郭志華，楊洪

(宿州學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，安徽 宿州，234000)

藏靈菇是源自西藏藏南的林芝地區(qū)和新疆天山天池以上海拔山區(qū)的特有珍稀菌種，呈乳白色、膠質(zhì)狀，外形酷似米粒;經(jīng)過牛奶培養(yǎng)，個(gè)體會(huì)慢慢增大，形狀如盛開的雪蓮，故又稱之為西藏雪蓮。藏靈菇發(fā)酵奶的風(fēng)味與普通酸奶有較大的差別，除了具有發(fā)酵奶特有的酸味、香味，還有輕微的醇香味［1］。

藏靈菇的發(fā)酵液營養(yǎng)豐富，具有醫(yī)療和保健作用。經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)藏靈菇發(fā)酵液具有提高人體免疫［2］、調(diào)節(jié)腸胃［3-4］、抑菌［5］、抗氧化［6-7］等功能;并證實(shí)藏靈菇主要由乳酸菌和酵母菌組成［8-9］。其中乳酸菌是一種安全、優(yōu)質(zhì)的益生菌，在人體內(nèi)具有抑制病原菌生物生長、維持腸道菌群平衡、調(diào)節(jié)胃腸功能等益生作用。

本研究主要從藏靈菇中分離純化乳酸菌，研究乳酸菌的益生特性，為食品發(fā)酵生產(chǎn)提供優(yōu)良菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

藏靈菇來自于民間。在實(shí)驗(yàn)室將藏靈菇放在10%(W/V)的無菌脫脂牛奶(105℃滅菌20 min)中，置于28℃環(huán)境，每隔2 d更換一次牛奶。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基:1%蛋白胨，1%牛肉膏，0.5%酵母膏，0.2%檸檬酸氫二銨，2%葡萄糖，0.1%吐溫80，0.5% 乙酸鈉，0.2%K2HPO4，0.058%MgSO4，0.025%MnSO4，1.8%瓊脂，蒸餾水 100 mL，pH 6.2 ～6.6。

1.1.2 試劑

PCR試劑盒、膠回收試劑盒等購于Invitrogen公司;藥敏試紙購于北京天壇生物技術(shù)開發(fā)公司;其余均為國產(chǎn)分析純或化學(xué)純。

1.1.3 儀器

AL204分析天平;BBS-SDC-A超凈工作臺(tái);MULTISKAN GO酶標(biāo)儀，美國Thermo;SHP-250型生化培養(yǎng)箱。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌的分離純化

用接種環(huán)取1環(huán)藏靈菇發(fā)酵乳培養(yǎng)物，在含有1%CaCO3的MRS平板上劃線，37℃培養(yǎng)48 h，滅菌牙簽蘸取有透明圈的單菌落，接入MRS液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)48 h，進(jìn)行接觸酶反應(yīng)。

1.2.1 乳酸菌的鑒定

1.2.1.1 形態(tài)特征觀察

觀察單菌落形狀、顏色、表面等培養(yǎng)特征。進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡觀察菌體形狀、排列方式等形態(tài)特征。

1.2.1.2 16S rDNA的擴(kuò)增和序列分析

基因組DNA的提取參照文獻(xiàn)［10］的方法并稍做改進(jìn)。以細(xì)菌16S rDNA通用引物為上下游引物，染色體DNA為模板擴(kuò)增菌株的16S rDNA。PCR反應(yīng)條件為:94℃ 3 min;94℃ 1 min，56℃ 1 min，72℃ 2 min，循環(huán)29次;72℃ 10 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。PCR產(chǎn)物由生物技術(shù)有限公司測(cè)序，16SrDNA序列通過Blast進(jìn)行核酸數(shù)據(jù)比較。1.2.2 乳酸菌益生特性研究

1.2.2.1 產(chǎn)酸實(shí)驗(yàn)

將分離菌株接種MRS液體培養(yǎng)基(pH 6.4)，置于37℃培養(yǎng)24 h，用pH計(jì)測(cè)定培養(yǎng)基的pH的變化，同時(shí)測(cè)滴定酸度。

1.2.2.2 pH對(duì)菌株生長的影響

將MRS液體培養(yǎng)基 pH值調(diào)為2.0、3.0、4.0、5.0和6.0，分別取各pH的培養(yǎng)基5 mL置于試管中，滅菌備用。將分離的菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后，取新鮮菌液按5%(v/v)分別接種于上述各pH的試管中，置于37℃培養(yǎng)24 h后測(cè)OD600。

