Bloom解旋酶突變體的克隆與表達(dá)

張金彪 許厚強(qiáng) 駱衡 許慶賀 陳祥 李坤

（1.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴陽(yáng) 550025；2.貴州大學(xué)高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴陽(yáng) 550025；3.貴州大學(xué)貴州省動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴陽(yáng) 550025）

DNA解旋酶是解開DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的酶，在DNA的復(fù)制、修復(fù)、重組、轉(zhuǎn)錄、維持染色體穩(wěn)定性等細(xì)胞代謝過程中都具有非常重要的作用［1-3］。RecQ解旋酶家族是DNA解旋酶中的一個(gè)重要家族，人類RecQ解旋酶缺陷會(huì)引起遺傳不穩(wěn)定，導(dǎo)致相關(guān)疾病如癌癥［4，5］的發(fā)生。在人體中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)RecQ1、BLM、WRN、RecQ4和RecQ5五種RecQ解旋酶，其中BLM、WRN、RecQ4缺陷會(huì)相應(yīng)的引起B(yǎng)loom綜合癥（BS）、Werner（WS）和Rothmund-Thomson綜合癥（RTS）［6，7］。

BS是一種常染色體隱性遺傳疾病，其臨床特征表現(xiàn)為身軀矮小，出生前或出生后引起的生長(zhǎng)阻滯，面部有對(duì)光敏感的紅斑，女性的生育能力較低，男性不育，免疫缺陷及易患多種癌癥［8，9］。BLM解旋酶由1 417個(gè)氨基酸組成，BLM解旋酶在DNA解鏈過程中表現(xiàn)為3'-5'極性，而且可以解開多種DNA，包括3'端有缺口的雙鏈DNA、泡狀DNA、帶有復(fù)制叉的雙鏈DNA、G-四鏈體DNA、D型環(huán)狀DNA及霍利迪結(jié)構(gòu)DNA［10-13］。先前的研究已經(jīng)證明BLM解旋酶的RecQ核心區(qū)域（642-1 290氨基酸序列）具有與全酶的相似活性［14］。

BLM解旋酶的核心區(qū)域主要包括解旋酶結(jié)構(gòu)域，C-末端保守序列（RecQ-Ct）和解螺旋酶RNA酶D C-末端結(jié)構(gòu)域（HRDC）3個(gè)結(jié)構(gòu)域［15］。解旋酶結(jié)構(gòu)域主要是由7個(gè)保守的氨基酸基序（motif）組成，其功能主要是間接或直接地結(jié)合DNA并誘導(dǎo)催化水解而促使解旋酶的易位和解鏈［16-18］。RecQCt結(jié)構(gòu)域有一個(gè)平臺(tái)型結(jié)構(gòu)，其中心是由4個(gè)半胱氨酸和一個(gè)Zn2+離子組成的α-螺旋結(jié)構(gòu)，側(cè)翼由螺旋狀的基序組成。RecQ-Ct結(jié)構(gòu)域的功能是BLM解旋酶與DNA的結(jié)合位點(diǎn)并介導(dǎo)其與參與DNA代謝的相關(guān)作用因子相互作用［17，19，20］。解旋酶結(jié)構(gòu)域和RecQ-Ct結(jié)構(gòu)域結(jié)合在一起形成了具有催化作用的解旋酶核心結(jié)構(gòu)域，其包含有ATP酶活性和DNA結(jié)合活性的必須的基序和結(jié)合位點(diǎn)［20］。HRDC結(jié)構(gòu)域位于解旋酶的C-末端，通過輔助結(jié)合DNA來(lái)調(diào)節(jié)解鏈功能，且可促進(jìn)并穩(wěn)定BLM解旋酶與DNA的結(jié)合，但不具有催化活性［20］。

