMMSCs 能表達FasL，介導(dǎo)T 淋巴細胞凋亡。FasL 作為凋亡通路的配體在某些細胞中能夠受到雌激素的調(diào)控。已報道的研究顯示，雌激素缺乏能下調(diào)成骨細胞及破骨細胞自身的FasL 表達水平導(dǎo)致破骨細胞凋亡受到抑制［9-10］。但是雌激素是否能影響B(tài)MMSCs 中FasL 的表達導(dǎo)致T 淋巴細胞凋亡的改變，目前仍不清楚。本研究假設(shè)在雌激素缺乏導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松發(fā)生過程中，CD4+T 淋巴細胞的凋亡發(fā)生了改變，這可能是由于骨髓中的BMMSCs 對T 淋巴細胞的致凋亡作用發(fā)生了變化。實驗通過構(gòu)建骨質(zhì)疏松模型及體外雌激素刺激觀察雌激素對BMMSCs FasL 表達的改變及其對CD4+T 淋巴細胞凋亡的影響，進一步探討絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的發(fā)病機制。

材 料 和 方 法

1 動物

取健康8 周齡BALB/c 雌性小鼠(第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供)，隨機選取20 只行雙側(cè)卵巢切除(ovariectomy，OVX):1%戊巴比妥納腹腔麻醉，從背部開口完整摘除雙側(cè)卵巢。另選20 只假手術(shù)(sham)組在雙側(cè)腹下區(qū)取少量脂肪組織后止血縫合。置于SPF級動物房飼養(yǎng)2 個月，進行股骨micro-CT 掃描驗證模型是否建立成功。

2 主要試劑和儀器

α-MEM 培養(yǎng)基和胰蛋白酶(Gibco);胎牛血清(四季青);無酚紅的α-MEM 培養(yǎng)基(Gibco);17β-雌二醇(17β-estradiol，E2;Tocris);活性炭血清(Biowest);紅細胞裂解液(碧云天);anti-mouse CD4 APC(Ebioscience);CD3 (BD Pharmingen);CD28 (BD Pharmingen);抗FasL 抗體(Santa Cruz);細胞總RNA提取試劑盒和一步法RT-PCR 試劑盒(TaKaRa);體式顯微鏡、倒置相差顯微鏡以及照相系統(tǒng)(Olympus);流式細胞分析儀(Beckmen Coulter);real-time PCR 儀(Applied Biosystems);micro-CT (GE)。

3 小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞原代培養(yǎng)及純化

取BALB/c 小鼠斷頸處死，乙醇浸泡5 min，超凈臺內(nèi)無菌分離其脛骨和股骨，用完全培養(yǎng)基沖刷出全骨骨髓，輕柔吹打沖洗液制成單細胞懸液，加30 mL α-MEM(含20%FBS)平分至3 個9 cm 培養(yǎng)皿，培養(yǎng)24 h后棄去未貼壁細胞以后每3 d 換液1 次，待細胞生長達80%時進行傳代。

4 流式細胞術(shù)鑒定BMMSCs 的表型分子

取篩選培養(yǎng)的第3 代細胞，PBS 沖洗2 遍，用3 mL/L 胰蛋白酶2 mL 消化1 min，α-MEM 中和消化，800 r/min 離心5 min，棄上清，用含3%FBS 的PBS 緩沖液制成單細胞懸液，調(diào)整細胞密度為2×105/L 后分裝于Eppendorf 管中，每管200 μL，室溫避光下分別加入不同標記的抗體:CD44、CD105、CD45(PE 標記)和CD29(FITC 標記)，4 ℃避光孵育1 h，流式細胞儀分析熒光細胞，專用配套軟件計算細胞表面抗原陽性率，單位用%表示。

5 體外雌激素刺激BMMSCs

稱取1 mg E2加50 μL 無水乙醇溶解，配制成保存液濃度，細胞在雌激素刺激前用PBS 沖洗2 遍后改用無酚紅的α-MEM 培養(yǎng)(含10%活性炭血清)培養(yǎng)。待細胞生長至70%～80%，分別用0、0.1 nmol/L、1 nmol/L、10 nmol/L 和100 nmol/L E2刺激24 h 后待用。