1.2.2.3 溫度對(duì)菌株生長的影響

分離出的乳酸菌接種MRS液體培養(yǎng)基中，分別置于30℃、40℃、50℃、60℃水浴 1h，按 5%(v/v)接種于新鮮液體培養(yǎng)基，置于37℃培養(yǎng)24 h，測(cè)OD600。

1.2.2.4 耐膽鹽能力測(cè)定

用豬膽鹽配制含有0.1%、0.2% 、0.3%、0.4%、0.5% 和0.6%膽鹽濃度的MRS液體培養(yǎng)基，將制備好的菌懸液按5%(v/v)接種到各培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)48 h，測(cè)OD600。

1.2.2.5 菌株對(duì)腸道有害菌群的抑菌性試驗(yàn)

將活化好的金黃色葡萄球菌(S.aureus)、大腸桿菌(E.coli)和沙門氏菌(S.enterica)菌液稀釋，取0.1 mL涂布在固體培養(yǎng)基中。將濾紙制成直徑為6 mm的圓形紙片(121℃滅菌30 min)，收集乳酸菌發(fā)酵液，將浸染發(fā)酵液的紙片分別貼于涂有致病菌的平板上，每個(gè)平板貼3個(gè)濾紙片，兩兩相距30 mm左右，37℃培養(yǎng)48 h，觀察并測(cè)量抑菌圈直徑大小。

1.2.2.6 抗藥性實(shí)驗(yàn)

利用藥物紙片瓊脂擴(kuò)散法，抗生素濃度分別為:乙酰螺旋霉素2 240 U/mL;青霉素2 000 U/mL;鏈霉素2 000 μg/mL，將益生菌涂布在MRS瓊脂培養(yǎng)基上后，將浸染抗生素的藥片貼于平板上，于37℃培養(yǎng)48 h，觀察并測(cè)量抑菌圈直徑大小。

所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的鑒定

2.1.1 形態(tài)觀察與培養(yǎng)特征測(cè)定

采用含CaCO3的MRS培養(yǎng)基分離純化出5株乳酸菌，這5株菌革蘭氏染色均為陽性，接觸酶反應(yīng)為陰性，初步判斷符合乳酸菌特征。顯微鏡觀察，zlg1、zlg3、zlg4均為球菌，球形或卵圓形，無芽孢，成對(duì)或短鏈狀;zlg2、zlg5均為桿菌，無芽孢，單個(gè)或短鏈狀。

2.1.2 16S rDNA的擴(kuò)增和序列分析

以菌株的DNA為模板，PCR擴(kuò)增得到大小為1.5 kb的基因片段。采用Blast與GenBank中已登錄的基因序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)zlg1、zlg3、zlg4的16S rDNA與乳酸乳球菌的同源性分別為98%、98%、99%;zlg2、zlg5的16S rDNA與嗜酸乳桿菌的同源性分別為98%、98%。

根據(jù)培養(yǎng)特征和16S rDNA比對(duì)分析。zlg1、zlg3、zlg4初步鑒定為為乳酸乳球菌(Lactococcus lactis);zlg2、zlg5初步鑒定為嗜酸乳桿菌(Lactcbacillus acidophilus)。取zlg4和zlg2為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，研究其益生特性。

2.2 zlg4和zlg2益生特性研究

2.2.1 產(chǎn)酸試驗(yàn)

牛乳發(fā)酵過程中，乳糖水解產(chǎn)生乳酸，使牛乳的pH值下降滴定酸度上升。酸度是發(fā)酵乳的重要指標(biāo)之一，與產(chǎn)品的口味、質(zhì)地和風(fēng)味有關(guān)。圖1表明，zlg2、zlg4在發(fā)酵前4 h，菌株生長緩慢，產(chǎn)酸能力較弱，組間組內(nèi)顯著差異性顯著(P＞0.05)。從4 h到20 h，隨著發(fā)酵時(shí)間延長，乳酸菌開始大量繁殖，產(chǎn)酸量大幅增加，pH值快速降低，zlg2的產(chǎn)酸量要大于zlg4，組間組內(nèi)顯著差異(P＜0.05)。20 h后菌體生長開始逐漸衰亡，pH值降幅趨緩。