BS患者的BLM的RecQ-Ct結(jié)構(gòu)域中的1 036位半胱氨酸突變已經(jīng)有報(bào)道，國(guó)際上已有研究報(bào)道單個(gè)半胱氨酸的突變對(duì)BLM解旋酶的生物活性的影響，但是多個(gè)位點(diǎn)同時(shí)突變的突變體活性研究尚無(wú)報(bào)道［15，21］。RecQ-Ct結(jié)構(gòu)域單點(diǎn)突變的研究表明了突變對(duì)酶活性有影響，但對(duì)ATPase和解鏈活性的影響有區(qū)別，其結(jié)果顯示，RecQ-Ct結(jié)構(gòu)域?qū)庑附Y(jié)構(gòu)域的活性有調(diào)節(jié)作用，但具體機(jī)制還不清楚［15，20］。本研究通過在BLM解旋酶結(jié)構(gòu)域985位和RecQ-Ct結(jié)構(gòu)域1 036位氨基酸殘基位點(diǎn)同時(shí)引入突變，構(gòu)建雙突變的重組大腸桿菌，運(yùn)用IPTG誘導(dǎo)其表達(dá)，在體外分離純化雙突變型BLM解旋酶，并對(duì)其進(jìn)行Western blotting鑒定，旨在為進(jìn)一步研究BS的致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

BLM642-1290重組大腸桿菌BL21菌株由法國(guó)巴黎第十一大學(xué)居里研究所的奚緒光主任研究員饋贈(zèng)；質(zhì)?；厥赵噭┖小NA快速膠回收試劑盒購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司；BL21（DE3+）菌株、Top10菌株、pMD?19-T Vector、pET-28a 質(zhì)粒、dNTP、Pfu高保真酶購(gòu)自TaKaRa；2×Taq PCR Master Mix購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中blm基因cDNA序列（CCDS10363.1），采用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物F和R，分別作為BLM642-1290的上下游引物：F1和R1互補(bǔ)，且都帶有一個(gè)突變位點(diǎn)985位密碼子GAA→GGA；F2、和R2互補(bǔ)，且都帶有一個(gè)突變位點(diǎn)1 036位密碼子TGC→TTC，引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，去離子水溶解，-20℃保存。3對(duì)引物序列如表1所示。

表1 重組PCR引物序列

1.2.2 PCR重組構(gòu)建突變基因

1.2.2.1 985位突變基因的構(gòu)建 提取BLM642-1290重組大腸桿菌BL21菌株質(zhì)粒，以提取的質(zhì)粒為模板，以F、R1為引物Pfu高保真酶擴(kuò)增上游片段P1，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性40 s，56℃退火30 s，72℃延伸60 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。以F1、R為引物Pfu高保真酶擴(kuò)增下游片段P2，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性40 s，56℃退火30 s，72℃延伸60 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。

膠回收上下游片段P1、P2，P1、P2以11比例混合Pfu高保真酶擴(kuò)增重組基因，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性40 s，59℃退火30 s，72℃延伸40 s，10個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。反應(yīng)完畢，加入引物F、R，94℃預(yù)變性5 min；94℃變性40 s，56℃退火30 s，72℃延伸60 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min，擴(kuò)增產(chǎn)物命名為T1，膠回收T1。

1.2.2.2 雙突變基因的構(gòu)建 以T1為模板，以F、R2為引物Pfu高保真酶擴(kuò)增上游片段P3，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性40 s，56℃退火30 s，72℃延伸60 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。以F2、R為引物Pfu高保真酶擴(kuò)增下游片段P4，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性40 s，56℃退火30 s，72℃延伸60 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。

膠回收上下游片段P3、P4和P3、P4以1∶1比例混合Taq酶擴(kuò)增重組基因，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性40 s，60℃退火30 s，72℃延伸40 s，10個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。反應(yīng)完畢，加入引物F、R，94℃預(yù)變性5 min；94℃變性40 s，56℃退火30 s，72℃延伸60 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min，擴(kuò)增產(chǎn)物命名為T2，膠回收T2。

1.2.3 突變基因的克隆 將回收的T2與pMD?19-T Vector 按試劑盒說明書反應(yīng)，構(gòu)建重組質(zhì)粒。構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)Top10菌株，篩選陽(yáng)性克隆。挑取陽(yáng)性克隆菌落擴(kuò)培提取質(zhì)粒測(cè)序。

