多西紫杉醇對(duì)大腸癌細(xì)胞放射增敏的作用研究

趙維勇 劉志遠(yuǎn) 畢良文 張麗珍▲

1.南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院放療科，江蘇南京 210011；2.南京市胸科醫(yī)院放療科，江蘇南京 210011

在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中，大腸癌最為常見。 大腸癌患者的發(fā)病率及死亡率每年均呈增長趨勢，如今在我國，大腸癌已成為惡性腫瘤病死原因的第2 位。大腸癌確診時(shí)大多已為晚期，術(shù)前放射治療可以使腫瘤體積縮小，從而能降低直腸癌的臨床分期及局部復(fù)發(fā)率，最終達(dá)到延長生存期的目的。 近年來，放療聯(lián)合化療藥物使直腸癌療效提高，患者受益，因而在局部晚期直腸癌中，新輔助治療多選擇放化療聯(lián)合[1]。 多項(xiàng)研究已證實(shí)多西紫杉醇能提高非小細(xì)胞肺癌、宮頸癌、食管癌等細(xì)胞的放射敏感性[2-4]。本實(shí)驗(yàn)以多西紫衫醇聯(lián)合放療作用于大腸癌細(xì)胞，探討多西紫衫醇對(duì)腸癌潛在可能的放射增敏作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 人腸癌細(xì)胞株SW480 細(xì)胞購自上海生命科學(xué)研究院；多西紫杉醇（艾素）為江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)；RMI-1640 購自GIBCO BRL 公司；AnnexinV-FITC/PI 檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.1.2 主要儀器 生物倒置顯微鏡，CO2培養(yǎng)箱， 分光光度計(jì)，醫(yī)科達(dá)醫(yī)用直線加速器（瑞典），臺(tái)式低速離心機(jī)，流式細(xì)胞儀。

1.2 方法

1.2.1 MTT 法觀察多西紫杉醇對(duì)SW480 的增殖抑制作用 設(shè)對(duì)照組、空白組及多西紫杉醇作用組。SW480細(xì)胞培養(yǎng)到一定數(shù)量，96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔約5×103個(gè)細(xì)胞。 加入不同濃度多西紫杉醇（0.1、0.5、1、3、5、10、20、40、60 μg/mL）培養(yǎng)液，每個(gè)濃度及組內(nèi)設(shè)3 復(fù)孔。 繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h 后，將96 孔板進(jìn)行MTT 染色，測定OD 值（λ=490 nm），計(jì)算抑制率。 抑制率（%）＝（1-實(shí)驗(yàn)組OD 值/對(duì)照組OD 值）×100%。 以抑制率為縱軸，多西紫杉醇濃度為橫軸，制作SW480 細(xì)胞生長抑制曲線圖。 通過概率單位加權(quán)回歸法（Bliss 法）計(jì)算IC50。

1.2.2 克隆形成法檢測多西紫杉醇對(duì)直腸癌SW480細(xì)胞的放射增敏作用 完全培養(yǎng)液3 mL 于5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，細(xì)胞貼壁后，進(jìn)行分組處理：對(duì)照組；多西紫杉醇組：多西紫杉醇5 μg/mL（20% IC50）；放療組：不同照射劑量（0、1、2、4、6、8 Gy） 照射；多西紫杉醇+放療組：5 μg/mL 多西紫杉醇處理細(xì)胞后2 h，再分別進(jìn)行不同劑量（0、1、2、4、6、8 Gy）照射。每個(gè)濃度及組內(nèi)設(shè)3 復(fù)孔。 處理結(jié)束后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，然后棄去含藥物的培養(yǎng)液， 換新鮮的不含藥物的培養(yǎng)液，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)10～14 d。 當(dāng)6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中出現(xiàn)肉眼可見的克隆的時(shí)候，經(jīng)過洗滌、固定、染色，在低倍鏡下計(jì)數(shù)大于50 個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)，計(jì)算相關(guān)指標(biāo)。公式：貼壁率（plating efficiency，PE）=對(duì)照組每孔克隆數(shù)/每孔細(xì)胞種植數(shù)×100%； 存活率或存活分?jǐn)?shù)（surviving fraction，SF）=實(shí)驗(yàn)組每孔克隆數(shù)/（每孔種植數(shù)×貼壁率）。以單擊多靶數(shù)學(xué)模型擬合細(xì)胞存活曲線，計(jì)算出放療組和放療聯(lián)合藥物組的D0值， 放射增敏效應(yīng)以放射增敏比（SERD0）表示，定義為單獨(dú)放療組與放療聯(lián)合藥物組的D0之比。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布 分組： 對(duì)照組、放療組、多西紫杉醇組和多西紫杉醇+放療組。將細(xì)胞接種于6 孔板中，待細(xì)胞貼壁后，對(duì)照組更換無藥培養(yǎng)液，多西紫杉醇組更換含有5 μg/mL 多西紫杉醇的培養(yǎng)液，放療組給以4 Gy 劑量照射；多西紫杉醇+放療組給予5 μg/mL 多西紫杉醇同時(shí)接受4 Gy 照射。組內(nèi)設(shè)3 復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，洗滌、固定、PI 染色后，記錄激發(fā)波長488 nm 處紅色熒光。

