王 勇，李水明，何曼文，馮里茹

1)深圳大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 深圳市海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境重點實驗室，深圳518060;2)深圳大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院深圳市微生物基因工程重點實驗室，深圳518060

隨著高分辨質(zhì)譜的快速發(fā)展，有文獻認(rèn)為計算蛋白質(zhì)組學(xué)研究取得的進展正在移去數(shù)據(jù)分析的瓶頸，少數(shù)使用高分辨質(zhì)譜的實驗可以鑒定和定量幾乎所有肽段［1］. 但也有文獻報道生物信息學(xué)仍是蛋白質(zhì)組學(xué)需要解決的最大問題，不斷提高的質(zhì)譜儀準(zhǔn)確度并未能顯著提高基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)的可信賴度［2］. 無論使用何種類型質(zhì)譜儀，即使在獲得所有原始數(shù)據(jù)的情況下，因為數(shù)據(jù)處理的差異，仍不能保證一定會識別原始數(shù)據(jù)中所包含的全部肽段和蛋白［3］. 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫搜索(database searching)和從頭測序(de novo sequencing)是基于質(zhì)譜數(shù)據(jù)識別肽段的兩種基本方法. 前者的基礎(chǔ)是已知的基因組數(shù)據(jù)庫，后者不依賴數(shù)據(jù)庫，直接利用串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)推導(dǎo)肽段序列，用于基因組未測序生物的蛋白質(zhì)鑒定和已知蛋白的深入研究，要求的數(shù)據(jù)質(zhì)量更高，難度更大［4-5］.

有關(guān)肽段可檢測性的實驗和理論預(yù)測研究已開展較多［6］，但實驗中有時也會遇到圖譜質(zhì)量很好但未能與數(shù)據(jù)庫匹配的問題，這種情況下人工解析原始圖譜會對問題有所幫助. 基質(zhì)輔助激光解吸電離–串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF/TOF)具有中等程度的分辨率和準(zhǔn)確度等特點，且價格相對較低、靈敏度高和易于操作，在大規(guī)模鑒定蛋白，特別是雙向電泳樣品的分析中仍被廣泛使用. 本研究通過分析幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白和實際樣品，探討影響MALDI-TOF/TOF 數(shù)據(jù)利用度的因素和解決途徑.

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

本研究所用儀器為4800 MALDI TOF/TOFTMAnalyzer基質(zhì)輔助激光解吸電離-串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF/TOF，美國Applied Biosystems/MDX SCIEX 公司)，儀器控制軟件為4700 Series Explorer Software. 所用試劑有:胰蛋白酶(質(zhì)譜分析機，Promega 公司);α -腈基-4 -羥基肉桂酸(美國Sigma 公司);其他試劑均為分析純或優(yōu)級純. 所用樣品包括標(biāo)準(zhǔn)蛋白細(xì)胞色素C，蛋白相對分子質(zhì)量標(biāo)記物#SM0431 (包括β - 半乳糖苷酶、牛血清白蛋白和β - 乳球蛋白等，Thermo Fisher Scientific)和雙向電泳分離的實際樣品.

1.2 膠內(nèi)胰酶水解

切膠:將雙向電泳分離后的目標(biāo)條帶用移液槍槍頭切下，小心地放入PCR 管;脫色:用100 μL高純水振蕩洗滌10 min，重復(fù)3 次;用100 μL 25 mmol/L 的NH4HCO3室溫振蕩平衡20 min;最后用100 μL NH4HCO3(濃度為25 mmol/L)和乙腈(體積分?jǐn)?shù)為50%)的混合液室溫振蕩30 min;干燥膠粒:用100 μL 25 mmol/L 的NH4HCO3室溫振蕩平衡20 min;加100 μL 體積分?jǐn)?shù)為100%的乙腈于膠粒中靜置10 min，重復(fù)1 次;酶解:加入5 μL 20 μg/mL 質(zhì)譜用測序級胰蛋白酶，4 ℃放置30 min，使酶液完全浸透膠粒，吸掉多余的酶液;加入5 μL NH4HCO3(濃度為40 mmol/L)和CAN(體積分?jǐn)?shù)為10%)，37 ℃水浴8 h.