1.2.4 突變表達(dá)載體pET-28a-BLM642-1290的構(gòu)建及菌株的保存 測(cè)序鑒定正確的突變體T克隆菌株接入液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，12 h后提取質(zhì)粒，XhoⅠ、EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶雙酶切，凝膠電泳，回收2000 bp DNA產(chǎn)物；雙酶切pET-28a空載體，膠回收酶切產(chǎn)物。按照瓊脂糖凝膠回收試劑盒說明切膠回收目的片段，將回收的pET-28a與突變BLM642-1290突變基因進(jìn)行定向連接，連接產(chǎn)物重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-BLM642-1290轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E. coli BL21（DE3+）。擴(kuò)培菌體提取質(zhì)粒，采用限制性內(nèi)切酶Xho I、EcoR I對(duì)提取的重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，酶切體系同pET-28a質(zhì)粒的酶切體系，酶切產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，同時(shí)以提取質(zhì)粒為模板，F(xiàn)、R為引物進(jìn)行PCR鑒定。

1.2.5 重組蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)、純化和鑒定 將重組大腸桿菌按11 000接種于2 mL含氨芐青霉素（Amp）的LB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過夜，次日以1∶100轉(zhuǎn)接入含100 μL/mL Amp的LB中，37℃振搖至OD600為0.6時(shí)，加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）使其終濃度為1 mmol/L，18℃繼續(xù)培養(yǎng)18 h后，離心收菌，加入上樣緩沖液，沸水浴5 min，離心1 min，上清用于SDS-PAGE檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。分離膠濃度為10%，濃縮膠為5%，120 V電泳約2 h，考馬斯亮藍(lán)染色。Western blotting檢測(cè)融合蛋白的免疫原性，以12 000稀釋His-tag一抗，12 500稀釋的標(biāo)記辣根過氧化物酶的抗羊血清為二抗，化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色。

2 結(jié)果

2.1 PCR重組構(gòu)建突變基因

運(yùn)用PCR對(duì)blm基因進(jìn)行重組構(gòu)建，理論上第一輪PCR上游片段P1為1 032 bp，下游片段P2為915 bp，重組后T1全長(zhǎng)1 947 bp；第二輪重組PCR上游片段P3為1 185 bp，下游片段P4為762 bp，重組后T2全長(zhǎng)1 947 bp。試驗(yàn)其結(jié)果見圖1和圖2，PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠檢測(cè)顯示得到的目的條帶大小與理論值一致，由以上結(jié)果可知突變型的blm基因構(gòu)建成功。

2.2 測(cè)序結(jié)果在NCBI中的BLAST分析

對(duì)構(gòu)建好的突變基因進(jìn)行測(cè)序，并對(duì)序列進(jìn)行在線分析，利用BLAST-N程序在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行相似性檢索。結(jié)果（圖3）顯示，與正常BLM基因序列對(duì)比，blm基因985位密碼子由GAA（Glu）突變?yōu)镚GA（Gly），1 036位密碼子TGC（Cys）突變?yōu)門TC（Phe）。同時(shí)其他片段無(wú)隨機(jī)突變發(fā)生，結(jié)果顯示突變基因構(gòu)建成功。

2.3 重組表達(dá)質(zhì)粒酶切鑒定

提取重組大腸桿菌質(zhì)粒，采用限制性內(nèi)切酶XhoⅠ、EcoRⅠ對(duì)提取的重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，同時(shí)以提取質(zhì)粒為模板，F(xiàn)、R為引物進(jìn)行PCR鑒定。結(jié)果（圖4）顯示，2 000 bp左右均有目的基因片段。說明突變基因已經(jīng)成功的連入表達(dá)質(zhì)粒中。

2.4 重組蛋白的表達(dá)

融合蛋白的大小約72 kD，純化后表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上進(jìn)行Western blotting，結(jié)果（圖5，圖6）顯示，表達(dá)產(chǎn)物能被His-tag抗體識(shí)別，在約72 kD 處顯示明顯的條帶，證明目的基因在載體中成功表達(dá)。

