單分子技術研究T 7解旋酶的解旋與換鏈?

陳澤 馬建兵 黃星榞 賈棋 徐春華張慧東 陸穎?

1 引 言

解旋酶是一類在細胞內廣泛存在的分子馬達蛋白,種類繁多.不同解旋酶具有不同的功能及特性,在脫氧核糖核酸(DNA)復制、轉錄、修復、重組以及端粒穩(wěn)定等諸多方面都發(fā)揮著不可忽視的作用[1?3].人體內的諸多過程都涉及數(shù)量龐大的生物分子,常規(guī)的實驗方法僅能檢測初始態(tài)和終態(tài)的平均效應結果,不僅僅忽略了更為關鍵的中間過程,也缺少對于生物個體差異性和多樣性的分析.單分子技術是近些年發(fā)展起來的一種先進實驗技術,能夠用于針對單個生物分子的研究,以得到常規(guī)技術無法得到的諸多重要信息[4].近些年來,單分子技術越來越多地運用到解旋酶的相關研究中,使得科研人員對于解旋酶的功能和機制的認知越來越清晰.解旋酶在解旋過程中進行的換鏈現(xiàn)象是其功能中非常重要的一項,這種換鏈現(xiàn)象對于解旋酶而言,能夠在其遭遇各類DNA損傷時,避免發(fā)生停滯而導致復制體崩解,乃至細胞死亡;同時,能夠以此方式消除結合在DNA上的內源性中間產物及單鏈DNA結合蛋白,確保解旋過程的順利進行[5];最后,換鏈現(xiàn)象還能夠直接參與到同源重組的過程中,并發(fā)揮作用.因此,深入研究解旋酶進行換鏈的機制具有重要意義和價值.

目前運用單分子技術的相關研究表明,諸如Pif1[6],RecQ[7],BLM[5]及UvrD[8]等非環(huán)狀解旋酶在解旋過程中是存在換鏈現(xiàn)象的.研究Pif1換鏈過程的文獻[6]提及,其發(fā)生換鏈的原因在于Pif1可能與3′-尾鏈之間存在一個相互作用,這種相互作用會將Pif1從5′-鏈拉至3′-鏈, 并在此鏈上繼續(xù)行走,而解開部分的單鏈DNA退火重新形成雙鏈DNA.對于六聚體解旋酶而言,因其6個子單位形成環(huán)狀結構,人們總是直觀地認為這種結構會穩(wěn)定地存在于單鏈DNA上而無法自由脫落下來.基于這種猜想,科研人員認為六聚體解旋酶是通過從單鏈DNA的端口處直接穿入的方式進行加載,并進一步結合在單鏈DNA上進行行走.如果是這種加載方式,六聚體解旋酶無疑是無法發(fā)生換鏈過程的.然而,不論是磁鑷(magnetic tweezers,MT)實驗還是光鑷實驗[9,10],單鏈DNA的兩端均被固定,不存在所謂的自由端口.而在溶液中已形成六聚體的解旋酶依舊能夠直接加載在單鏈DNA上進行行走和解旋,說明這種加載方式并不準確.因此,本文以此作為切入點,以T7解旋酶為研究對象,力求揭示六聚體解旋酶是否能夠進行換鏈的問題.

本文主要采用的單分子技術為單分子熒光共振能量轉移(single-molecule fl uorescence resonance energy transfer,smFRET)和MT.熒光共振能量轉移(FRET)是一種通過兩個熒光基團之間無輻射的偶極耦合的相互作用來進行能量轉移的方式.能量通常由供體熒光基團(短波長)傳遞給受體熒光基團(長波長).本文用于smFRET的儀器裝置為常規(guī)的全內反射顯微系統(tǒng),為消除其余因素對于信號的影響,生物分子被固定在玻片表面.MT技術是將單個生物分子通過相應修飾后使其一端連接在玻片表面,另一端連接在超順磁性小球表面.磁球位于外磁場中而受到恒定磁力的作用,通過改變磁場強度(平移或者旋轉裝置上磁鐵)可以實現(xiàn)拉伸或旋轉磁球等操縱,從而實現(xiàn)對于單個生物分子的力學操縱.本文采用常規(guī)的縱向MT開展研究.