1.3 質(zhì)譜分析

基質(zhì)制備:將6 mg/mL α -腈基-4 -羥基肉桂酸和2 mg/mL 檸檬酸氫二胺溶于10 mL 體積分?jǐn)?shù)為50%的乙腈(含體積分?jǐn)?shù)為0.1%的三氟乙酸)，基質(zhì)溶液與蛋白酶解液按體積比1∶1 混合后點于不銹鋼靶版，自然干燥結(jié)晶后待測. 采用正離子反射模式，一級質(zhì)譜每張譜圖累加800 次，二級質(zhì)譜累加1 200 次，碰撞誘導(dǎo)解離條件為1 kV 碰撞能加空氣碰撞(1 kV，gas on). 一級質(zhì)譜掃描范圍800 ～4 000，串聯(lián)質(zhì)譜掃描范圍0 ～4 000，Nd∶YAG 激光器，頻率200 Hz ，波長355 nm.

1.4 數(shù)據(jù)分析

搜庫條件:串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)信噪比設(shè)為5，一級和二級質(zhì)譜質(zhì)量誤差均設(shè)為±0.3 Da，Mascot 軟件分析，數(shù)據(jù)庫NCBI 2012 年8 月發(fā)布，甲硫氨酸氧化和谷氨酸甲基化作為可變修飾，胰蛋白酶漏切數(shù)為1. 數(shù)據(jù)解析利用Protein-Prospector MS-Product program 輔助進行人工解析.

2 結(jié)果與討論

2.1 搜庫條件中誤差設(shè)置的影響

肽段質(zhì)量誤差(peptide tolerance)和離子碎片質(zhì)量誤差(MS/MS tolerance)是主要的搜庫選項，Da 和ppm (1 ppm =1 ×10-6)是兩種常用的誤差單位，為直觀起見，本工作以Da 為單位. 雖然TOF/TOF 類儀器的外標(biāo)法質(zhì)量準(zhǔn)確度理論上可達到10 ×10-6，但實際分析過程中影響因素眾多，典型的質(zhì)量準(zhǔn)確度為5 ×10-5～10 ×10-5［7］(10 ×10-5對于相對分子質(zhì)量為2 000 Da 的肽段相當(dāng)于0.2 Da). Mascot 打分是衡量檢出的目標(biāo)肽段與實際情況相符程度的指標(biāo)，分值越高，結(jié)果越可信. 我們首先利用大腸桿菌β -半乳糖苷酶考察誤差設(shè)置與Mascot 得分的關(guān)系. 如表1，當(dāng)一級和二級質(zhì)量誤差都設(shè)置為0.1 Da 時，得分很低，意味著蛋白未能被鑒定，當(dāng)誤差都從0.1 Da 變?yōu)?.2 Da 時，得分顯著增加，提高串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)果的誤差容忍范圍對提高得分更為有效，誤差設(shè)置超過0.2 Da 后分值增加趨緩.

表1 一級和二級質(zhì)量誤差值的設(shè)定對大腸桿菌β-半乳糖苷酶搜庫鑒定結(jié)果的影響Table 1 The influence of peptide mass tolerance and MS/MS tolerance on the identification of E.coli β-galactosidase

因為蛋白質(zhì)整體鑒定的得分值取決于由串聯(lián)質(zhì)譜推測的各肽段的打分情況，所以總分值的增加意味著有更多的肽段被成功鑒定. 為進一步解釋該問題，將該蛋白所有肽段的一級質(zhì)量誤差，以及在誤差皆為0.3 Da 時的串聯(lián)質(zhì)譜打分值列于表2.