3 討論

目前我們已經(jīng)研究了野生型BLM解旋酶在體外表達(dá)的生物學(xué)性質(zhì)［22，23］。本研究通過重組PCR成功構(gòu)建了BLM642-1290解旋酶定點(diǎn)突變基因，并將其克隆至原核表達(dá)載體中進(jìn)行表達(dá)，經(jīng)蛋白印記驗(yàn)證，得到了目的蛋白。

臨床發(fā)現(xiàn)，BLM解旋酶核心區(qū)域的7個(gè)氨基酸位點(diǎn)突變會(huì)引發(fā)BS，5個(gè)位于解旋酶活性中心結(jié)構(gòu)域，兩個(gè)位于RecQ-Ct結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸位點(diǎn)［24］。這為研究BLM在BS中的作用提供了充分的證據(jù)，但是其在細(xì)胞代謝中的具體機(jī)制尚不清楚。

通過體外構(gòu)建定點(diǎn)突變基因，可以迅速獲得突變體研究所需的材料，分析分子機(jī)理。傳統(tǒng)的體外定點(diǎn)突變技術(shù)多采用寡核苷酸引物介導(dǎo)的突變法，突變僅僅限于5'端 ，PCR技術(shù)的發(fā)展提供了體外定點(diǎn)突變的新手段，可在DNA片段的任何位置定點(diǎn)突變［25］。本試驗(yàn)在操作中，減少其他位點(diǎn)隨機(jī)突變的可能性，在第二次PCR擴(kuò)增時(shí)采用純化后的上下游基因片段作為模板，優(yōu)化復(fù)性與延伸溫度。通過重組PCR進(jìn)行基因突變克隆，操作簡(jiǎn)便，只需進(jìn)行常規(guī)的PCR操作，引物無(wú)需磷酸化，成本低效率高，能100%在希望突變的位點(diǎn)引入特定的突變。而且本試驗(yàn)以第一次回收的PCR產(chǎn)物作為模板，在第一個(gè)突變的基礎(chǔ)上再次引入第二個(gè)突變，簡(jiǎn)化了試驗(yàn)操作；理論上需要引入幾個(gè)突變就可以通過幾次重組PCR來(lái)實(shí)現(xiàn)，只需采用常用的試驗(yàn)技術(shù)即可達(dá)到試驗(yàn)?zāi)康?。測(cè)序結(jié)果表明，在預(yù)定位置引入了定點(diǎn)突變，因此設(shè)計(jì)是合理的。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)利用PCR技術(shù)將blm基因第985位密碼子和1 036位密碼子成功進(jìn)行了定點(diǎn)突變，并得到了純度較高的雙突變BLM解旋酶，為下一步的工作將研究突變蛋白的生物活性奠定了基礎(chǔ)，從而在蛋白質(zhì)水平上進(jìn)一步闡明突變導(dǎo)致BS的發(fā)病機(jī)制以及探討B(tài)LM解旋酶結(jié)構(gòu)和功能之間關(guān)系。

［1］ Bachrati CZ, Hickson ID. RecQ helicases：suppressors of tumorigenesis and premature aging［J］. Biochem J, 2003, 374（Pt3）：577-606.

［2］ Mounira AG. Bloom syndrome, genomic instability and cancer：the SOS-like hypothesis［J］. Cancer Letters, 2006, 236（1）：1-12.

［3］ Wong I, Moore JKM, Bjornson KP, et al. ATPase activity of Escherichia coli Rep helicase is dramatically dependent on DNA ligation and protein oligomeric states［J］. Biochemistry, 1996, 35（18）：5726-5734.

［4］ Brosh RM, Karmakar P, Sommers JA, et al. p53 modulates the exonuclease activity of Werner syndrome protein［J］. J Biol Chem, 2001, 276（37）：35093-35102.

［5］ Brosh RM, Von Kobbe C, Sommers JA, et al. Werner syndrome protein interacts with human flap endonuclease 1 and stimulates its cleavage activity［J］. EMBO J, 2001, 20（20）：5791-5801.