通過運用smFRET和MT技術,本文能夠實時地觀測DNA底物被T7解旋酶解開的動態(tài)過程,進而能夠得到解旋過程的具體信息,便于分析解旋酶的解旋機制.運用smFRET技術研究解旋反應能夠觀測的解旋長度較短(<10 bp),但是其精度非常高,對于精確研究較小尺度內的解旋過程和機制有得天獨厚的優(yōu)勢.本文研究的主要問題是六聚體解旋酶的換鏈現(xiàn)象,因此采用smFRET技術能夠更精確地觀測此過程;運用MT技術研究解旋反應能夠觀測的解旋長度較大,但是其精度比不上smFRET技術.本文運用MT技術在大尺度上觀測這種換鏈現(xiàn)象是否依舊存在,并進一步分析施加力的作用是否會對其產生影響.因此,本文同時采用了smFRET和MT兩種技術進行實驗,以達到研究目的.

解旋實驗通過改變熒光標記DNA的方法以及改變GC含量和脫氧胸苷三磷酸(dTTP)濃度等實驗條件,深入地探究了T7解旋酶是否如單體解旋酶一樣存在換鏈過程.實驗結果表明T7解旋酶的解旋工作需要3′-尾鏈的參與,且DNA序列中GC含量的提高能夠導致其更易發(fā)生回退;在所有的回退現(xiàn)象中存在著一種緩慢回退的現(xiàn)象,我們推測該現(xiàn)象為六聚體解旋酶的換鏈過程,并提出其模型.

2 實驗方法和材料

2.1 玻片的清洗與修飾

先后用丙酮、甲醇、濃硫酸和過氧化氫混合液(體積比7:3)及乙醇鈉對FRET實驗用蓋玻片和載玻片進行徹底清洗,蓋玻片需要進一步進行硅烷化和聚乙二醇(PEG,購于Laysan Bio,Inc.公司)修飾,具體方法參照文獻[11];MT實驗用蓋玻片和載玻片清洗方法同于FRET實驗用玻片,后期需要進一步用Sigmacote(購于Sigma-Aldrich公司)修飾,具體方法參照文獻[12].

2.2 DNA設計

單分子FRET實驗用DNA共5種:一種是不存在3′-尾鏈的雙鏈DNA底物,于雙鏈岔口標記Cy3和Cy5熒光分子,序列中GC含量設計為70%;一種是3′-尾鏈為單鏈結構的雙鏈DNA底物,標記方法與前相同,序列中GC含量設計為70%;另外3種3′-尾鏈均為雙鏈但留有1 nt單鏈結構的雙鏈DNA底物,Cy3標記在雙鏈上第8位,Cy5標記在岔口,序列中GC含量分別設計為50%,70%和100%.所有DNA底物均通過在一條鏈尾端修飾生物素連接在玻片上.DNA底物均購于生工生物工程(上海)股份有限公司,詳細制備方法見文獻[13].MT實驗用DNA是輪廓長度為0.5μm帶有270 bp發(fā)卡結構的雙鏈DNA,詳細制備方法見文獻[6].

2.3 蛋白質及緩沖液

T7 gp4解旋酶蛋白由陸軍軍醫(yī)大學毒理學研究所張慧東課題組純化完成,具體方法見文獻[14,15].蛋白純化完成后,在盛有儲存液(50 mM(1 M=1 mol/L)K-phosphate,0.1 mM乙二胺四乙酸(EDTA),0.1 mM二硫蘇糖醇(DTT)及50%甘油)的燒杯中進行透析,并于?30?C密封保存.實驗所用的緩沖液包括:T50緩沖液(50 mM NaCl及20 mM Tris-HCl,pH值為8.0),反應緩沖液(10 mM MgCl2,50 mM NaCl,5 mM DTT及20 mM Tris-HCl,p H值為8.0)以及磷酸緩沖鹽溶液(PBS緩沖液)(20 mM Na2HPO4,150 mM NaCl,p H值為8.0).緩沖液配置后需要進行高溫消毒,再經孔徑為0.2μm的過濾器過濾,最后于?20?C密封保存.

