成薇婷， 許 凱

1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院腫瘤科，武漢 430022

2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院骨科，武漢 430030

奧沙利鉑作為新型的草酸鉑，不僅是結(jié)直腸癌的一線化療藥，而且由于其腎毒性小，不良反應(yīng)少，在臨床上已經(jīng)成為多種實(shí)體腫瘤的廣譜化療藥［1］。然而其最為突出的不良反應(yīng)為奧沙利鉑誘導(dǎo)的外周神經(jīng)毒性（Oxalipatin induced peripheral neuropathy，OXIPN），在很大程度上限制了臨床使用，且發(fā)病機(jī)制目前尚不明確［2］。降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene－related peptide，CGRP）被證實(shí)與神經(jīng)病理性疼痛密切相關(guān)［3］。本研究旨在通過建立奧沙利鉑誘發(fā)外周神經(jīng)病變模型，了解大鼠疼痛行為學(xué)變化及其脊髓背根神經(jīng)節(jié)中CGRP的表達(dá)，及CGRP在OXIPN發(fā)病中的作用機(jī)制，以期為防治OXIPN提供新的思路和途徑。

1 材料與方法

1．1 動(dòng)物分組與造模

健康Wistar大鼠由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供，20只，8周齡，150～200g，自由攝食飲水，室溫條件并普通飼料喂養(yǎng)，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組（n＝10）和對(duì)照組（n＝10）。實(shí)驗(yàn)組使用奧沙利鉑（批號(hào)：H20000686，規(guī)格：50mg／瓶，由南京制藥公司提供），以5%葡萄糖溶解成20mg／L的工作液，按照臨床成人常用劑量（130mg／m2）換算出大鼠的用藥劑量為20mg／kg，行腹腔注射造模。對(duì)照組予以5%葡萄糖5mL腹腔注射。

1．2 一般情況觀察

分別觀察造模前、造模后24h、72h、7d大鼠的一般情況，包括：精神、皮毛、飲食、排便、體重等。

1．3 機(jī)械性痛閾的測(cè)定

于造模前、造模后6h、24h、72h、7d測(cè)定機(jī)械性痛閾。大鼠適應(yīng)環(huán)境15min后，用Von Frey纖維機(jī)械刺激針（North Coast Medical公司，加拿大）垂直刺激大鼠后肢足底中部，使之稍成S形，持續(xù)6～8s。大鼠在刺激時(shí)間內(nèi)或在移開Von Frey纖維時(shí)立即出現(xiàn)快速的抬足反應(yīng)，記為陽性反應(yīng)（身體活動(dòng)所引起的抬足反應(yīng)不記作陽性反應(yīng)）。記錄陽性反應(yīng)時(shí)的刺激量，以Von Frey纖維對(duì)應(yīng)的質(zhì)量作為刺激的機(jī)械性痛閾。每隔5min測(cè)1次，重復(fù)3次。

1．4 冷縮足潛伏期的測(cè)定

采用Im等的方法［4］進(jìn)行冷痛閾的測(cè)定。將大鼠置入鐵絲籠中，適應(yīng)20min后，用注射器對(duì)準(zhǔn)大鼠的后足背的中心給予1滴丙酮酸。大鼠在丙酮酸刺激后出現(xiàn)抬足反射定義為陽性。用秒表記錄大鼠從受刺激抬足到放下后足的間隔時(shí)間，即為冷縮足潛伏期。左右各重復(fù)3次，取平均值。

1．5 Western blot檢測(cè)