［6］ Lindor NM, Furuichi Y, Kitao S, et al. Rothmund-Thomson syndrome due to RECQ4 helicase mutations：report and clinical and molecular comparisons with Bloom syndrome and Werner syndrome［J］. Am J Med Genet, 2000, 90（3）：223-228.

［7］ Kitao S, Ohsugi I, Ichikawa K, et al. Cloning of two new human helicase genes of the RecQ family：biological significance of multiple species in higher eukaryotes［J］. Genomics, 1998, 54（3）：443-452.

［8］ Hickson ID. RecQ helicases：caretakers of the genome［J］. Nature Reviews Cancer, 2003, 3：169-178.

［9］ Cheok CF, Bachrati CZ, Chan KLC, et al. Roles of the Bloom’s syndrome helicase in the maintenance of genome stability［J］. Biochemical Society Transactions, 2005, 33：1456-1459.

［10］ German J. Bloom syndrome：a Mendelian prototype of somatic mutational disease［J］. Medicine（Baltimore）, 1993, 72（6）：393-406.

［11］ Bachrati CZ, Hickson ID. RecQ helicases：guardian angels of the DNA replication fork［J］. Chromosoma, 2008, 117（3）：219-233.

［12］ Thompson LH, Schild D. Recombinational DNA repair and human disease［J］. Mutat Res, 2002, 509（1-2）：49-78.

［13］ Xi XG. Helicases as antiviral and anticancer drug targets［J］. Current Medicinal Chemistry, 2007, 14（8）：503-517.

［14］ Janscak P, Garcia PL, Hamburger F, et al. Characterization and mutational analysis of the RecQ core of the bloom syndrome protein［J］. J Mol Biol, 2005, 330（1）：29-42.

［15］ Guo RB, Rigolet P, Zargarian L. Structural and functional characterizations reveal the importance of a zinc binding domain in Bloom’s syndrome helicase［J］. Nucleic Acids Research, 2005, 33（10）：3109-3124.

［16］ Korolev S, Hsieh J, Gauss GH, et al. Major domain swiveling revealed by the crystal structures of complexes of E. coli Rep helicase bound to single-stranded DNA and ADP［J］. Cell, 1997, 90（4）：635-647.

［17］ Sengoku T, Nureki O, Nakamura A, et al. Structural basis for RNA unwinding by the DEAD-box protein Drosophila Vasa［J］. Cell, 2006, 125（2）：287-300.

［18］ Yankiwski V, Noonan JP, Neff NF. The C-terminal domain of the Bloom syndrome DNA helicase is essential for genomic stability［J］. BMC Cell Biol, 2001, 2：11-20.

［19］ Bernstein DA, Zittel MC, Keck JL. High-resolution structure of the E.coli RecQ helicase catalytic core［J］. EMBO J, 2003, 22（19）：4910-4921.

［20］ Liu Z, Macias MJ, Bottomley MJ, et al. The three-dimensional structure of the HRDC domain and implications for the Werner and Bloom syndrome proteins［J］. Structure Fold Des, 1999, 7（12）：1557-1566.

［21］ Ellis NA, Groden J, Ye T. Bloom’s syndrome gene product is homologous to RecQ helicases［J］. Cell, 1995, 83（4）：655-666.

［22］ Chen X, Luo H, Duan LX, et al. Research on prokaryocyte expression and biological activity of the core region of Bloom’s syndrome protein［J］. African Journal of Biotechnoogy, 2010, 9（50）：8520-8529.

［23］ Chen X, Luo H, Duan LX, et al. Effects of mercury on the structure and Activity of BLM642-1290helicase［J］. Biomedical and Environmental Sciences, 2011, 24（1）：47-55.

［24］ Dillingham MS, Soultanas P, Wiley P, et al. Defining the roles of individual residues in the single-stranded DNA binding site of PcrA helicase［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98（15）：8381-8387.

［25］ 閆振文, 梁秀齡, 楊春水. PCR技術(shù)對(duì)Wilson病基因進(jìn)行定點(diǎn)突變的研究［J］.中山醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2002, 23（2）：94-96.