透明背脊皮翼視窗在腫瘤活體成像中的應(yīng)用

許改霞，翟 鵬，林蘇霞，饒南熹，朱小妹，王曉梅，牛憨笨

1)深圳大學(xué)光電工程學(xué)院，光電子器件與系統(tǒng)教育部/廣東省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，深圳518060;2)深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)院，深圳市生物醫(yī)學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，深圳518060

腫瘤發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的多因素、多階段過(guò)程，是個(gè)體基因不穩(wěn)定性及包括人類生活方式在內(nèi)的環(huán)境因素等共同作用的結(jié)果，研究腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)理，對(duì)腫瘤治療方法和新藥開(kāi)發(fā)具有重要意義. 20世紀(jì)70 年代，Judah 等［1］首次提出不斷生長(zhǎng)的腫瘤血管可以產(chǎn)生內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，刺激產(chǎn)生新的血管，從而為腫瘤組織的生長(zhǎng)提供氧氣及其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并將代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)出去. 此發(fā)現(xiàn)一經(jīng)報(bào)道，就引起學(xué)者們的廣泛關(guān)注，圍繞腫瘤血管再生研究，旨在尋找有效藥物抑制腫瘤局部血管增生，從而“餓死”腫瘤. 隨著治療技術(shù)和檢測(cè)手段的發(fā)展，腫瘤藥物研究方面取得巨大進(jìn)步，尤其是掌握了與腫瘤發(fā)生相關(guān)的若干基因;但在腫瘤發(fā)生機(jī)制方面，由于與癌癥相關(guān)的基因并非單獨(dú)起作用，它們之間存在極為復(fù)雜的相互關(guān)聯(lián)，因此腫瘤機(jī)制研究相對(duì)緩慢.

然而，熒光標(biāo)記物如各種染料標(biāo)記物和熒光蛋白的發(fā)展，以及各種新型成像技術(shù)的出現(xiàn)，為腫瘤活體成像帶來(lái)新希望，背脊皮翼視窗(dorsal skin fold window chamber，DSFC)也在腫瘤研究中展現(xiàn)獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和發(fā)展?jié)摿? 本文綜述背脊皮翼視窗的特點(diǎn)及發(fā)展歷史，介紹背脊皮翼視窗的構(gòu)建方法及與之相關(guān)的光學(xué)活體成像方法，指出其在腫瘤活體成像研究中的應(yīng)用前景.

1 背脊皮翼視窗的歷史沿革

1.1 結(jié)構(gòu)改進(jìn)

1924 年，Branemark 等［2］首次將中空的金屬環(huán)植入兔耳，暴露出視窗中心部位的血管和組織，形成透明光學(xué)視窗，對(duì)兔耳局部組織生長(zhǎng)進(jìn)行活體顯微觀察，為活體成像開(kāi)辟新思路. 該視窗幾乎不用考慮組織自發(fā)熒光及光傳播過(guò)程中在組織內(nèi)的吸收與散射，在相同分辨率條件下成本大大低于其他活體成像系統(tǒng)，且耳部血管及組織在視窗內(nèi)清晰可見(jiàn)，成像效果良好. 此外，由于窗口操作減小了常規(guī)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)創(chuàng)傷引起的應(yīng)激反應(yīng)，同時(shí)可以保證較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)獲得優(yōu)質(zhì)圖像，具有實(shí)時(shí)、原位和長(zhǎng)時(shí)間監(jiān)測(cè)等觀察特點(diǎn)，很快被用于活體組織生長(zhǎng)、血管再生和血液循環(huán)等方面研究. 然而，由于實(shí)驗(yàn)兔的肉芽組織生長(zhǎng)較慢，用于腫瘤研究制作周期太長(zhǎng)，且維護(hù)和操作費(fèi)用較高，限制了視窗模型的應(yīng)用.