于造模后6h、72h、7d獲取大鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)。具體步驟為，以0．4%戊巴比妥鈉（1mL／100 g）進(jìn)行腹腔麻醉后，剖胸經(jīng)心臟插管，肝素鈉生理鹽水灌洗。迅速打開椎管，在椎間孔處截取胸腰段的背根神經(jīng)節(jié)約10個(gè)，置于液氮中速存，并立即于－80℃冰箱保存?zhèn)溆?。碾碎神?jīng)節(jié)，采用 MPERTM試劑盒提取總蛋白，應(yīng)用BCA法測(cè)定蛋白濃度后，取20μg的蛋白進(jìn)行SDS－PAGE電泳分離，濕轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，BSA封閉2 h，分別以兔抗鼠CGRP抗體（1∶400，美國(guó)Santa Cruz公司）4℃孵育過夜，洗膜3次，1∶1 000辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗室溫孵育1h，常規(guī)洗膜，ECL熒光顯色系統(tǒng)暗室顯像，X線片感光顯影，用灰度掃描儀檢測(cè)出各個(gè)條帶的平均灰度值，以與GAPDH的比值代表蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1．6 免疫組織化學(xué)染色法

參照1．5項(xiàng)麻醉對(duì)照組及建模7d后大鼠，并在肝素鈉灌洗后應(yīng)用4%多聚甲醛200mL經(jīng)心臟行全身灌注，取胸腰段的背根神經(jīng)節(jié)，置于4%多聚甲醛中固定，乙醇梯度脫水，序貫二甲苯透明，再行石蠟包埋，切片機(jī)制成3．5μm的石蠟切片。按照免疫組化試劑盒（北京中杉科技公司）說明書進(jìn)行SP法免疫組織化學(xué)染色（兔抗鼠CGRP抗體濃度1∶1 000，SP抗體濃度1∶400），DAB顯色，蘇木精復(fù)染。在光學(xué)顯微鏡下觀察，以胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色粗顆?；驈浬⒎植碱w粒為陽性反應(yīng)，在高倍鏡下隨機(jī)取3個(gè)視野，ImagePro Plus圖像分析軟件測(cè)定染色陽性的神經(jīng)元平均吸光度值。

1．7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2．1 一般情況

大鼠于造模成功后24h出現(xiàn)煩躁、撕咬、精神異常，進(jìn)食及飲水明顯減少，伴有大便次數(shù)增加，腹瀉明顯，72h及7d時(shí)體力及體重較對(duì)照組有明顯下降，與OXIPN臨床表現(xiàn)相近。毛發(fā)未見明顯脫落，未見明顯血便、血尿等不良反應(yīng)。

2．2 機(jī)械性痛閾

與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組在造模成功后6h，機(jī)械性痛閾明顯降低，下降幅度以24h最為顯著，72h降至低點(diǎn)（P＜0．05），在7d時(shí)，機(jī)械性痛閾呈低水平穩(wěn)定。見表1。

表1 各組大鼠機(jī)械性痛閾的比較（g，±s，n＝10）Table 1 Comparison of mechanical threshold in rats of each group（g，±s，n＝10）

表1 各組大鼠機(jī)械性痛閾的比較（g，±s，n＝10）Table 1 Comparison of mechanical threshold in rats of each group（g，±s，n＝10）

與對(duì)照組比較，＊P＜0．05

組別 造模前 造模后6h造模后24h造模后72h造模后7d對(duì)照組14．5±2．3 13．9±3．7 13．5±4．1 14．3±2．7 13．7±3．5實(shí)驗(yàn)組14．6±2．7 11．6±2．2＊ 6．6±3．0＊ 3．9±1．4＊ 3．8±2．6＊

2．3 冷刺激縮足潛伏期

與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組在造模6h后，冷刺激縮足潛伏期隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸降低（P＜0．05），并且在造模后72h降至最低，提示為冷痛覺異常（表2）。

表2 各組大鼠冷刺激縮足潛伏期的比較（s，±s，n＝10）Table 2 Comparison of cold allodynia in rats of each group（s，±s，n＝10）

表2 各組大鼠冷刺激縮足潛伏期的比較（s，±s，n＝10）Table 2 Comparison of cold allodynia in rats of each group（s，±s，n＝10）

與對(duì)照組比較，＊P＜0．05

組別 造模前 造模后6h造模后24h造模后72h造模后7d對(duì)照組4．0±0．2 3．9±0．2 3．8±0．8 4．0±0．9 3．9±0．5實(shí)驗(yàn)組 3．9±0．6 2．1±0．3＊ 1．2±0．5＊ 1．2±0．4＊ 1．3±0．4＊