1.2.4 Annexin V-FITC/PI 染色法檢測細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)分四組：對(duì)照組、單純照射組、多西紫杉醇組和多西紫杉醇+放療組。待細(xì)胞貼壁后，加入相應(yīng)的含藥培養(yǎng)基及照射處理（同“1.2.3”項(xiàng)下），每個(gè)濃度及組內(nèi)設(shè)3 復(fù)孔。 藥物作用48 h 后， 收集細(xì)胞、 洗滌， 加入Annexin V-FITC、Propidium Iodide， 采用流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞凋亡的發(fā)生情況

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析， 計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（s）表示，多組間比較采用單因素方差分析， 組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 多西紫杉醇對(duì)SW480 細(xì)胞增殖的影響

多西紫杉醇抑制SW480 細(xì)胞增殖作用與濃度呈正相關(guān)（F = 84.71，P ＜0.001）；與時(shí)間呈正相關(guān)（F = 26.30，P ＜0.001）。 見表1、圖1。 后續(xù)研究選擇多西紫杉醇5 μg/mL 作用48 h， 作為放射增敏濃度和時(shí)間。

表1 多西紫杉醇對(duì)人腸癌細(xì)胞SW480 增殖的抑制作用（%，s）

表1 多西紫杉醇對(duì)人腸癌細(xì)胞SW480 增殖的抑制作用（%，s）

0.1 0.5 1351 0 20 40 60 1.11±2.43 2.34±1.56 8.30±1.54 10.30±1.39 21.33±1.23 28.44±0.99 34.21±1.43 40.34±1.23 45.22±1.51 1.33±2.01 3.89±2.18 10.22±1.19 13.45±1.29 23.92±2.20 38.65±1.23 49.67±1.00 54.76±1.18 57.33±1.35 3.11±2.39 8.22±2.30 17.33±1.23 22.13±1.76 35.33±2.01 44.11±1.24 56.33±1.02 61.21±1.10 63.11±1.94

圖1 多西紫杉醇對(duì)人腸腺癌細(xì)胞SW480 增殖的抑制作用

2.2 多西紫杉醇的放射增敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表2 可見，SF 及克隆形成隨著照射劑量的升高而降低。 使用單擊多靶模型對(duì)SF 和放射劑量進(jìn)行曲線擬合，見圖2。 根據(jù)擬合的細(xì)胞存活曲線及相關(guān)公式，得出相應(yīng)參數(shù)D0、Dq、SER 值，多西紫杉醇+放射組的Dq、SF2值均低于單純放療組，見表3，提示多西紫杉醇可使SW480 細(xì)胞的放射敏感性明顯增強(qiáng)，其SER 值為1.73。

2.3 多西紫杉醇影響SW480 細(xì)胞周期的分布

流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示， 多西紫杉醇作用后，SW480 細(xì)胞周期發(fā)生變化，G2/M 期細(xì)胞比例由（32.19±0.47）%增高到（46.24±0.07）%，多西紫杉醇+放療組增高到（58.08±0.05）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 見表4、圖3。

表2 多西紫杉醇、多西紫杉醇聯(lián)合放射線的細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)

圖2 根據(jù)單擊多靶模型擬合細(xì)胞存活曲線

表3 不同組別細(xì)胞存活曲線的主要參數(shù)

表4 多西紫杉醇聯(lián)合或不聯(lián)合放療對(duì)人腸癌SW480 細(xì)胞周期的影響（%，s）

表4 多西紫杉醇聯(lián)合或不聯(lián)合放療對(duì)人腸癌SW480 細(xì)胞周期的影響（%，s）

注：與對(duì)照組比較，#P < 0.05；與放療組比較，*P < 0.05

對(duì)照組多西紫杉醇組放療組多西紫杉醇+放療組38.29±0.85 32.42±0.28 28.91±0.27 23.63±0.32 29.52±0.51 21.34±0.58 21.72±0.46 18.29±0.45 32.19±0.47 46.24±0.07#49.37±0.35#58.08±0.05#*

圖3 多西紫杉醇聯(lián)合或不聯(lián)合放療對(duì)人腸癌SW480 細(xì)胞周期的影響

2.4 Annexin V-FITC/PI 染色法檢測多西紫杉醇聯(lián)合放療對(duì)人腸癌細(xì)胞SW480 凋亡的影響

流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞經(jīng)不同處理后的細(xì)胞凋亡的改變，結(jié)果顯示，多西紫杉醇可提高放療誘導(dǎo)的凋亡（P < 0.05）。 見表5。