1943 年，Beverly 等［3-4］改進(jìn)了Branemark 的透明視窗技術(shù)，將兔耳視窗發(fā)展為小鼠背脊皮翼視窗. 即把小鼠背部皮膚褶壓入一個(gè)由兩塊合金材料組成的環(huán)形夾板中，暴露視窗中心部位，實(shí)現(xiàn)對(duì)小鼠皮下組織及微循環(huán)的觀察，這是第一次完全意義上實(shí)現(xiàn)了對(duì)腫瘤、腫瘤周?chē)芤约八拗髌は陆M織的長(zhǎng)時(shí)間、原位和實(shí)時(shí)觀測(cè)，這種被稱為背脊皮翼視窗的透明視窗模型，形成現(xiàn)代透明視窗的雛形.

現(xiàn)在背脊皮翼視窗基本沿襲了Beverly 等人設(shè)計(jì)的視窗結(jié)構(gòu). 但因當(dāng)時(shí)材料的限制，視窗重量過(guò)大，不利于小型動(dòng)物的正?；顒?dòng)，且視窗穩(wěn)定性較差，無(wú)法滿足長(zhǎng)時(shí)間光學(xué)成像的要求.

1.2 材料發(fā)展

1970 年，Arfors 等［5］將鈦合金材料引入視窗構(gòu)建. 鈦合金重量輕，生物相容性好，具有較低的熱傳導(dǎo)率和良好的生化惰性，極大改善了不銹鋼視窗的不足. 此后，由于模型動(dòng)物培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，人們對(duì)視窗的細(xì)微結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化，兼顧操作靈活性、實(shí)用性和穩(wěn)定性等方面，將視窗技術(shù)拓展到其他嚙齒類動(dòng)物模型研究，如倉(cāng)鼠頰囊透明視窗［6］、大小鼠頭骨部視窗［7］和小鼠乳腺脂肪板視窗［8］等. 由于小鼠在病理學(xué)研究方面歷史較長(zhǎng)，技術(shù)相對(duì)成熟，故小鼠背脊皮翼視窗是所有視窗中應(yīng)用最廣泛的.

圖1 為典型背脊皮翼視窗的基本結(jié)構(gòu):主要由后固定片、定位環(huán)、緊固環(huán)、前固定片和皮膚壓片(玻璃蓋片)組成，僅2.7 g. 兩個(gè)固定片材料均為鈦合金，定位環(huán)材料為銅鈹合金，每個(gè)固定片都有兩個(gè)側(cè)向直角法蘭，便于安放在動(dòng)物背部，固定片中心為直徑15 mm 的圓孔，即光學(xué)觀察視窗. 構(gòu)建背脊皮翼視窗時(shí)，固定片將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的背部皮膚像三明治一樣夾起來(lái)，定位環(huán)嵌套在前固定片內(nèi)部，緊固環(huán)將皮膚壓片鎖在定位環(huán)內(nèi)，通過(guò)螺絲螺帽將整個(gè)系統(tǒng)固定在小鼠背部，最后觀察視窗與顯微系統(tǒng)耦合即可進(jìn)行光學(xué)實(shí)時(shí)成像［9］.

圖1 背脊皮翼視窗［10］Fig.1 Dorsal skin fold window chamber［10］

1.3 標(biāo)記物發(fā)展

早期的背脊皮翼視窗，僅用于觀察活體局部組織形貌的變化，并未引入熒光標(biāo)記物. 隨著研究領(lǐng)域的拓寬和新型熒光成像手段的介入，人們開(kāi)始將熒光標(biāo)記物引入視窗觀測(cè)模型中［7］，常用的熒光染料有異硫氰酸熒光素 (fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC) -凝集素和FITC -葡聚糖等. FITC 的熒光強(qiáng)度與活細(xì)胞數(shù)量成正比，具有很高的精確度，但想得到穩(wěn)定表達(dá)熒光素的細(xì)胞株，其操作復(fù)雜，且光漂白現(xiàn)象明顯，不利于長(zhǎng)時(shí)間檢測(cè)，在與血液有關(guān)的機(jī)制研究中受到局限;1997 年，Takashi 等［11］將綠色熒光蛋白 (green fluorescent protein，GFP)引入視窗模型內(nèi)的腫瘤細(xì)胞示蹤，用于觀察特定腫瘤細(xì)胞的游走、遷移和生長(zhǎng)情況，此后，GFP、增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein ，EGFP)和紅色熒光蛋白 (red fluorescence protein，DsRed)等熒光蛋白在活體成像中也得到廣泛應(yīng)用. 雖然使用熒光蛋白轉(zhuǎn)染的細(xì)胞穩(wěn)定性和特異性提高了，但同F(xiàn)ITC 一樣，也存在光漂白現(xiàn)象;之后，作為新型熒光標(biāo)記物的量子點(diǎn) (quantum dots，QDs)被用于視窗模型［12］，由于其具有發(fā)光亮度高和不易光漂白等優(yōu)良光學(xué)特點(diǎn)，使得長(zhǎng)時(shí)間、高分辨顯微結(jié)構(gòu)成像成為可能，極大的推動(dòng)了活體成像在腫瘤方面的深入研究.