表2 大腸桿菌β-半乳糖苷酶胰蛋白酶水解肽段的一級質(zhì)量誤差和肽段得分Table 2 The mass error of tryptic digests of E.coli β-galactosidase and Mascot score for each peptide

一級質(zhì)量誤差小于0.1 Da、介于0.1 ～0.2 Da以及超過0.2 Da 的肽段數(shù)分別為5、11 和2 個，即當(dāng)一級質(zhì)量誤差設(shè)定在0.1 Da 時，無論串聯(lián)圖譜的質(zhì)量如何，只有5 個肽段可以利用，其他都已根據(jù)一級質(zhì)量數(shù)被排除;當(dāng)設(shè)定在0.2 Da 時，18 個肽段中的16 個被利用，總得分達到815 分. 一級質(zhì)量的最大質(zhì)量誤差為0.208 5 Da，在此之上的任意值搜庫得分相同，同理，可推測二級質(zhì)譜的數(shù)據(jù)利用情況與誤差設(shè)置的關(guān)系. 這組數(shù)據(jù)的相對誤差約8 ×10-5，而同一次實驗中有些蛋白的全部肽段相對誤差小于3 ×10-5，另外一些蛋白的相對誤差可能超過10 ×10-5，原因是這一類型質(zhì)譜儀的質(zhì)量準(zhǔn)確度與校準(zhǔn)條件、靶點位置等因素相關(guān). 以上結(jié)果表明，在大量組學(xué)數(shù)據(jù)的分析中，誤差標(biāo)準(zhǔn)要稍高于該類儀器的平均準(zhǔn)確度. 如最大肽段分子質(zhì)量為2 500 Da，誤差一般可設(shè)在0.3 Da，該值也可根據(jù)搜庫結(jié)果的反饋調(diào)整. 除了誤差設(shè)定，其他因素也會影響質(zhì)譜數(shù)據(jù)的利用.

2.2 其他數(shù)據(jù)庫搜索條件設(shè)置的影響

可變修飾和胰酶漏切位點的設(shè)置也會影響搜庫結(jié)果. 半胱氨酸乙酰胺化(+57 Da)和甲硫氨酸氧化(+16 Da)是最常用的可變修飾，用胰蛋白酶時漏切數(shù)目一般設(shè)為1. 如相對分子質(zhì)量/電荷數(shù)(質(zhì)荷比，mass-to-charge ratio，m/z)=1 866 的離子被鑒定為芽孢桿菌限制性核酸內(nèi)切酶的肽段YFAVEWETGNIASSHR，串聯(lián)質(zhì)譜得分94，而m/z=1 898 未被鑒定，但它們的串聯(lián)譜圖相似，32 Da的差別應(yīng)為增加了兩個氧原子，Mascot 上有HW(O)的選項，但選擇后搜索的結(jié)果不匹配，經(jīng)人工解析發(fā)現(xiàn)正確結(jié)構(gòu)為YFAVEW(Dioxidation)ETGNIASSHR，而此選項Mascot 搜索引擎未提供. 此外，檢測 到 β - 乳 球 蛋 白 肽 段149 LSFNPTQLEEQC(Carbamidomethyl)HI162(m/z =1 715，得分119)，而m/z =1 729 的離子未被匹配，兩者分子質(zhì)量相差14 Da，可能是由于谷氨酸甲基化、半胱氨酸丙酰胺化或第150 位的絲氨酸突變?yōu)樘K氨酸，而明顯的b2離子表明氨基酸未突變. 在這兩種甲基化搜庫選項下的得分值分別為83 和123，提示半胱氨酸丙酰胺化的可能性更大. 另一方面，谷氨酸甲基化的蛋白和酶解后肽段的相對含量都較低，而我們發(fā)現(xiàn)在一級譜中m/z =1 729 的離子豐度明顯高于m/z= 1 715 的，所以，m/z = 1 729 離子對應(yīng)LSFNPTQLEEQC(Propionamide)HI，該結(jié)論已經(jīng)人工解析證實. 另一例是細(xì)胞色素C，它以74%的蛋白序列覆蓋率被鑒定，其中肽段TGPNLHGLFGR(m/z =1 168)得分90，m/z =1 225 離子與m/z =1 168 離子的串聯(lián)質(zhì)譜在低質(zhì)量區(qū)非常相似，提示兩者的氨基酸組成相近，但因其不符合生物學(xué)的基本原理，它們相差的57 Da 不能用多一個甘氨酸殘基加以解釋，可能是絲氨酸被乙?；?，人工解析發(fā)現(xiàn)了y10和b7離子，但由于串聯(lián)質(zhì)譜未提供更多的信息，加此選項后仍未檢索出這個結(jié)果. 另外，在細(xì)胞色素C 中還發(fā)現(xiàn)有兩個漏切點的肽段KTEREDLIAYLK(m/z =1 478，得分82)，說明漏切也會影響質(zhì)譜數(shù)據(jù)的利用.

