加速溶劑萃取–液相色譜法測(cè)定五靈脂藥材中原兒茶酸的含量*

鞏志國(guó)，蘇敏，王靜靜，員麗娟，李世雨，季新成，朱建民

（新疆出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，烏魯木齊 830063）

五靈脂（Faeces Trogopterori）是哺乳綱鼯鼠科動(dòng)物復(fù)齒鼯鼠（Trogopterus xanthipes Milne-Edwards）的干燥糞便，分為靈脂米和靈脂塊兩種。靈脂米即復(fù)齒鼯鼠的干燥糞便，靈脂塊是其糞便與尿液的混合物夾以少量砂石干燥凝結(jié)而成［1］。五靈脂具有行血散瘀止痛的功效，用于治療產(chǎn)后子宮復(fù)舊不全、毒蛇咬傷、胃脘痛經(jīng)久不愈等［2］。原兒茶酸（3，4-二羥苯甲酸，Protocatechunic acid）具有增加冠脈血流、緩解心絞痛的作用，是五靈脂的重要活性成分單體之一，是一種水溶性酚酸成分，具有顯著降低心肌耗氧量、提高心肌耐氧能力、減慢心率等藥理作用，并且對(duì)乙肝病毒的脫氧核糖核酸（DNA）復(fù)制具有較強(qiáng)的抑制作用［3］。目前五靈脂中原兒茶酸的測(cè)定方法主要是液相色譜法［4–5］和分光光度法［6］；樣品前處理主要使用超聲提取和水浴加熱提取兩種方式，缺點(diǎn)是耗時(shí)長(zhǎng)，試劑用量大、揮發(fā)多。筆者采用加速溶劑萃取法（ASE），具有萃取時(shí)間短、溶劑用量少和萃取效率高等突出優(yōu)點(diǎn)。該法的研究將為控制五靈脂藥材的質(zhì)量提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜儀：Waters 2695 型，配有紫外檢測(cè)器，美國(guó)沃特斯公司；

渦旋儀：MS3 型，德國(guó)IKA 公司；

超聲儀：SK8200LH 型，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；

高純水發(fā)生器：Milli-Q Ⅱ型，美國(guó)密理博公司；

離心機(jī)：T–124 型，瑞士KONTRON 公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE–52AA 型，上海亞榮生化儀器廠；

加速溶劑萃取儀（ASE）：ASE200 型，美國(guó)戴安公司；

原兒茶酸標(biāo)準(zhǔn)品：東京化學(xué)工業(yè)公司；

甲醇、乙腈：色譜純，美國(guó)Fisher 公司；

再生纖維素濾膜：0.2 μm，美國(guó)安捷倫公司；

五靈脂樣品：市售和蒙古國(guó)進(jìn)口樣品；

其它試劑均為優(yōu)級(jí)純；

實(shí)驗(yàn)用水為二次凈化水。

1.2 溶液配制

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液

準(zhǔn)確稱取適量原兒茶酸標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇配成100 mg／L 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，儲(chǔ)存于–18℃冰箱，保存期18 個(gè)月。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，用甲醇稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，配成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.2 樣品提取液

750 mL 無水乙醇和250 mL 水混合。

1.3 液相色譜條件

液相色譜柱：Diamosil C18（4.6 mm×250 mm，5.0 μm，迪馬科技公司）；流動(dòng)相：甲醇（A）和0.5%的乙酸水溶液（B）；梯度洗脫程序：0～10 min 時(shí)85%～60% 的A，10～15 min 時(shí)60%～15% 的A，15～22 min 時(shí)15% 的A，22～25 min 時(shí)15%～85%的A，25～30 min 時(shí)85%的A；流速：1.0 mL／min；柱溫：35℃；分析波長(zhǎng)：260 nm。

1.4 樣品處理

稱取1.0 g 樣品，添加0.2 g 硅藻土，混勻后置于11 mL 加速溶劑萃取池中（下部預(yù)先添加少量海沙），上部添加海沙至平，擰緊萃取池冒，放入加速溶劑萃取池盤中。ASE 條件：溶劑為乙醇–水（體積比75∶25），溫度為100℃，壓力為15 MPa，預(yù)熱時(shí)間為5.0 min，靜態(tài)萃取時(shí)間為10.0 min，循環(huán)次數(shù)為3 次。接收池溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至約5 mL，用提取液定容至5.0 mL，過0.2 μm 的再生纖維素膜，上液相色譜測(cè)定。

1.5 色譜圖

在1.3 的色譜條件下，原兒茶酸標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖見圖1。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱和流動(dòng)相的選擇