1.4 背脊皮翼視窗推動(dòng)腫瘤活體成像研究

至此，經(jīng)過(guò)近90 年的發(fā)展，背脊皮翼視窗已成為腫瘤活體光學(xué)成像最重要的輔助工具之一，在腫瘤機(jī)制、腫瘤診斷和腫瘤治療研究的各個(gè)方面發(fā)揮巨大作用. 2000 年，Li 等［13］利用視窗良好的光學(xué)成像效果，將少量(20 ～30 個(gè))熒光標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞注入背脊皮翼視窗中，觀察腫瘤的早期生長(zhǎng)、血管再生以及微血管介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，該研究對(duì)腫瘤早期的發(fā)生發(fā)展以及早期診斷具有重要意義;2002 年，Rakesh 等［14］首次運(yùn)用背脊皮翼視窗研究腫瘤細(xì)胞間的間隙壓力和腫瘤流體轉(zhuǎn)移，拓展該技術(shù)的研究范圍;2005 年，Matthew 等［15］將背脊皮翼視窗與多光子顯微鏡活體成像系統(tǒng)耦合，長(zhǎng)時(shí)間跟蹤腫瘤細(xì)胞向遠(yuǎn)端器官轉(zhuǎn)移時(shí)的游走、捕獲及附著過(guò)程，使視窗技術(shù)從原位癌研究拓展到癌癥轉(zhuǎn)移可視化領(lǐng)域;2005 年，Makale 等［16］制造雙面視窗，其中一面是透明的成像窗口，另一面是平板氧氣或葡萄糖的探測(cè)器，用于氧氣和血糖檢測(cè)以及器官和組織的移植研究，此時(shí)基于背脊皮翼視窗檢測(cè)系統(tǒng)的輸出已不僅是光學(xué)信號(hào)，同時(shí)還有傳感器輸出的電信號(hào);此外，Matthew 等［17-19］用背脊皮翼視窗觀察新藥或納米顆粒治療腫瘤的過(guò)程，該應(yīng)用可極大縮短新藥的開(kāi)發(fā)周期，對(duì)臨床和醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)都具有巨大推動(dòng)作用. 近年來(lái)，中國(guó)學(xué)者也將背脊皮翼視窗引入癌癥研究，并在腫瘤發(fā)生機(jī)制及物理治療方法方面取得有意義的結(jié)果［20-21］.

由此可見(jiàn)，背脊皮翼視窗已經(jīng)并將繼續(xù)在活體小動(dòng)物局部微環(huán)境可視化研究中發(fā)揮重要作用，研究?jī)?nèi)容也由單一的腫瘤邊緣、腫瘤區(qū)域血管生長(zhǎng)的觀測(cè)拓展到與腫瘤生長(zhǎng)有關(guān)的細(xì)胞、腫瘤與周邊血管之間的相互作用、腫瘤組織微環(huán)境、腫瘤治療藥物的靶向性及藥效的觀測(cè)，該技術(shù)將極大地推動(dòng)腫瘤診治過(guò)程可視化進(jìn)程.