2.3 不規(guī)則酶切和基因突變的影響

在實際樣品分析中，也會有非特異性水解和氨基酸突變發(fā)生. 圖1 為擬南芥葉綠素a/b 結(jié)合蛋白1 胰酶水解液的一級質(zhì)譜和兩個目標(biāo)離子的二級質(zhì)譜圖，該蛋白由串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)鑒定，共鑒定出6 個肽段，蛋白總得分為401. 圖1 中有串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)卻未能鑒定的離子用星號標(biāo)記，m/z 分別為1 151、1 167、1 183、1 199 和2 874. 經(jīng)從頭測序分析，m/z =1 151 的離子鑒定為肽段AAHWMPGEPR，序列表征如圖2. 在此基礎(chǔ)上，m/z 為1 167、1 183 和1 199 分別被鑒定為AAHWM (O)PGEPR、AAHW(O)M (O)PGEPR 和AAHW (dioxidation)M (O)PGEPR，組氨酸和脯氨酸的亞胺離子也說明該解析正確. 值得注意的是，根據(jù)已知的該蛋白序列，肽段的理論序列應(yīng)為(K)44MAAHWMPGEPR54，提示發(fā)生了非特異性酶解反應(yīng). m/z =2 874 的離子質(zhì)量較大，斷裂較差，不能進行從頭測序分析，但結(jié)合該蛋白結(jié)構(gòu)解析出序列為AFLLDGSAPGDFGFDPL GLGEVPANLER，匹配度如圖3，而其理論序列為(R)55PAYLDGSAPGDFGFDPLGLGEVPANLER82，在此同時發(fā)生了不規(guī)則酶切和苯丙氨酸取代酪氨酸的突變，這種情況較難解析，對串聯(lián)質(zhì)譜的連續(xù)性要求很高或符合一定規(guī)律，在本例中以脯氨酸結(jié)尾的y 離子均具有高豐度.

我們在常規(guī)搜庫條件下也鑒定出擬南芥葉綠素a/b 結(jié)合蛋白3 的9 個肽段，Mascot 得分482，序列覆蓋率為23%，但當(dāng)添加天冬氨酸甲基化選項并將母離子誤差提高到0.5 Da 時，檢索結(jié)果中增加了肽段5IWRCSD (Methyl)SSCSLPGDYGFDPLGLSD PEGTGGFIEPR39(C，半胱氨酸乙酰胺化)，肽段得分為79，m/z =3 802，質(zhì)量誤差0.47 Da，圖4).此肽段的檢出使得該蛋白Mascot 得分增至561，覆蓋率增至45%. 盡管上述肽段得分較高，實際發(fā)生的并非是天冬氨酸甲基化，而是其突變?yōu)楣劝彼?，因?qū)嶒炛胁⑽礄z測到不發(fā)生天冬氨酸甲基化的原型肽段. 近年研究表明由基因突變導(dǎo)致的蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組學(xué)蛋白質(zhì)序列的不一致性值得重視［8］，為此，我們認(rèn)為若未同時檢測到含天冬氨酸和甲基化天冬氨酸的肽段，僅憑基因組數(shù)據(jù)進行推測，有可能導(dǎo)致結(jié)論錯誤. 目前，尚未見利用串聯(lián)質(zhì)譜區(qū)分含谷氨酸和甲基化天冬氨酸肽段的報道.