2.4 解旋實驗方法

MT實驗中,首先取磁球原液10μL,加入20μL PBS緩沖液并用移液槍吹打清洗,隨后用磁鐵吸引磁球去除上清液,反復操作3次,最后稀釋至20μL.隨后,取1μL 100 p M的DNA底物(帶有270 bp發(fā)卡結構)與磁球稀釋液充分混勻1 min.將上述混合液泵入實驗槽中,孵育10 min使得磁球充分連接在玻片表面,并沖走多余未連接磁球.具體的磁球尺寸、修飾方法及操作方法見文獻[6].通過檢測連接磁球上的DNA底物為單根且較為穩(wěn)定后,開始進行下一步解旋實驗.首先將高濃度gp4單體解旋酶與2 mM d TTP混勻孵育10 min,使其充分形成六聚體結構.隨后在上述混合液中加入T50緩沖液及DTT,通過恒流泵泵入槽中,孵育10 min使得T7解旋酶充分結合在DNA底物上,且因沒有鎂離子而無法啟動解旋反應.當孵育完成后,泵入T50緩沖液充分沖掉槽中多余的解旋酶,確保后續(xù)為單個解旋酶進行反應.最后,泵入含鎂離子的反應緩沖液,實驗濃度d TTP及DTT啟動解旋反應,收集實驗數(shù)據(jù);smFRET實驗中,首先取1μL鏈霉親和素原液(1 mg/mL),用T50緩沖液稀釋至100μL,充分混勻后加入實驗槽中孵育5 min.隨后沖走多余鏈霉親和素,加入約100 pM帶熒光標記的DNA底物孵育5 min.隨后沖走多余DNA,觀察DNA連接情況良好后進行下一步解旋實驗,具體的原料來源、修飾方法及操作方法見文獻[13].后續(xù)解旋實驗的步驟與MT實驗的步驟保持一致,只是需要在啟動解旋反應并收集數(shù)據(jù)的泵入反應液中加入抗熒光淬滅體系(0.8%D-葡萄糖,1 mg/mL葡糖氧化酶,0.4 mg/mL過氧化氫酶和1 mM水溶性維生素E).

3 結果與討論

3.1 T 7解旋酶的解旋反應

T7解旋酶是5′-3′方向行走的解旋酶,因此正常的解旋反應需要足夠長的5′-尾鏈用于解旋酶結合.有研究表明,T7解旋酶的解旋反應還需要3′-尾鏈的存在,認為其與3′-尾鏈之間存在著某種相互作用[16,17],并發(fā)現(xiàn)3′-尾鏈的單鏈部分長度必須大于7 nt時,T7解旋酶才能夠正常進行解旋反應.那么T7解旋酶是怎樣與3′-尾鏈上DNA進行相互作用的呢?為此,本文設計了一組DNA底物進行實驗,其5′-尾鏈均有30 nt的單鏈以供解旋酶結合,3′-尾鏈分別設計為不存在尾鏈、存在30 nt單鏈的尾鏈及存在29 bp雙鏈及1 nt單鏈的尾鏈結構,如圖1(a),(c),(e)所示.

FRET解旋實驗使用的DNA底物均為帶有熒光標記的雙鏈DNA,Cy3標記在3′-鏈,Cy5標記在解旋酶結合的5′-鏈上.實驗是通過532 nm激光激發(fā)Cy3發(fā)出熒光,并通過能量轉移而使得Cy5同樣發(fā)出熒光.因此,隨著解旋酶解開雙鏈DNA,Cy3和Cy5之間距離增大,能量轉移效率(FRET值)隨之降低.當解旋酶完全解開雙鏈DNA,即解旋到頭時,Cy3標記的3′-鏈會因為雙鏈部分完全打開而脫落,導致Cy3熒光強度和Cy5熒光強度均迅速降低至0,由此現(xiàn)象來判斷解旋酶是否解旋到頭[18].

通過解旋實驗,發(fā)現(xiàn)T7解旋酶在無3′-尾鏈結構參與的條件下無法進行解旋反應,如圖1(b)所示,Cy3和Cy5之間距離一直保持不變,FRET值維持為1.說明以往研究中提及的解旋酶與3′-尾鏈之間存在相互作用的結論是成立的.當缺乏這種相互作用時,解旋酶就無法進行解旋[16,17].3′-尾鏈設計為單鏈DNA和雙鏈DNA結構的實驗結果如圖1(d)和圖1(f)所示,當3′-尾鏈為單鏈DNA時,因Cy3和Cy5距離很近,初始FRET值為1.隨著解旋反應的進行,Cy3和Cy5的距離逐漸變大而導致Cy3熒光強度不斷增加,Cy5熒光強度不斷降低,FRET值隨之不斷降低,最終完全解開雙鏈;當3′-尾鏈為雙鏈DNA時,初始FRET值約為0.9,隨著解旋反應的進行與前者有著相似的現(xiàn)象.