2 背脊皮翼視窗的構(gòu)建

當(dāng)前用于腫瘤研究的背脊皮翼視窗，大多基于裸鼠腫瘤模型動(dòng)物構(gòu)建. 實(shí)驗(yàn)用鼠的培養(yǎng)環(huán)境和手術(shù)操作程序都嚴(yán)格按照裸鼠建模步驟實(shí)施. 簡(jiǎn)單來(lái)講，裸鼠在全麻后置于滅菌手術(shù)平臺(tái)，背部皮膚褶壓入兩塊鈦合金夾板中，見(jiàn)圖2. 定位螺絲將背脊皮翼視窗固定片定位在目標(biāo)血管附近，剪刀剪開(kāi)對(duì)應(yīng)框架圓孔位置的皮膚圓孔(直徑為1.4 cm)，將肌肉暴露在視野中，建立光學(xué)視窗;構(gòu)建腫瘤模型時(shí)將塊狀腫瘤組織或懸浮腫瘤細(xì)胞植入視窗皮下，而后將系統(tǒng)框架與小鼠縫合在一起.

植入腫瘤有兩種方式:一種是腫瘤組織植入法，直接從建模成功的裸鼠取出腫瘤組織，切成1 mm 見(jiàn)方的小塊植入到實(shí)驗(yàn)小鼠選定區(qū)域(通常為背部)，蓋玻片蓋在腫瘤組織上方，壓緊;另一種是腫瘤細(xì)胞注射法，將分散的腫瘤細(xì)胞注入皮下組織或肌肉組織中［22］. 兩種方法都依靠腫瘤細(xì)胞自身生長(zhǎng)、浸潤(rùn)與活體小鼠之間建立血液循環(huán).

通常構(gòu)建成功的背脊皮翼視窗，在顯微鏡視野下觀察，蓋玻片緊貼皮下組織，且透明、無(wú)斑點(diǎn)、無(wú)氣泡，則血液流通正常. 若構(gòu)建失敗，則顯微鏡下光學(xué)細(xì)節(jié)模糊，肉眼可見(jiàn)血管部位失去血色，主要原因是創(chuàng)面細(xì)菌感染. 此外，活體成像的圖像效果取決于腫瘤的擴(kuò)散速度，若腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)擴(kuò)散很快，觀察后期成像效果則變差.

3 基于背脊皮翼視窗的活體光學(xué)成像系統(tǒng)

傳統(tǒng)光學(xué)成像系統(tǒng)，如體視顯微鏡或普通熒光顯微鏡，無(wú)法提供樣品精細(xì)的三維信息，同時(shí)成像深度相對(duì)較小，因此近年來(lái)在透明背脊皮翼平臺(tái)中應(yīng)用較少. 配有高數(shù)值孔徑物鏡的單光子共聚焦顯微成像系統(tǒng)，最高可達(dá)200 nm 的橫向分辨率，見(jiàn)圖3 (a). 多光子顯微成像技術(shù)，只激發(fā)焦點(diǎn)區(qū)域的熒光分子，具有更高分辨率和靈敏度，見(jiàn)圖3(b). 若用紅外光譜激發(fā)，可達(dá)到幾百微米的成像深度. 結(jié)合多色標(biāo)記成像即可對(duì)多種感興趣分子或結(jié)構(gòu)進(jìn)行同時(shí)觀察，了解它們的相互作用. 利用光譜掃描和三維成像，可獲得腫瘤部位多個(gè)參數(shù)，如腫瘤大小、血管再生、血流動(dòng)力學(xué)、血管滲透性、間隙pH 值、間隙滲透及膠原蛋白結(jié)構(gòu)等［3，23-25］，這些參數(shù)都與腫瘤發(fā)展密切相關(guān).

