王 磊 ，陳 琪 ，楊 華 ，王家琴 ，韋朝領 ，宛曉春 *

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)部茶葉生物化學和生物技術重點實驗室，合肥230036；2.云南省紅河州屏邊縣農(nóng)業(yè)局茶果站，紅河661400）

簡單重復序列（simple sequence repeat，SSR）又稱微衛(wèi)星（microsatellite DNA），是一類由幾個核苷酸（一般2～6個）為重復單位而成的長度可達幾十個核苷酸的串聯(lián)重復序列[1]。Powell等[2]對SSR的優(yōu)點做了很好的綜述，如共顯性、多態(tài)性相對豐富，基因組覆蓋較多等。由于該技術具有簡便、快速、穩(wěn)定性高和等位基因多樣性高等特點，在基因組研究中作為一種主要的分子標記技術，已經(jīng)廣泛地應用于小麥、大豆、水稻、茶樹等植物的遺傳圖譜的構建、遺傳多樣性分析和系統(tǒng)學研究等方面[3～6]，而提取高質量的茶樹基因組DNA則是茶樹SSR分析的基礎。

茶樹[Camellia sinensis(L.)O.Kuntze]為多年生常綠木本植物，起源于中國的西南地區(qū)[7～10]，然后從起源中心向其他地域自然傳播并從中國向世界其他地區(qū)人為傳播。由于茶樹異花授粉的特性與人為的變異選擇，發(fā)生了從形態(tài)水平到細胞水平、生物化學水平、再到分子水平的一系列連續(xù)的、漸進的變化[11]，進而形成了今天豐富的種質資源。不同的茶樹品種，由于其演化過程中環(huán)境和栽培方式的不同造成了其主要生化成分的差異，如野生茶樹的茶多酚、兒茶素、總糖、寡糖和鐵、銅、錳等微量元素含量較栽培種茶樹高，而其他一些內(nèi)含物則低于栽培種[12,13]。茶樹葉片中富含的這些次生代謝物質給茶樹DNA的提取帶來很大的影響，而且不同品種茶樹樣品中次生代謝物含量差異較大，因此，一種適用于不同品種茶樹的優(yōu)質高效的DNA提取方法對于茶樹SSR研究尤為重要，我們在一種廣泛地適用于茶樹以及其他植物基因組DNA提取的CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）法[14,15]的基礎上進行了改良，旨在建立起適合不同資源類型茶樹SSR分析的基因組DNA提取方法。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗中供試茶樹材料分為3類：野生型、過渡型和栽培型，分別采自云南、貴州、安徽、福建等省份，共計10份，采摘新鮮幼嫩枝條保濕條件下放入冰盒帶回，置于-80℃冰箱保存。

表1 材料及產(chǎn)地

1.2 實驗設備

美國產(chǎn)Beckman Allegra 64R高速冷凍離心機，Thermo ND-1000核酸定量儀，SSR-PCR反應在Eppendorf PCR儀上進行，瓊脂糖電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳分別在Bio-Rad Power Pac Basic和Bio-Rad Power Pac HV電泳儀上進行，用Bio-Rad凝膠成像儀拍照。

1.3 主要試劑

所用試劑均為分析純，德國Sigma生產(chǎn)PVP40（PolyVinylPyrrilodone，聚乙烯吡咯烷酮），CTAB、Tris平衡酚和RNase-A為上海生工生產(chǎn)，rTaq DNA聚合酶、dNTP購自TaKaRa。SSR擴增引物根據(jù)Gen-Bank公布的茶樹ESTs數(shù)據(jù)庫和本實驗室測序獲得的基因組數(shù)據(jù)設計，由上海生工合成。

1.4 茶樹總DNA的提取

（1）稱取茶樹鮮葉0.2g放入預冷的研缽中，加入等量的PVPP經(jīng)液氮研磨均勻后裝入滅菌的2ml離心管中，加入1mL pH 8.0的提取緩沖液（250mmol/L NaCl，250mmol/L Tris-HCl,50mmol/L EDTA）充分渦旋，12000rpm，室溫離心5min。

（2）棄上清后加入1mL 65℃下預熱的DNA抽提緩沖液（100mmol/LTris-HCl，pH8.0，1.4mol/LNa-Cl，20mmol/LEDTA，2%(w/v)CTAB，2%(w/v)PVP40）以及2%(v/v)β-巰基乙醇（現(xiàn)用現(xiàn)加），用滅菌槍頭攪勻后置于65℃下水浴45～60min左右，期間大約每10min輕微翻轉下離心管。水浴后12000rpm，室溫離心15min。

（3）取上清于新的滅菌離心管中，加入0.1%RNAase-A（10mg/mL），37℃水浴 60min，每 10min輕微翻轉下離心管。

（4）加等體積的酚:氯仿:異戊醇（25:24:1，v/v），溫和翻轉至充分混合均勻后12000rpm，25℃，離心15min。

（5）吸取上清于新的滅菌離心管，加入等體積的氯仿:異戊醇（24:1，v/v），按上一步驟再抽提1次。

（6）吸取上清于新的滅菌離心管，加入與上清等體積的預冷異丙醇，溫和混勻后靜置于-20℃1h以上。

（7）挑取每個樣品中的絮狀沉淀于新的滅菌離心管，加入70%的乙醇和無水乙醇各洗一次，棄酒精風干沉淀，加入50μL 1×TE溶解待用。

1.5 提取DNA質量檢測

取2μLDNA樣品，用Thermo核酸定量儀測定DNA樣品在230nm、260nm和280nm波長處的紫外吸光度值，可以自動計算出A260/A280和A260/A230的比值，并結合0.8%瓊脂糖凝膠電泳判斷DNA的質量。