本文的實驗結果說明3′-尾鏈的存在對于T7解旋酶進行解旋反應尤為重要,即此解旋酶行使其解旋功能需要DNA底物為叉形結構.由于3′-尾鏈為單鏈或雙鏈結構的實驗結果并無本質不同,本文推測T7解旋酶或與3′-尾鏈上磷酸根結構域存在著某種相互作用.

圖1 不同3′-尾鏈結構DNA底物的sm FRET解旋現(xiàn)象 (a)不存在3′-尾鏈結構時DNA底物的實驗示意圖;(b)對應(a)圖DNA底物的T 7解旋酶解旋數(shù)據(jù);(c)3′-尾鏈為單鏈DNA結構時DNA底物的實驗示意圖;(d)對應(c)圖DNA底物的T7解旋酶解旋數(shù)據(jù);(e)3′-尾鏈為雙鏈DNA結構時DNA底物的實驗示意圖;(f)對應(e)圖DNA底物的T 7解旋酶解旋數(shù)據(jù)Fig.1.Observation of DNA with diff erent 3′-tail structures unwinding with smFRET assay:Schematic diagram of the smFRET experiment in DNA substrate with diff erent 3′-tail structures(a),(c)and(e);smFRET-time traces showing from three diff erent structures of DNA,respectively(b),(d)and(f).

3.2 序列中GC含量對T 7解旋酶解旋反應的影響

已有研究表明,解旋部分的DNA序列中GC含量越高,T7解旋酶的解旋速率越慢[18,19].然而,人們并沒有關注到這種GC含量的提高是否會影響其解旋長度.常規(guī)實驗方法受限于技術并不能解決此問題,而以往FRET實驗所采用的熒光標記手段,當解旋長度很短時并不能檢測到相應FRET值的變化.基于此,本文在實驗設計序列中包含50%,70%和100%GC含量的3種DNA底物,采用上述改良的熒光標記方法如圖1(c)所示,運用sm-FRET技術進行T7解旋酶的解旋實驗,解旋數(shù)據(jù)和解旋是否到頭的判定方法與圖1標準保持一致.

本文在設計實驗用DNA底物時參考最近運用smFRET技術研究T7解旋酶的文獻[18].如文獻[18]中所描述的,當DNA序列中GC含量為35%時,解旋速率為8 bp/s;而GC含量為80%時,其解旋速率僅為4 bp/s,這也是其使用的最大GC含量的DNA底物.由文獻[18]可知,提高GC含量能夠更加明顯地觀測解旋酶進行解旋的中間過程.因此,本文在設計實驗時,為降低實驗中的解旋速率以便更加精確地評估其解旋過程,同時為設計一組GC含量變化梯度比較其解旋長度的變化情況,決定將實驗中DNA序列的GC含量確定為50%,70%和100%.

另一方面,文獻[18]中提及降低d TTP濃度能夠降低解旋速率,本文實驗通過改變d TTP濃度梯度,發(fā)現(xiàn)100μM d TTP濃度條件下能夠明顯降低解旋酶的解旋速率,便于觀測解旋中間過程,且不至于明顯影響解旋酶的解旋比例.因此,本文解旋實驗均在100μM d TTP濃度條件下進行.

由圖2結果可知,當序列中GC含量為50%時,T7解旋酶解旋到頭的實驗數(shù)據(jù)比例約為78%,解旋中途回退的比例約為22%;當序列中GC含量為70%時,T7解旋酶解旋到頭的實驗數(shù)據(jù)比例約為61%,解旋中途回退的比例約為39%;當序列中GC含量為100%時,T7解旋酶解旋到頭的實驗數(shù)據(jù)比例僅約為21%,解旋中途回退的比例約為79%.由此可知,GC含量從50%提高至100%時,會明顯提高解旋酶在解旋過程中發(fā)生回退的概率,導致其解旋長度降低.

在解旋過程中,這種回退現(xiàn)象發(fā)生的前提是解旋酶無法繼續(xù)進行解旋反應而發(fā)生暫?；蛲?然而,這種暫?；蛲F(xiàn)象并不能穩(wěn)定維持,解旋酶會進一步失去與單鏈DNA之間的相互作用.此時,解旋酶或直接從單鏈DNA上脫落下來,解開部分單鏈自由退火形成雙鏈;或解旋酶雖然缺失與單鏈DNA的相互作用,但并未脫落,解開部分單鏈仍然自由退火而形成雙鏈,解旋酶滑退回初始位置.從實驗數(shù)據(jù)上看,當DNA序列為全GC時,T7解旋酶大多數(shù)都無法解旋到頭.