表5 多西紫杉醇不聯(lián)合或聯(lián)合放射線對(duì)人腸癌細(xì)胞SW480 凋亡的影響（%，s）

表5 多西紫杉醇不聯(lián)合或聯(lián)合放射線對(duì)人腸癌細(xì)胞SW480 凋亡的影響（%，s）

注：與對(duì)照組比較，#P < 0.05；與放療組比較，*P < 0.05

對(duì)照組多西紫杉醇組放療組多西紫杉醇+放療組1.43±0.05 18.33±0.32#8.98±0.03#21.54±0.22#*

3 討論

直腸癌常使用放療作為局部治療方法，在直腸癌的綜合治療中，放療扮演著重要角色。但臨床上，直腸癌患者對(duì)放射治療的敏感性表現(xiàn)各異，可能是因?yàn)槟[瘤細(xì)胞乏氧的程度有差異， 同時(shí)腫瘤本身存在異質(zhì)性，并且直腸癌放療可以引起消化道出血、疼痛、穿孔等放療反應(yīng)， 尤其是在超過正常組織耐受劑量情況下，反應(yīng)更為強(qiáng)烈，患者難以耐受。高效低毒的放射增敏劑可提高直腸癌放療效果， 提高患者生活質(zhì)量，成為腫瘤放射治療的研究熱點(diǎn)[1]。

多西紫杉醇是一種半合成的紫杉醇類抗腫瘤新藥，作用于細(xì)胞的微管系統(tǒng)，在腫瘤細(xì)胞有絲分裂時(shí)，能促進(jìn)微管聚合，同時(shí)抑制微管解聚，使游離微管減少，影響細(xì)胞有絲分裂的進(jìn)行，引起腫瘤細(xì)胞死亡。多項(xiàng)研究證實(shí)，多西紫杉醇對(duì)頭頸部惡性腫瘤、卵巢癌、非小細(xì)胞肺癌和乳腺癌等多種細(xì)胞株都有抑制增殖的作用，同時(shí)腫瘤細(xì)胞的凋亡增加。深入研究發(fā)現(xiàn)，多西紫杉醇可引起細(xì)胞bcl-2 基因磷酸化而失活，同時(shí)bax基因過度表達(dá)，從而誘導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞凋亡增加[5-6]。 另外，大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究證實(shí)，多西紫杉醇能提高宮頸癌、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌等細(xì)胞的放射敏感性[2-3]。 本研究表明， 多西紫杉醇對(duì)大腸癌細(xì)胞系SW480 有類似作用， 多西紫杉醇對(duì)大腸癌細(xì)胞系SW480 的生長抑制作用有一定的劑量和時(shí)間依賴性；多西紫杉醇+放療組的D0、Dq、SF2值均比單純照射組低，5 μg/mL 多西紫杉醇SER 值為1.73；SW480 細(xì)胞經(jīng)多西紫杉醇處理后對(duì)射線更敏感，細(xì)胞凋亡增加，多西紫杉醇+放療組凋亡發(fā)生率為（21.54±0.22）%，明顯高于單獨(dú)放療組。本研究顯示多西紫杉醇對(duì)大腸癌細(xì)胞系SW480 有放射增敏作用， 說明多西紫杉醇對(duì)SW480 細(xì)胞是一種良好的放射增敏劑。

細(xì)胞對(duì)放射線的敏感性與所處的細(xì)胞周期時(shí)相相關(guān)，G2/M 期最敏感，S 期對(duì)放射抗拒[7]。 不同化療藥物作用機(jī)制和環(huán)節(jié)不同，大多可改變細(xì)胞周期。 有目的使用化療藥物，從而改變細(xì)胞周期，可增加放射敏感性，對(duì)腫瘤治療有重要意義。有研究表明，多西紫杉醇具有放射增敏作用，表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞G2/M 期阻滯，同時(shí)乏氧細(xì)胞再氧合，從而對(duì)射線敏感性增加[2]。本研究發(fā)現(xiàn)，多西紫杉醇可以使SW480 細(xì)胞的G2/M 期比例升高（46.24±0.07）%比（32.19±0.47）%，多西紫杉醇+放療組更高達(dá)（58.08±0.05）%，S 期比例降低。 提示多西紫杉醇使細(xì)胞周期重新分布， 各期比例變化，G2/M 期腸癌細(xì)胞比例增加， 放療后細(xì)胞凋亡明顯增加。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)顯示，多西紫杉醇對(duì)大腸癌細(xì)胞具放射增敏作用，其機(jī)制可能是改變了腸癌細(xì)胞的周期分布，誘導(dǎo)其凋亡增加。 本實(shí)驗(yàn)探索為直腸癌的治療提供了新的手段和方法，但其分子機(jī)制及臨床使用的時(shí)機(jī)、劑量和策略仍需進(jìn)一步探索和深入研究。

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