圖3 基于背脊皮翼視窗的血管成像［25］Fig.3 Imaging of vascular based on the dorsal skin fold window chamber［25］

光學(xué)頻率區(qū)域成像 (optical frequency domain imaging，OFDI)是一種基于掃頻光源的、新型的光學(xué)相干層析成像技術(shù)［2］，具有良好的分辨率、掃描成像速度以及成像深度，其最大特點(diǎn)是對(duì)于具有彈性光散射特性的樣品，可得到三維方向分辨率均很高的圖像，如圖4. 新的光頻區(qū)域成像結(jié)合多普勒技術(shù)可在大約10 min 內(nèi)完成4 ～5 mm 腫瘤組織的三維圖像，且成像深度可以達(dá)到1 000 μm. 這種散射信號(hào)基于機(jī)體內(nèi)部血流運(yùn)動(dòng)的構(gòu)建圖像，無(wú)需其他外源性標(biāo)記物，幾乎毫無(wú)侵入性［26-28］，是觀察活體小動(dòng)物血流情況的最佳方法.

圖4 基于背脊皮翼視窗的光頻區(qū)域成像系統(tǒng)［27］Fig.4 optical frequency domain imaging system based on the dorsal skin fold window chamber［27］

4 背脊皮翼視窗在腫瘤研究中的應(yīng)用

4.1 觀測(cè)腫瘤組織的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)變化

在背脊皮翼視窗的幫助下，成像系統(tǒng)可長(zhǎng)時(shí)間實(shí)時(shí)對(duì)活體動(dòng)物進(jìn)行微創(chuàng)成像，若利用低功率光源照明和成像，可得到活體小動(dòng)物腫瘤組織長(zhǎng)時(shí)間、連續(xù)變化的數(shù)據(jù)，利用圖像分析軟件進(jìn)行數(shù)字化及其他處理，可得到腫瘤二維結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)，根據(jù)二維腫瘤結(jié)構(gòu)的大小和成像深度計(jì)算可得腫瘤組織的體積，最后獲得基于時(shí)間和形態(tài)學(xué)變化的腫瘤結(jié)構(gòu)生長(zhǎng)情況，這對(duì)腫瘤生長(zhǎng)研究及臨床腫瘤階段的判斷和治療具有重要價(jià)值［29］.

圖5 (a)為本課題組構(gòu)建的裸鼠背脊皮翼視窗模型，植入5 μL 濃度為105個(gè)/μL 的喉癌細(xì)胞Hep-2. 10 d 后，腫瘤生長(zhǎng)情況如圖5 (b). 可見(jiàn)，視窗中心腫瘤部位出現(xiàn)明顯組織增厚、毛細(xì)血管密集彎曲的現(xiàn)象.

圖5 裸鼠背脊皮翼視窗模型及視窗腫瘤模型Fig.5 Model of dorsal skin fold window chamber on nude mice and tumor model

4.2 觀測(cè)腫瘤對(duì)于微血管的特征干擾

新生血管增多是多數(shù)腫瘤細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞與其微環(huán)境相互影響的結(jié)果，是多數(shù)惡性腫瘤進(jìn)展的標(biāo)志. 同時(shí)，新生血管的形成對(duì)腫瘤細(xì)胞本身的增殖和生長(zhǎng)必不可少，它還是腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的必要條件. 新生血管的各項(xiàng)參數(shù)還可作為判斷腫瘤進(jìn)展情況的指標(biāo)，研究腫瘤對(duì)微血管的特征干擾對(duì)提示腫瘤發(fā)展機(jī)制具有重要作用. 利用背脊皮翼視窗可對(duì)關(guān)于血管的血流功能、血流動(dòng)力、血氧、血管直徑、血管密度、血管中白細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞相互作用以及血管滲透性等諸多參數(shù)進(jìn)行分析［30-32］.

在實(shí)際研究中，先通過(guò)尾靜脈注射將相關(guān)造影劑注入小鼠體內(nèi)，再利用顯微成像系統(tǒng)對(duì)造影血管進(jìn)行連續(xù)拍照，最后通過(guò)離線圖像分析軟件對(duì)血管進(jìn)行分析處理，便可得上述參數(shù)數(shù)據(jù)［24］.