因此,我們認為DNA序列中GC含量高,不僅會影響解旋酶的解旋速率,還會導致其更易發(fā)生暫?；蛲?進而發(fā)生回退現(xiàn)象,使得解旋長度明顯降低.分析其原因,可能是解旋酶在解旋過程中不僅受到當前解旋位置堿基對之間氫鍵作用力的限制,后續(xù)DNA序列的穩(wěn)定程度也會對其解旋過程造成影響.當DNA序列中GC含量非常高,乃至為GC含量為100%時,這種穩(wěn)定程度可能會使得解旋酶難以克服而無法繼續(xù)往前解旋.

3.3 T 7解旋酶在解旋過程中的回退現(xiàn)象

3.2 節(jié)提及當GC含量為100%時,T7解旋酶在解旋過程中大多數(shù)無法解旋到頭而在中途發(fā)生回退.通過進一步分析數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)大多數(shù)的回退現(xiàn)象是瞬時回去的過程,如圖3(a)所示.但是,實驗數(shù)據(jù)中還存在一種緩慢回退的現(xiàn)象,如圖3(b)所示.這里對于瞬時回退和緩慢回退兩種現(xiàn)象的界定在于前者在回到初始位置的過程中并不存在停頓或過程,分析僅為一步完成;而后者在回到初始位置的過程中存在諸多的停頓或過程,從實驗數(shù)據(jù)上來看,可以觀測到許多的數(shù)據(jù)點存在于這一回退過程中,分析為多步完成.因此,瞬時回退現(xiàn)象并不代表其是一瞬間回到初始位置,相對于緩慢回退來講,這里的瞬時指的是回退過程中不存在中間步驟,而緩慢指的是回退過程中存在諸多中間步驟.

圖2 三種不同GC含量DNA底物的T 7 gp4解旋現(xiàn)象 (a)DNA底物GC含量為50%;(b)DNA底物GC含量為70%;(c)DNA底物GC含量為100%Fig.2.Analysis of unwinding processivity of T7 gp4 helicase in DNA substrate with diff erent GC contents:(a)Helicase in DNA substrate with 50%GC content;(b)helicase in DNA substrate with 70%GC content;(c)helicase in DNA substrate with 100%GC content.

通過進一步統(tǒng)計數(shù)據(jù)可知,所有的實驗數(shù)據(jù)中存在瞬時回退現(xiàn)象的比例約為81%,而存在緩慢回退現(xiàn)象的比例約為19%.對于前者而言,當T7解旋酶無法繼續(xù)解旋而發(fā)生暫?；蛲r,因無法穩(wěn)定維持此狀態(tài),解旋酶或從單鏈DNA上脫落而解開部分單鏈因退火壓力而自由形成雙鏈;或雖失去與單鏈DNA的相互作用但繼續(xù)留在5′-鏈上,解開部分單鏈自由退火而形成雙鏈,解旋酶滑退回初始位置.這兩個過程都非常快而導致觀察幾乎是瞬時的,不存在中間步驟.同時,因這兩個過程僅僅是T7解旋酶的狀態(tài)存在區(qū)別,DNA底物的狀態(tài)是一致的,而FRET實驗的觀測對象是熒光標記DNA,所以無法區(qū)分這兩種情況,均算入瞬時回退現(xiàn)象中.在圖3(a)的時間曲線中,隨著T7解旋酶解開雙鏈,FRET值逐漸降低至約0.1.此時,解旋酶因無法繼續(xù)解旋而在5′-鏈上滑退回初始位置或直接從DNA底物上脫落下來,解開雙鏈DNA迅速退火重新形成雙鏈DNA而導致FRET值恢復初始值.圖3(a)所示實驗現(xiàn)象在文獻[9]中也有所提及.而對于少數(shù)情況下解旋酶發(fā)生緩慢回退的現(xiàn)象,以往并沒有研究發(fā)現(xiàn).