圖1 擬南芥葉綠素a/b 結(jié)合蛋白1 胰酶水解肽段的MALDI-TOF 圖譜Fig.1 MALDI-TOF spectrum of tryptic digests of chlorophyll a/b binding protein 1(* peptides for unidentified by database searching)

圖2 m/z=1 151 的離子串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜圖Fig.2 MALDI-TOF/TOF spectrum of m/z=1 151 ion

圖3 m/z=2 874 的離子串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜圖Fig.3 MALDI-TOF/TOF spectrum of m/z=2 874 ion

圖4 m/z=3 802 的離子串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜圖Fig.4 MALDI-TOF/TOF spectrum of m/z=3 802 ion

盡管串聯(lián)質(zhì)譜可以給出精確結(jié)果，但仍有無法解釋的變化. 在β-乳球蛋白中檢測到的m/z =837的離子為肽段ALPMHIR (圖5)，在同一樣品中檢測到的m/z =789 的離子串聯(lián)質(zhì)譜圖與其相似(圖6)，在低質(zhì)量區(qū)都檢測到了亮氨酸/異亮氨酸，脯氨酸和組氨酸的亞胺離子(m/z 分別為86、70 和110. 經(jīng)人工解析確定序列為ALPXHIR，X 代表分子質(zhì)量為83 Da 的氨基酸殘基，可能由甲硫氨酸減去48 Da 產(chǎn)生，對應(yīng)失去1 分子HS-CH3. 為提高數(shù)據(jù)利用度也可在搜庫選項中選擇“error tolerant”選項，這可能發(fā)現(xiàn)天冬氨酸與天冬酰胺之間的突變等翻譯后修飾，但這會降低搜庫速度，有時得到的結(jié)果誤差也較大，仍需人工解析確認(rèn).

圖5 m/z=837 的離子串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜圖Fig.5 MALDI-TOF/TOF spectrum of m/z=837 ion

圖6 m/z=789 的離子串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜圖Fig.6 MALDI-TOF/TOF spectrum of m/z=789 ion

結(jié) 語

綜上所述，需依據(jù)實驗結(jié)果設(shè)定搜庫條件中的誤差，如因?qū)嶒灥南到y(tǒng)誤差等原因設(shè)定過小會產(chǎn)生假陰性. 與肽指紋圖譜不同，基于串聯(lián)質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)時，設(shè)置較大的誤差值后未觀察到假陽性，這是因為MALDI-TOF/TOF 高能CID 產(chǎn)生了豐富的碎片信息，甚至可以應(yīng)用于從頭測序分析［9-10］，因此，高效率的斷裂在一定程度上彌補了準(zhǔn)確度的不足.盡管如此，多肽的從頭測序解析仍不容易，有時較難區(qū)分信號或噪音，不規(guī)則斷裂也會給解析帶來困難，這時需要借助亞胺離子，氨基酸的亞胺離子由高能CID 產(chǎn)生，能夠特異性地給出肽段組成信息［11-12］，Hohmann 等［13］曾指出在由于離子阱質(zhì)譜在蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)占據(jù)統(tǒng)治地位，亞胺離子的作用被大大忽略了. 本實驗中我們利用亞胺離子尋找同源肽段，即低質(zhì)量區(qū)相似的肽段可能有相近的組成，在此基礎(chǔ)上利用軟件輔助進行人工解析和二次數(shù)據(jù)庫檢索驗證，提高了解譜效率和數(shù)據(jù)利用度，適于蛋白質(zhì)的翻譯后修飾和突變研究，對其他類型質(zhì)譜數(shù)據(jù)的利用也有借鑒.

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