4.3 觀測(cè)腫瘤局部血管外參數(shù)

腫瘤血管在結(jié)構(gòu)和功能上與正常血管差別很大，造成腫瘤組織血供相對(duì)不足，瘤細(xì)胞的無(wú)氧代謝增加，乳酸堆積，因此腫瘤組織經(jīng)常處于低營(yíng)養(yǎng)、慢性乏氧和低pH 的綜合狀態(tài). 大多數(shù)腫瘤細(xì)胞在這種不正常的負(fù)性微環(huán)境壓力下難以存活，但是持續(xù)存在的代謝壓力，會(huì)增加基因組的不穩(wěn)定性，誘導(dǎo)新的腫瘤細(xì)胞克隆出現(xiàn)和擴(kuò)增，導(dǎo)致腫瘤惡性度增高，及局部區(qū)域和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的概率增加.同時(shí)，腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞具有抗氧化能力增強(qiáng)的特點(diǎn)，這是基于腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的氧應(yīng)激反應(yīng)，它可通過(guò)受體酪氨酸激酶通路上調(diào)腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮合酶的表達(dá)，提高內(nèi)源性一氧化氮(NO)減少氧損傷，降低免疫細(xì)胞的殺傷能力［33-34］.

將特異性熒光標(biāo)記物(pH 敏感、NO 或O2濃度敏感)注射到活體動(dòng)物體內(nèi)，應(yīng)用背脊皮翼視窗對(duì)腫瘤組織局部進(jìn)行監(jiān)測(cè)，即可獲得血管外參數(shù)信息，利用離線軟件對(duì)圖像中的信息進(jìn)行分析處理，便可得到腫瘤局部的pH 值、組織NO 濃度或間隙O2濃度的值［15，23，30，34-36］.

4.4 腫瘤相關(guān)基因研究

利用背脊皮翼視窗進(jìn)行腫瘤基因研究，通常是為了檢測(cè)特定基因啟動(dòng)子在基質(zhì)和腫瘤細(xì)胞中的活動(dòng). 常見(jiàn)手段首先將啟動(dòng)子所驅(qū)動(dòng)的熒光表達(dá)基因注入小鼠體內(nèi)，一旦這種基因有所表達(dá)，相應(yīng)的細(xì)胞系就會(huì)發(fā)出熒光，同時(shí)熒光強(qiáng)度會(huì)被實(shí)時(shí)記錄，作為進(jìn)行特定基因在腫瘤生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移擴(kuò)散中起作用的重要指標(biāo)［29，37-38］，這種方式具有高效、準(zhǔn)確和實(shí)時(shí)的測(cè)量特點(diǎn). 2007 年，Mark 等［39］闡述缺氧誘導(dǎo)因子-1 在腫瘤血管早期生長(zhǎng)中的作用，通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方式，將缺氧誘導(dǎo)因子-1 與綠色熒光蛋白同時(shí)轉(zhuǎn)染到大鼠乳腺癌細(xì)胞系中，而后將穩(wěn)轉(zhuǎn)的細(xì)胞植入背脊皮翼視窗模型，他們發(fā)現(xiàn)隨著腫瘤的生長(zhǎng)，缺氧誘導(dǎo)因子-1 表達(dá)量也隨之增加，如圖6.

2010 年，Gregory 等［40］利背脊皮翼視窗建立腫瘤部位三維氧壓模型，更加形象地說(shuō)明缺氧誘導(dǎo)因子1 基因與腫瘤生長(zhǎng)密切相關(guān).

圖6 通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白的大鼠乳腺癌細(xì)胞熒光成像［39］Fig.6 Fluorescence imaging of rat mammary carcinoma cells transfected with GFP by lipofection［39］

4.5 抗腫瘤藥物的研究

腫瘤的生長(zhǎng)需要新生血管參與，因此在抗腫瘤藥物中，有一類是專門(mén)使抗腫瘤血管生成的，其實(shí)質(zhì)是通過(guò)抑制腫瘤新生血管達(dá)到治療腫瘤的目的.從原理上說(shuō)，抗腫瘤生成治療對(duì)所有實(shí)體腫瘤都有效，作用對(duì)象是不同腫瘤組織中幾乎相同的血管內(nèi)皮細(xì)胞. 使腫瘤毛細(xì)血管萎縮，切斷腫瘤的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，使腫瘤得不到營(yíng)養(yǎng)而慢慢“餓死”［41］.