通過分析相關文獻,發(fā)現(xiàn)早期研究中,如果改變DNA底物迫使T7解旋酶必須由3′到5′方向進行解旋時,完全無法觀察到解旋現(xiàn)象[20?23].因此,T7解旋酶僅能從5′到3′方向進行單向的行走和解旋,而完全無法從3′到5′方向進行行走和解旋,將這種現(xiàn)象稱為T7解旋酶的極性,也稱為單向性.此外,這種極性不僅僅存在于T7解旋酶,經過研究諸多解旋酶都被證實存在極性,僅能沿著單向進行行走和解旋.因此,反觀本文的實驗數(shù)據(jù),如果這種緩慢回退的現(xiàn)象發(fā)生在5′-鏈,表明T7解旋酶是從3′到5′方向進行行走,這種現(xiàn)象在以往的研究中完全未被觀察到,且不符合公認的解旋酶具有極性的結論.因此,本文認為這種緩慢回退的現(xiàn)象是發(fā)生在3′-鏈上,而不可能發(fā)生在5′-鏈上. 換而言之,這一現(xiàn)象預示著T7解旋酶換到了對面的3′-鏈上,即這個六聚體解旋酶在解旋過程中發(fā)生了換鏈現(xiàn)象.

圖3 T 7解旋酶的兩種回退現(xiàn)象(100%GC) (a)瞬時回退;(b)緩慢回退Fig.3.Two diff erent backward movements of T 7 helicase(100%GC):(a)Rapid rewinding process;(b)slow rewinding process.

3.4 運用M T技術研究T 7解旋酶的緩慢回退現(xiàn)象

基于上述結果和猜想,進一步設計MT實驗進行研究,DNA連接方式如圖4(a)所示.d TTP濃度及序列中GC含量均保持與FRET實驗一致,實驗方法參照文獻[18]中的步驟,確保均由單個解旋酶進行解旋反應.MT實驗中使用的DNA底物解旋部分發(fā)卡結構長度為270 bp,隨著解旋酶解旋反應的進行,發(fā)卡結構逐漸被打開,檢測到磁球高度發(fā)生相應變化,由此來判斷是否為解旋數(shù)據(jù).通過計算解旋酶解開的發(fā)卡結構長度是否到達270 bp,來判斷解旋酶是否完成解旋反應,即解旋到頭.

如圖4(b)所示,當T7解旋酶解旋到頭,即完全解開發(fā)卡結構DNA時,其會沿著3′-鏈繼續(xù)行走回到初始位置.從數(shù)據(jù)上來看,這種行走并不是瞬時過程,而是有一定中間步驟的過程.其速度大于在5′-鏈上進行解旋的速度,可能是由于DNA雙鏈退火壓力加快了這一行走速度.當T7解旋酶并沒有完全打開發(fā)卡結構DNA而停止解旋時,從數(shù)據(jù)上看多數(shù)情況下會瞬時回到初始位置,而少數(shù)情況下是一種緩慢回退的過程,如圖4(c)和圖4(d)所示.運用MT技術進行解旋實驗得到的未解旋到頭的數(shù)據(jù)中,瞬時回退現(xiàn)象所占比例約為76%,緩慢回退現(xiàn)象所占比例約為24%,基本與FRET實驗得到的結果保持一致.這種未解旋到頭且發(fā)生緩慢回退的現(xiàn)象區(qū)別于圖4(b)中的現(xiàn)象,其并不是因為解旋到頭而直接移動到3′-鏈上沿著5′到3′方向行走.如果此時解旋酶依舊位于5′-鏈上,這種緩慢回退的行走方式并不符合T7解旋酶僅能由5′到3′單向移動的單向性或極性[16,20?25].另一方面,不論是本文實驗還是已發(fā)表文獻中的實驗[9,10],已形成環(huán)狀六聚體的T7解旋酶都能夠直接結合在沒有5′和3′端口的單鏈DNA上開始行走和解旋,說明其也能以相同的方式從此單鏈DNA上脫落下來.同時,MT實驗中觀測到的這種緩慢回退的現(xiàn)象與FRET實驗中觀測到的現(xiàn)象基本保持一致,相互印證.由此可知,這種緩慢回退的現(xiàn)象是因為T7解旋酶在解旋過程中發(fā)生了換鏈現(xiàn)象,且這種換鏈現(xiàn)象與DNA底物以及施加其上的力沒有關系,它是T7解旋酶的一種本征性質.

圖4 MT實驗研究T 7解旋酶的緩慢回退現(xiàn)象 (a)單分子MT實驗示意圖;(b)T 7解旋酶在解旋到頭時,緩慢行走的實驗現(xiàn)象;(c)T7解旋酶在未解旋到頭時,瞬時回退的實驗現(xiàn)象;(d)T7解旋酶在未解旋到頭時,緩慢回退的實驗現(xiàn)象Fig.4.The slow rewinding process of T 7 helicase by magnetic tweezers:(a)Schematic diagram of the magnetic tweezers assay;(b)slow translocation phenomenon of T 7 helicase after unwinding the whole DNA hairpin;(c)rapid rewinding process of T 7 helicase during unwinding;(d)slow rewinding process of T 7 helicase during unwinding.