原兒茶酸為白色至褐色結(jié)晶性粉末，在空氣中變色。其結(jié)構(gòu)為苯環(huán)上含有兩個(gè)羥基和一個(gè)羧基。原兒茶酸的屬于極性稍強(qiáng)物質(zhì)，在反相色譜柱上有保留。參考待測(cè)物的性質(zhì)和相關(guān)文獻(xiàn)［7］，選擇反相C18色譜柱分離待測(cè)物。通過比較甲醇和酸性（乙酸和磷酸）水溶液，乙腈和酸性（乙酸和磷酸）水溶液，依據(jù)基線噪音的高低和目標(biāo)物與雜質(zhì)的分離度進(jìn)行選擇。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，甲醇和0.5%乙酸的水溶液作為流動(dòng)相，噪音較低，分離度較好。

2.2 提取條件的選擇

原兒茶酸常用的提取液有乙醇水溶液和甲醇水溶液。由于甲醇毒性較大，因此選擇乙醇和水的溶液提取。

加速溶劑萃取技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種在高溫（室溫～200℃）、高壓（0.1～20 MPa）條件下快速提取固體或半固體樣品的樣品前處理方法，與常用的索氏提取、超聲提取、微波萃取技術(shù)等方法相比具有節(jié)省溶劑、快速、健康環(huán)保、自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)。該技術(shù)廣泛應(yīng)用環(huán)境分析、農(nóng)產(chǎn)品安全、制藥、天然產(chǎn)物提取和能源等諸多領(lǐng)域，適合色譜分析樣品預(yù)處理。

筆者依據(jù)待測(cè)物質(zhì)和提取溶劑的性質(zhì)選擇性試驗(yàn)了加速溶劑提取的溫度、壓力、提取時(shí)間和循環(huán)次數(shù)等條件，并參照色譜上的保留行為和其含量變化選擇條件，實(shí)驗(yàn)最終確定的提取條件：溫度100℃，壓力15 MPa，預(yù)熱5 min，靜態(tài)提取10 min，循環(huán)次數(shù)為3 次。

2.3 工作曲線方程、檢出限及定量限

用原兒茶酸的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，原兒茶酸的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的濃度分別為0.1，0.3，0.5，1.0，5.0，10.0 mg／L。在1.3 色譜條件下分別進(jìn)行測(cè)定，以色譜峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，以原兒茶酸的質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y=0.045X＋0.029，相關(guān)系數(shù)r=0.999 8，線性范圍為0.1～10.0 mg／L。以3 倍信噪比計(jì)算得檢出限為0.5 mg／kg，以10 倍信噪比計(jì)算定量限為1.0 mg／kg。

2.4 回收率和精密度試驗(yàn)

利用五靈脂樣品進(jìn)行3 個(gè)添加水平的回收試驗(yàn)，每個(gè)水平重復(fù)5 次。原兒茶酸的添加量是1.0，2.0，5.0 mg／kg 3 個(gè)水平，回收率和精密度的試驗(yàn)結(jié)果見表1。由表1 可知，該方法有較好的精密度和準(zhǔn)確度，可以滿足五靈脂中原兒茶酸含量檢測(cè)需要。

表1 五靈脂中的回收率及精密度結(jié)果（n=5）

2.5 樣品測(cè)定

將本方法用于實(shí)驗(yàn)室中25 份五靈脂樣品的分析，對(duì)樣品中的原兒茶酸含量進(jìn)行測(cè)定，最終定容體積依據(jù)其含量水平稀釋到線性范圍內(nèi)，根據(jù)化合物的色譜保留時(shí)間和光譜圖來鑒別樣品。所測(cè)定樣品中原兒茶酸的含量水平為0.01%～0.1%范圍內(nèi)。

3 結(jié)語

采用加速溶劑萃取儀來提取五靈脂樣品中原兒茶酸，乙醇水溶液作為溶劑，ASE 的提取效率高，省時(shí)又經(jīng)濟(jì)。本方法不僅可用于五靈脂中原兒茶酸的含量測(cè)定，還可以測(cè)定其它成分的含量，對(duì)藥材中活性物質(zhì)的測(cè)定提供了參考。

［1］ 唐緒剛，黃文權(quán).五靈脂藥理及臨床應(yīng)用概述［J］.中國(guó)中醫(yī)急癥，2008，1(17): 101–102.

［2］ 楊東明，蘇世文，李銑，等.五靈脂活性成分的研究［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，1987，22(10):756–760.

［3］ 朱翔宇，楊蓮菊，李春.HPLC 測(cè)定五靈脂中原兒茶酸含量［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，6(16): 71–73.

［4］ 焦玉，王榮榮，史超，等.HPLC 法同時(shí)測(cè)定中藥五靈脂中3 種成分的含量［J］.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，7(27): 574–578.

［5］ 朱翔宇.五靈脂化學(xué)成分與質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)研究［D］.西南交通大學(xué)碩士畢業(yè)論文，2008，5.

［6］ 陳月開，王美素.五靈脂活性成分單體原兒茶酸的分析測(cè)定［J］.山西大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2000，23(3): 260–262.

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