2010 年，Mamta 等［18］分別構(gòu)建小鼠乳腺癌和人腎臟癌背脊皮翼視窗模型，研究腫瘤血管阻斷劑Oxi4503 對(duì)上述兩種腫瘤的治療效果. 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這種血管阻斷劑對(duì)人腎臟癌腫瘤組織血管僅有暫時(shí)性的血管阻斷，6 h 后血管逐漸恢復(fù);而對(duì)小鼠乳腺癌腫瘤部位血管則具有明顯的血管阻斷效果. 通過(guò)背脊皮翼視窗所提供腫瘤局部血管的精細(xì)結(jié)構(gòu)信息，可提示腫瘤治療藥物的作用路徑與機(jī)理，從而為檢測(cè)腫瘤藥物對(duì)血管再生的抑制提供一種直觀手段，定量評(píng)價(jià)藥物活體靶向性及抗腫瘤效果，縮短藥物篩選的周期.

4.6 長(zhǎng)時(shí)間高分辨動(dòng)態(tài)成像

借助量子點(diǎn)熒光亮度高、抗光漂白等特點(diǎn)［42-47］，研究者進(jìn)行腫瘤血管滲透性、腫瘤靶向及抗腫瘤藥物等方面的長(zhǎng)時(shí)間高分辨動(dòng)態(tài)成像研究［12，48-50］.

2007 年，Voura 等［50］將具有特異靶向乳腺癌細(xì)胞的功能化量子點(diǎn)，通過(guò)尾靜脈注射的方式，注入小鼠體內(nèi)，而后利用背脊皮翼視窗熒光成像系統(tǒng)對(duì)視窗中的量子點(diǎn)進(jìn)行追蹤，捕捉到量子點(diǎn)從血管到進(jìn)入腫瘤細(xì)胞核區(qū)域的6 個(gè)過(guò)程:在血管中運(yùn)輸→從腫瘤部位血管壁溢出到達(dá)腫瘤細(xì)胞間隙→腫瘤細(xì)胞外運(yùn)動(dòng)→特異性結(jié)合細(xì)胞膜上蛋白→通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞→到達(dá)腫瘤細(xì)胞核區(qū)域，如圖7. 這項(xiàng)研究實(shí)現(xiàn)了量子點(diǎn)在活體生物體內(nèi)的單分子示蹤，對(duì)腫瘤生長(zhǎng)機(jī)理和抗腫瘤靶向藥物研究具有深遠(yuǎn)意義.

Fig.7 Schematic illustration of targeted quantum dots transpoting in the tumor tissue［46］圖7 靶向量子點(diǎn)在腫瘤部位轉(zhuǎn)運(yùn)情況示意圖［46］

展 望

背脊皮翼視窗相對(duì)其他活體成像系統(tǒng)，具有微創(chuàng)、實(shí)時(shí)和原位觀察等優(yōu)點(diǎn)，借助輔助配件，可與目前使用的大多數(shù)光學(xué)成像系統(tǒng)很好耦合，獲得更清晰細(xì)致的腫瘤局部動(dòng)態(tài)信息，方便將大部分停留在細(xì)胞層面的實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)接到活體研究水平. 背脊皮翼視窗還在生物相容性材料、感染、干細(xì)胞、血液動(dòng)力學(xué)、神經(jīng)系統(tǒng)科學(xué)、藥物治療、炎癥及免疫研究領(lǐng)域具有巨大應(yīng)用前景，尤其是在臨床藥物研發(fā)方面將起到極大促進(jìn)作用.

隨著新材料和新方法的出現(xiàn)，與背脊皮翼視窗相關(guān)的其他活體透明視窗結(jié)構(gòu)，如小鼠乳頭脂肪墊視窗模型、腸系膜視窗模型及頭蓋骨視窗模型等，也在不斷發(fā)展完善，相信這種光學(xué)活體成像輔助手段必將在腫瘤研究和新藥開(kāi)發(fā)中發(fā)揮更大作用.

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