3.5 T 7解旋酶換鏈機制的模型

研究表明,T7解旋酶可能是以一種開環(huán)的方式結合在單鏈DNA上,而非通常認知的環(huán)狀解旋酶整體從5′端口進入[26].基于此,T7解旋酶在解旋過程中也存在很大可能性發(fā)生開環(huán)而直接從單鏈DNA上解離而脫落下來.從本文實驗結果和以往的文獻結論來看[16,17],T7解旋酶的解旋反應必須有3′-尾鏈的參與,推測解旋酶在解旋過程中可能與3′-尾鏈之間存在某種相互作用.綜上所述,我們推測這種緩慢回退的現(xiàn)象是T7解旋酶在解旋過程中發(fā)生暫?；蛲r,進一步發(fā)生換鏈現(xiàn)象而轉移至3′-鏈上,沿著5′到3′的方向進行行走回到初始位置.

基于此,本文進一步提出了T7解旋酶進行換鏈過程的模型,如圖5所示.圖5(a)表示的是T7解旋酶在解旋過程中發(fā)生暫停或停滯時無法繼續(xù)進行解旋的狀態(tài).我們推測解旋酶與3′-尾鏈之間存在一個相互作用位點,用紅色圓點進行標示.當T7解旋酶并不發(fā)生開環(huán)現(xiàn)象時,它不能從單鏈DNA上脫落下來而繼續(xù)留在鏈上.此時,解旋酶和單鏈DNA均處于完全自由狀態(tài),解開部分的單鏈DNA會自由退火形成雙鏈DNA,解旋酶會因受到退火壓力的作用而沿著5′-鏈快速滑退回到初始位置,如圖5(b)所示,實驗數(shù)據(jù)中表現(xiàn)為瞬時回退現(xiàn)象;當T7解旋酶在發(fā)生暫?；蛲耐瑫r發(fā)生開環(huán)現(xiàn)象而完全從單鏈DNA上脫落下來時,解開部分單鏈自由退火形成雙鏈DNA,實驗數(shù)據(jù)中同樣表現(xiàn)為瞬時回退現(xiàn)象,因采用的單分子技術檢測的對象為DNA底物而無法與圖5(b)中的情況進行區(qū)分;當這種開環(huán)現(xiàn)象的發(fā)生使得解旋酶從5′-鏈上脫落,但是仍然保持著與3′-鏈之間的相互作用時,這種相互作用會使得解旋酶從5′-鏈上轉移到3′-鏈上,如圖5(c)所示;當T7解旋酶重新穩(wěn)定結合在3′-鏈上時,圖5(c)會過渡到圖5(d),解旋酶會進一步在3′-鏈上沿著5′到3′方向開始行走過程.這一現(xiàn)象相對于單鏈DNA自由退火過程來說是一個慢速過程,實驗數(shù)據(jù)中表現(xiàn)為緩慢回退現(xiàn)象.

因此,本文動態(tài)觀測到六聚體解旋酶——T7解旋酶的換鏈過程,并提出其模型.相信此研究結果將推進對于六聚體解旋酶功能和特性的理解,并進一步完善對其分子機制的研究.

圖5 T 7解旋酶換鏈過程的模型 (a)T 7解旋酶在解旋過程中發(fā)生停滯的狀態(tài),紅色點表示與3′-尾鏈存在相互作用位點;(b)T 7解旋酶發(fā)生瞬時回退或從單鏈DNA上脫落的狀態(tài);(c)T7解旋酶發(fā)生開環(huán),并借助相互作用重新結合到3′-鏈上;(d)T 7解旋酶穩(wěn)定地結合在3′-鏈,并緩慢進行行走回到初始位置Fig.5.Model for the switching strand process of T 7 helicase:(a)T 7 helicase stop unwinding during its unwinding process,the red dot means the interaction site between T 7 helicase and 3′-tail;(b)the state that T 7 helicase instantaneously slipping back to initial position on the 5′-strand or dissociating from the 5′-strand;(c)the process that T 7 helicase open the ring-shaped structure and rebinding to the 3′-strand by the interaction with it;(d)the state that T 7 helicase slowly translocating to the initial position on the 3′-strand.