6 T 淋巴細胞與小鼠骨髓間充質(zhì)細胞共培養(yǎng)

取4 ～8 周C57BL/6J 小鼠，斷頸處死，乙醇浸泡5 min，在超凈臺內(nèi)無菌摘取脾臟，將小鼠脾臟剪碎后混于Hanks 液中，400 目網(wǎng)濾過離心洗滌，加入RPMI-1640培養(yǎng)液(含10%FBS)，按每孔1 ×105個接種于24孔板中，24 孔板預(yù)先用CD3(5 mg/L)包埋4 h 后去除。每孔加入CD28(2 mg/L)激活3 d 后，再加入1 ×104BMMSCs(去勢組、假手術(shù)組及BMMSC 加雌激素處理組)與T 淋巴細胞共培養(yǎng)3 d。

7 檢測共培養(yǎng)體系中CD4+T 淋巴細胞凋亡

細胞共培養(yǎng)3 d 后，取上層液，1 000 r/min 離心5 min，收集細胞，加含3%FBS 的PBS 洗滌重懸，調(diào)整至1 ×109/L，加anti-mouse CD4 APC 4 ℃避光孵育1 h 后加入5 μL Annexin V 和5 μL 7-氨基放線菌素D (7-aminoactinomycin D，7-AAD)25 ℃避光孵育15 min，上機檢測。

8 Real-time PCR 檢測FasL mRNA 表達

分別收集去勢組、假手術(shù)組及雌激素處理組細胞，用總RNA 提取試劑盒一步法提取細胞總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，β-actin 為內(nèi)參照。參照GenBank 數(shù)據(jù)庫，采用Primer 5.0 計算機軟件設(shè)計引物，由TaKaRa 公司合成基因序列:β-actin 上游引物5’-TGGCACCCAGCACAATGAA-3’，下游引物5’-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3’;FasL 上 游 引 物5’-ATTGGCACCATCTTTACTGTTACC-3’，下 游 引 物5’-CTCCTTAGAATCTGTTTGCTCTCATA-3’。RT-PCR體系:Premix 10 μL，Dye 0.4 μL，ddH2O 6.6 μL，上、下游引物各0.5 μL，樣本模板2 μL。反應(yīng)條件參照產(chǎn)品說明。

9 Western blotting 檢測FasL 蛋白的表達

取去勢組、假手術(shù)組及不同濃度雌激素刺激組的細胞，采用碧云天全蛋白提取試劑盒進行全蛋白提取，用Bradford 蛋白濃度測定試劑盒進行蛋白定量測定;SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，免疫反應(yīng)，最后進行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，分析FasL 蛋白水平在各組間表達的差異。

10 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗重復(fù)3 次以上，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，測得的數(shù)據(jù)采用SPSS 11.0 軟件進行統(tǒng)計分析，兩組間均數(shù)比較采有t 檢驗，多組間均數(shù)比較用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t 檢驗，以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Micro-CT 掃描比較股骨干骺端形態(tài)學(xué)參數(shù)

OVX 組與sham 組股骨干骺端形態(tài)學(xué)參數(shù)比較，骨體積分數(shù)(bone volume/total volume，BV/TV)、骨表面積體積比(bone surface area/bone volume，BS/BV)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)、骨小梁數(shù)量(trabecular number，Tb. N)、骨小梁分離度(trabecular spacing，Tb. Sp)和骨密度(bone mineral density，BMD)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)，表明卵巢摘除后的小鼠骨質(zhì)疏松模型構(gòu)建成功，見圖1、表1。

Figure 1. Metaphyseal 3D reconstruction of sham mice (A)and OVX mice (B).圖1 Sham 組與OVX 組股骨干骺端三維重建