圖1 乳酸菌發(fā)酵過程中pH值和滴定酸度的變化Fig.1 Change in pH value and titratable acidity of lactic acid bacteria during fermentation

2.2.2 pH值對(duì)菌株生長的影響

由圖2可知，當(dāng)pH值為2、3時(shí)，兩菌株生長較緩慢;pH值為4時(shí)有一定程度的生長;在pH值為5時(shí)能夠較好地生長;pH值為6時(shí)生長最好。說明這2株菌有較好的耐酸性。

2.2.3 溫度對(duì)菌株生長的影響

圖2 pH對(duì)菌株生長的影響Fig.2 Effect of pH on growth of lactic acid bacteria

由圖3可看出，2株菌經(jīng)30℃、40℃水浴處理后生存率最高，組內(nèi)組間差異不顯著(P＞0.05);50℃水浴處理后的存活率與40℃相比，zlg4和zlg2分別為:88%、71.43%;60℃水浴處理后，zlg4存活率為65%，zlg2為43%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，50℃、60℃水浴處理后2株菌存活率存在顯著差異(P＜0.05)，zlg4的溫度耐受性大于zlg2。

圖3 溫度對(duì)菌株生長的影響Fig.3 Effect of temperature on growth of lactic acid bacteria

2.2.4 耐膽鹽能力測(cè)定

由圖4可看出，低濃度膽鹽(0.1%)對(duì)2株菌的生長沒有明顯影響，組間組內(nèi)無顯著差異(P＞0.05);隨著膽鹽濃度的升高，2菌株的存活率逐漸下降，當(dāng)膽鹽濃度為0.4%和0.5%時(shí)，2株菌的存活率降至39%和29%。且從膽鹽濃度為0.2%開始，2株菌之間的存活率存在顯著差異(P＜0.05)，說明這2株菌對(duì)膽鹽耐受力不同，zlg2要強(qiáng)于zlg4。

圖4 乳酸菌耐膽鹽性Fig.4 Bile toleranc of lactic acid bactera

2.2.5 2菌株對(duì)腸道有害菌群的抑菌性試驗(yàn)

表1說明2株乳酸菌對(duì)3種腸道病菌均有一定抑制作用，其中對(duì)金黃色葡萄球菌抑制效果較明顯。zlg2的抑菌性強(qiáng)與zlg4，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示存在顯著差異(P＜0.05)。由產(chǎn)酸試驗(yàn)可知，zlg2產(chǎn)酸性強(qiáng)于zlg4，酸性較強(qiáng)可導(dǎo)致周圍環(huán)境pH值下降，降低氧化還原電位，對(duì)許多革蘭氏陽性或陰性細(xì)菌產(chǎn)生抑制作用［11］。此外，乳酸乳球菌可普遍產(chǎn)生乳酸乳球菌素，對(duì)包括食品腐敗菌和致病菌在內(nèi)的許多革蘭氏陽性菌具有強(qiáng)烈的抑制作用［12］。

表1 乳酸菌抑菌圈直徑 mmTable 1 The bacteriostasia diametere of lactic acid bacteria mm

2.2.6 耐藥性試驗(yàn)

由圖5可看出2株菌對(duì)青霉素、氨芐青霉素、氯霉素較敏感;對(duì)慶大霉素、氟哌酸敏感不強(qiáng)。統(tǒng)計(jì)分析表明，2株菌的耐藥性存在顯著差異(P＜0.05)。

圖5 乳酸菌耐藥性Fig.5 Resistance to antibiotic resistance of lactic acid bacteria

3 討論

從藏靈菇中篩選出5株乳酸菌，通過形態(tài)特征、16SrDNA序列同源性分析，初步鑒定3株菌為乳酸乳球菌，2株菌為嗜酸乳桿菌。

益生菌在到達(dá)腸道前先要通過胃，胃中的胃酸可以殺死大部分微生物，開發(fā)益生菌首先要考察其對(duì)酸的耐受能力。zlg2和zlg4在pH值為2、3時(shí)生長較緩慢，pH值為4時(shí)可生長。