4 結 論

采用smFRET和MT技術對T7解旋酶在解旋過程中解旋和換鏈問題進行了研究.首先通過設計不同3′-尾鏈結構的DNA底物驗證了T7解旋酶進行解旋反應需要3′-尾鏈的參與,但是并不受其結構為單鏈DNA或雙鏈DNA的影響.同時,通過改變DNA序列中的GC含量,發(fā)現(xiàn)序列中GC含量的提高會導致T7解旋酶在解旋過程中更容易發(fā)生暫停或停滯,進而從DNA底物上脫落或滑退回初始位置,降低其解旋長度;通過分析解旋酶的回退現(xiàn)象,發(fā)現(xiàn)大多數(shù)情況下為瞬時回退的過程,少數(shù)情況下為緩慢回退的過程;通過進一步設計MT實驗,研究發(fā)現(xiàn)這種緩慢回退現(xiàn)象的存在,并由此推測出這種現(xiàn)象可能為T7解旋酶在解旋過程中發(fā)生的換鏈現(xiàn)象.最后,提出了T7解旋酶進行換鏈過程的模型.

[1]Dillingham M S 2011 Biochem.Soc.Trans.39 413

[2]Jankowsky E 2011 Trends Biochem.Sci.36 19

[3]Bernstein K A,Gangloff S,Rothstein R 2010 Annu.Rev.Genet.44 393

[4]Zhao D Y,Liu SY,Gao Y 2018 Acta Biochim.Biophys.Sin.146 1093

[5]Klaue D,Kobbe D,Kemmerich F,Kozikowska A,Puchta H,Seidel R 2013 Nat.Commun.4 2024

[6]Li J H,Lin W X,Zhang B,Nong D G,Ju H P,Ma J B,Xu C H,Ye F F,Xi X G,Li M,Lu Y,Dou S X 2016 Nucleic Acids Res.44 4330

[7]Wang S,Qin W,Li J H,Lu Y,Lu K Y,Nong D G,Dou S X,Xu C H,Xi X G,Li M 2015 Nucleic Acids Res.43 3736

[8]Dessinges M N,Lionnet T,Xi X G,Bensimon D,Croquette V 2004 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101 6439

[9]Sun B,Johnson D S,Patel G,Smith B Y,Pandey M,Patel S S,Wang M D 2011 Nature 478 132

[10]Johnson D S,Bai L,Smith B Y,Patel S S,Wang M D 2007 Cell 129 1299

[11]Zhao Z Y,Xu C H,Li J H,Huang X Y,Ma J B,Lu Y 2017 Acta Phys.Sin.66 188701(in Chinese)[趙振業(yè),徐春華,李菁華,黃星榞,馬建兵,陸穎 2017物理學報 66 188701]

[12]Wang S,Zheng H Z,Zhao Z Y,Lu Y,Xu C H 2013 Acta Phys.Sin.62 168703(in Chinese)[王爽,鄭海子,趙振業(yè),陸越,徐春華2013物理學報62 168703]

[13]Lin W X,Ma J B,Nong D G,Xu C H,Zhang B,Li J H,Jia Q,Dou S X,Ye F F,Xi X G,Lu Y,Li M 2017 Phys.Rev.Lett.119 138102

[14]Zhang H,Lee SJ,Zhu B,Tran N Q,Tabor S,Richardson C C 2011 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 108 9372

[15]Zhang H,Tang Y,Lee S J,Wei Z,Cao J,Richardson C C 2016 J.Biol.Chem.291 1472

[16]Matson S W,Tabor S,Richardson C C 1983 J.Biol.Chem.258 14017

[17]Ahnert P,Patel S S 1997 J.Biol.Chem.272 32267

[18]Syed S,Pandey M,Patel S S,Ha T 2014 Cell Rep.6 1037

[19]Donmez I,Patel S S 2008 EMBO J.27 1718

[20]Jeong Y J,Levin M K,Patel SS 2004 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101 7264

[21]Patel S S,Picha K M 2000 Annu.Rev.Biochem.69 651

[22]Morris P D,Raney K D 1999 Biochem.38 5164

[23]Tabor S,Richardson C C 1981 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78 205

[24]Hacker K J,Johnson K A 1997 Biochem.36 14080

[25]Korhonen J A,Gaspari M,Falkenberg M 2003 J.Biol.Chem.278 48627

[26]Ahnert P,Picha K M,Patel S S 2000 EMBO J.19 3418