表1 Sham 組和OVX 組股骨干骺端形態(tài)學(xué)參數(shù)比較Table 1. Metaphyseal morphological parameters in sham group and OVX group(mean±SD.n=6)

2 BMMSCs 的分離及純化

第3 代細胞形態(tài)單一均勻大多呈梭形，少數(shù)為橢圓形，胞體較小，胞漿豐滿，呈漩渦狀生長，見圖2。

Figure 2. The third generation of bone marrow mesenchymal stem cells. A:sham group;B:OVX group.圖2 第3 代骨髓間充質(zhì)干細胞

3 細胞表面分子鑒定

Sham 組CD44、CD105 和CD29 陽性率分別為97.6%、79.6%和97.8%，CD45 的陽性率為2.3%。OVX 組CD44、CD105 和CD29 陽性率分別為97.6%、74.3%和97.3%，CD45 的陽性率為2.9%。結(jié)果表明sham 組和OVX 組細胞都為BMMSCs，見圖3。

4 Annexin V/7-AAD/CD4 三標染色檢測共培養(yǎng)體系中CD4+T 淋巴細胞凋亡結(jié)果

Annexin V 能特異性標記凋亡早期細胞和壞死細胞。7-AAD 能染凋亡晚期細胞及壞死細胞。Antimouse CD4 特異性標記CD4+T 淋巴細胞。在流式圖中左下象限為活細胞，右上象限為凋亡晚期細胞，右下象限為凋亡早期細胞，見圖4。CD4+T 淋巴細胞凋亡程度比較:sham+雌激素組CD4+T 淋巴細胞凋亡程度較sham 組顯著升高(P ＜0.05)，OVX 組CD4+T 淋巴細胞凋亡程度較sham 組明顯降低(P ＜0.05)，見圖4。

Figure 3. Phenotypes of mouse BMMSCs observed by FCM.圖3 流式細胞術(shù)對BMMSCs 表型進行鑒定

Figure 4. Apoptosis of CD4 +T lymphocytes co-cultured with BMMSCs. Mean ±SD. n =8. * P ＜0.05 vs OVX group;##P ＜0.01 vs sham group.圖4 BMMSCs 與T 淋巴細胞共培養(yǎng)中CD4 +T 淋巴細胞的凋亡情況

5 Real-time PCR 結(jié)果

去勢組BMMSCs 中FasL 的表達水平較假手術(shù)組低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05);給予BMMSCs 0 ～100 nmol/L 雌激素刺激24 h 后，隨著雌激素濃度的增加，BMMSCs 中FasL mRNA 近似呈梯度上升，除100 nmol/L 組與10 nmol/L 組外，各濃度之間FasL表達的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)，見圖5。

Figure 5. The mRNA expression of FasL in BMMSCs treated with different concentrations of estrogen (E2).A:the mRNA expression of FasL between sham group and OVX group. Mean ±SD.n =8. * P ＜0.05 vs OVX group. B:the mRNA expression of FasL in BMMSCs under stimulation of estrogen at different concentrations. Mean ±SD.n =5. △P ＜0.05 vs E2 0 nmol/L;#P ＜0.05 vs E2 0.1 nmol/L;▲P ＜0.05 vs E2 1 nmol/L.圖5 不同雌激素條件下BMMSCs 中FasL mRNA 水平比較

6 Western blotting 結(jié)果

去勢組中FasL 表達強度較假手術(shù)組明顯降低(P ＜0.01)，給予BMMSCs 0 ～100 nmol/L 雌激素刺激24 h 后，隨著雌激素濃度的增加，BMMSCs 中FasL蛋白水平近似呈梯度上升，除100 nmol/L 組與10 nmol/L 組外，各濃度之間FasL 表達有顯著差異(P ＜0.05 或P ＜0.01)。