溫度是影響菌株發(fā)酵的重要因素之一，高溫可縮短凝乳時(shí)間，2株菌經(jīng)50℃、60℃水浴處理后仍有一定的存活率，說明兩株菌可耐受高溫。耐膽鹽也是乳酸菌特性之一，2株菌在膽鹽濃度為0.4%和0.5%時(shí)，仍有39%和29%的存活率。乳酸菌可產(chǎn)生有機(jī)酸、細(xì)菌素等抑菌物質(zhì)，可殺死腸道有害菌群，具有維持腸道菌群平衡功能。

本研究中發(fā)現(xiàn)2株菌對(duì)常見抗生素如青霉素、氨芐青霉素、氯霉素較敏感，但對(duì)慶大霉素和氟哌酸產(chǎn)生耐藥性。FAO/WHO在《用于食品益生菌安全性評(píng)價(jià)指導(dǎo)原則》中指出，益生菌存在的可能危害包括益生菌菌株產(chǎn)生廣泛的耐藥性，可以使抗藥基因在菌株之間傳播［13］。乳酸菌抗藥性有內(nèi)源抗藥性和獲得性抗藥性，內(nèi)源性抗藥性一般不發(fā)生抗藥基因的水平轉(zhuǎn)移;獲得性抗藥性表現(xiàn)出高水平的抗藥性，抗藥基因可在細(xì)菌種屬間傳播［14］。目前應(yīng)用到發(fā)酵食品中的乳酸菌基本都是野生型，一般不經(jīng)過二次消毒即可直接食用，有可能與腸道正常菌群或致病菌進(jìn)行抗藥因子的傳遞。乳酸菌在作為生產(chǎn)菌株之前，有必要檢測(cè)菌株耐藥性，預(yù)防抗藥菌株的擴(kuò)散。

［1］ 甘伯中，杜寧娟，李帆，等.藏靈菇及其優(yōu)勢(shì)菌群的發(fā)酵性能研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2008，34(9):105-108.

［2］ 薄芯，李京霞.西藏靈菇發(fā)酵奶對(duì)小鼠免疫功能的影響初探［J］.中國乳品工業(yè)，2011，39(6):19-21.

［3］ 薄芯，李京霞.西藏靈菇發(fā)酵奶對(duì)小鼠消化系統(tǒng)的保健作用探索［J］.中國乳品工業(yè)，2010，38(7):29-31.

［4］ 李麗秋，王春敏.宋淑賢，等.西藏靈菇奶對(duì)抗生素相關(guān)性腹瀉小鼠腸道菌群的調(diào)整作用［J］.中國微生態(tài)學(xué)雜志，2004，16(4):197-198.

［5］ 孫卓，呂加平，馮鑠涵，等.藏靈菇菌發(fā)酵性能以及抑菌特性研究［J］.中國釀造，2011，21(4):147-150.

［6］ 劉慧，王世平，冉冉.藏靈菇源酸奶復(fù)合菌發(fā)酵劑對(duì)大鼠脂質(zhì)過氧化的影響［J］.中國食品學(xué)報(bào)，2010，10(3):27-30.

［7］ 劉慧，王世平，冉冉.藏靈菇源酸奶復(fù)合菌發(fā)酵劑對(duì)大鼠肝臟膽固醇的作用［J］.中國食品學(xué)報(bào)，2010，10(2):35-39.

［8］ 劉宇峰，王金英，曲曉軍.西藏靈菇菌的菌相菌學(xué)的研究［J］.中國乳品工業(yè)，2005，33(9):35-39.

［9］ 周劍忠，董明盛，江漢湖.PCR-DGGE指紋技術(shù)與分離技術(shù)結(jié)合篩選藏靈菇奶發(fā)酵過程的優(yōu)勢(shì)菌［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，39(8):1 632-1 638.

［10］ 顏?zhàn)臃f，王海林，譯.精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南［M］.北京:科學(xué)出版社，1999.

［11］ 郭本恒.益生菌［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2004:441-442.

［12］ 初曉東，林宇恒，孫志增，等.乳鏈菌肽(nisin)抗性機(jī)制的研究進(jìn)展［J］.微生物學(xué)報(bào)，2010，50(9):1 129-1 134.

［13］ Wassenaar T，Klein G.Safety aspects and inplications of regulation of probiotic bacteria in food and food supplements［J］.J Food Prot，2008，71(8):1 734-1 741.

［14］ 孔健，季明杰，楊埔.食源性乳酸菌抗藥性分析［J］.山東大學(xué)學(xué)報(bào)(理學(xué)版)，2011，46(10):178-182.