其中1～7號樣采用本法提取，8～10號樣采用天根DNA提取試劑盒提取。

1.6 SSR-PCR反應

擴增反應在Eppendorf公司擴增儀上進行，反應總體積為20μL，依次加入10×PCR Buffer（含20mmol/LMg2+）2μL，dNTP（2.5mmol/L）2μL，正反向引物（10μmol/L）各 1.5μL，rTaq酶（5U/μL）0.2 μL，20 ng/μL的DNA模板1μL，加ddH2O補足。

擴增反應程序采用熱啟動的方式，在加入Taq酶前對模板和引物用95℃預變性5min，降至78℃后加酶，然后進入33個循環(huán)，95℃變性1min，55～65℃（根據(jù)引物Tm值不同選擇）退火1min，72℃延伸50s，33個循環(huán)后再72℃延伸5min。少數(shù)SSR引物中上下游引物退火溫度相差較大的，可用Touchdown反應程序（鄭景生和呂蓓，2003）[16]。采用前10個循環(huán)退火溫度用58℃，后23個循環(huán)退火溫度用50℃，這樣對于上下游引物的退火溫度相差較大的SSR標記也能擴增出清晰的條帶。擴增后產(chǎn)物用6%SDS-PAGE電泳檢測。

2 結果與分析

2.1 核酸定量儀檢測

使用Thermo核酸定量儀檢測DNA樣品的純度和濃度。一般說來，A260/A280和A260/A230的比值可以進行核酸樣品純度評估，A260/A280＜1.8說明樣品中蛋白（芳香族）或者酚類物質的污染含量較高，在1.8～2.0之間說明樣品DNA純度較高，若大于2.0說明樣品中RNA含量較高。A260/A230比值若小于2.0表明樣品被碳水化合物（糖類）、鹽類或有機溶劑污染，需要純化。結果如表2所示，本方法提取的DNA樣品A260/A280絕大多數(shù)數(shù)值在1.8～2.0之間，而A260/A230的比值也基本上大于2.0，說明DNA樣品的純度高，少有蛋白質、RNA或其它的的污染。從表中比較還可以看出，采用本方法提取的樣品濃度相較于試劑盒提取的DNA濃度大多數(shù)高了一個數(shù)量級，說明本法提取的DNA在保證質量的同時能夠有很高的得率，這對于后續(xù)實驗有著非常重要的意義，大大提高了珍貴植物材料的利用效率。

表2 提取DNA的純度和濃度測定值

2.2 瓊脂糖電泳檢測

從圖1可以看出，DNA樣品條帶清晰，亮度高，且蛋白污染少，沒有拖帶和彌散，說明本方法提取的DNA具有良好的完整性。點樣孔附近滯留物少且沒有RNA污染。

2.3 SSR-PCR分析

應用SSR技術時必需針對每個SSR設計引物，本課題組從已測序的基因組數(shù)據(jù)中選擇一批SSR設計引物，從中篩選具有多態(tài)性的引物，從圖2可以看到，PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳圖片的條帶明亮清晰，進一步進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分析后可以看出擴增出的多態(tài)性片段（見圖3），說明本方法提取的DNA可以滿足SSR分析的要求。

3 討論

SSR分子標記是一種新型的分子標記技術，其在茶樹上的應用有著廣闊的前景[3,11,17]，近年來，我國茶葉科研人員利用EST-SSR分子標記對我國豐富的茶樹地方品種的遺傳多樣性進行了很多的分析[18～20]。本實驗室從進行基因組SSR引物開發(fā)的需求出發(fā)，為了滿足不同來源茶樹品種基因組DNA提取的需要進行了提取高質量的DNA的技術改良。與其他植物相比，茶樹嫩葉中含有豐富的多糖和多酚等次生代謝物質，會對提取的DNA質量產(chǎn)生很大的影響，本實驗在前人CTAB法[21]的基礎上進行改進，其不同之處在于：首先在加入CTAB提取液之前先加入普通提取緩沖液快速抽提，能夠在一定程度上預先去除部分可溶性多糖、多酚和生物堿類物質，有利于不同樣品的均勻化同時便于后續(xù)提取過程中細胞內(nèi)含物的釋放；其次是把RNA酶解步驟提前，在棄除CTAB提取液后直接用RNase-A去除RNA，然后再用有機溶劑去除蛋白，這樣可以利用后續(xù)酚/氯仿/異戊醇去除蛋白質的同時除去RNase-A酶蛋白，避免酚/氯仿/異戊醇反復抽提過程對DNA鏈可能造成的斷裂及影響DNA得率。實驗結果表明，本方法提取的不同來源的茶樹基因組DNA純度高、濃度高、完整性好，能夠滿足SSR分析的要求。

表3 部分基因組SSR引物

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