Figure 6. Changes of the protein expression of FasL in BMMSCs treated with different concentrations of estrogen (E2). A:the protein level of FasL between OVX and sham group;B:the protein level of FasL expressed by BMMSCs under stimulation of estrogen at different concentrations. Mean±SD.n=3. ＊＊P ＜0.01 vs OVX group;△P ＜0.05 vs E2 0 nmol/L;##P ＜0.01 vs E2 0.1 nmol/L;▲▲P ＜0.01 vs E2 1 nmol/L.圖6 不同雌激素條件下FasL 蛋白水平的比較

討 論

實驗結(jié)果表明雌激素濃度影響B(tài)MMSCs 對T 淋巴細胞的凋亡程度，并且此現(xiàn)象與雌激素對BMMSCs表達FasL 的水平高低相一致，從而我們可以推測雌激素下降可能改變BMMSCs 中FasL 的水平抑制活化的T 淋巴細胞凋亡，進而促進骨質(zhì)疏松的發(fā)生。實驗中當雌激素濃度提高到100 nmol/L 時，BMMSCs中FasL 水平改變不明顯，雌激素調(diào)控BMMSC 中FasL 水平的機制可能是FasL 的基因啟動序列上存在雌激素應(yīng)答元件(ERE)［11］，ERE 能和被雌激素激活的雌激素受體(ER)結(jié)合刺激FasL 基因表達。當雌激素濃度過高時，會減弱ER 與ERE 的結(jié)合，進而影響雌激素對FasL 的調(diào)控［12］。我們還在實驗過程中發(fā)現(xiàn)OVX 組BMMSCs 在體外正常培養(yǎng)時(含雌激素培養(yǎng)液)，其FasL 水平在體外培養(yǎng)期間(約20 d 左右)并沒有恢復(fù)，而sham 組的BMMSCs 在體外培養(yǎng)(無雌激素培養(yǎng)液)，其FasL 水平對外界低濃度的雌激素刺激發(fā)生了明顯的變化，原因可能是長期的雌激素缺乏會對細胞產(chǎn)生一種“記憶效應(yīng)”［13］，造成細胞難以短期恢復(fù)原有的生物學(xué)功能，這也可能是骨質(zhì)疏松治療中單純給予雌激素短期內(nèi)無法完全逆轉(zhuǎn)癥狀的重要因素［14］。本文重點討論了雌激素缺乏下BMMSCs 對活化CD4+T 淋巴細胞凋亡的影響，然而B 淋巴細胞以及破骨細胞前體在骨質(zhì)疏松過程中同樣發(fā)揮著作用。B 淋巴細胞在雌激素缺乏下數(shù)量增加，其生長因子IL-7 可導(dǎo)致T 細胞與巨噬細胞產(chǎn)生促炎癥因子，引起骨量丟失［15］。破骨細胞前體在雌激素缺乏下凋亡降低，相關(guān)破骨基因表達增強，因此今后研究雌激素調(diào)節(jié)BMMSCs 表達FasL 對這些細胞是否具有凋亡作用將是一個很有意義的課題。在研究中我們僅從體外觀察到了雌激素調(diào)控BMMSCs表達FasL 影響T 淋巴細胞的凋亡，未能闡明在體內(nèi)BMMSCs 對T 淋巴細胞的凋亡作用。BMMSCs 是成骨細胞的前體，存在于骨髓腔中［16］，有機會與體內(nèi)的淋巴細胞接觸。但在體內(nèi)BMMSCs 數(shù)量較少并且與T 淋巴細胞相互作用的機制仍然不明確，究竟自身的BMMSCs 在體內(nèi)雌激素環(huán)境改變對活化T 淋巴細胞的凋亡作用發(fā)生變化能否引起骨質(zhì)疏松仍值得我們后續(xù)研究。

本實驗選擇了雌激素缺乏導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松模型中骨髓間充質(zhì)干細胞對CD4+T 淋巴細胞凋亡的影響進行研究，旨在探究在雌激素改變下骨髓間充干細胞在體外對活化T 淋巴細胞凋亡改變的分子機制，為骨質(zhì)疏松的發(fā)生發(fā)展提供了理論基礎(chǔ)。

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