2．4 Western blot檢測(cè)CGRP表達(dá)

如圖1所示，正常大鼠的脊髓背根神經(jīng)節(jié)中CGRP表達(dá)水平低，注射奧沙利鉑造模后6h，大鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)中CGRP表達(dá)水平明顯升高（P＜0．05），同時(shí)，隨著觀察時(shí)間的延長(zhǎng)，大鼠神經(jīng)受損加重，CGRP的表達(dá)量也隨之明顯上調(diào)，在72h時(shí)表達(dá)量較造模前明顯升高［（0．90±0．06）vs．（0．07±0．01），P＜0．05］，7d時(shí)表達(dá)水平與72h時(shí)無明顯差異［（0．92±0．04）vs．（0．90±0．06），P＞0．05］。Spearman等級(jí)相關(guān)分析顯示，CGRP表達(dá)水平與機(jī)械性痛閾呈正相關(guān)（rs＝0．575，P＜0．05）。

圖1 Western blot檢測(cè)造模前后CGRP在脊髓背根神經(jīng)節(jié)中的表達(dá)Fig．1 Western blot of CGRP in dorsal horn and dorsal root ganglion of rats in each group

2．5 免疫組化檢測(cè)CGRP表達(dá)

切片經(jīng)CGRP免疫組化染色后，可見免疫反應(yīng)物呈黃棕色聚集于脊髓背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞質(zhì)中。對(duì)照組神經(jīng)節(jié)中CGRP的表達(dá)量低，僅可見胞質(zhì)內(nèi)少許散在表達(dá)，與之形成鮮明對(duì)比的是，在實(shí)驗(yàn)組中，神經(jīng)細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)CGRP表達(dá)豐富，在胞質(zhì)內(nèi)呈大顆粒狀，見圖2。兩組間免疫組化染色陽性神經(jīng)元的平均吸光度值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［（0．28±0．03）vs．（0．10±0．01），P＜0．05］。

圖2 免疫組化染色檢測(cè)脊髓背根神經(jīng)節(jié)中CGRP的表達(dá)（×400）Fig．2 Immunohistochemical staining of CGRP in dorsal horn and dorsal root ganglion of rats in each group（×400）

3 討論

隨著惡性腫瘤發(fā)病率日趨增高，奧沙利鉑作為新型鉑類化療藥物，由于其與順鉑無交叉耐藥，骨髓抑制輕微且不良反應(yīng)輕等優(yōu)勢(shì)，目前已經(jīng)成為多種惡性腫瘤的一線化療藥物［5］。然而，許多患者使用奧沙利鉑后會(huì)出現(xiàn)外周神經(jīng)病變，其急性神經(jīng)毒性常表現(xiàn)為肢體末端感覺異常，遇冷誘發(fā)并加重；而慢性神經(jīng)毒性表現(xiàn)常表現(xiàn)為劑量依賴性的慢性神經(jīng)病理性痛，由于目前尚無確切的防治措施，給患者帶來諸多痛苦［1］。研究提示奧沙利鉑具有較高的周圍神經(jīng)系統(tǒng)親和性［6］，因周圍神經(jīng)系統(tǒng)缺乏血－神經(jīng)屏障的保護(hù)，容易受到化學(xué)藥物的攻擊，但其具體機(jī)制尚不明確。

CGRP是一類廣泛分布于脊髓背根、三叉神經(jīng)節(jié)等中樞和外周神經(jīng)組織的感覺神經(jīng)元中的神經(jīng)肽，目前認(rèn)為CGRP在疼痛的信息傳遞過程中發(fā)揮了極其重要的作用［7］。當(dāng)軀體受到熱和機(jī)械性傷害刺激時(shí)，外周傳入的傷害性感受信息能促進(jìn)脊髓背根神經(jīng)元釋放CGRP，激活CGRP受體。同時(shí)，CGRP亦可增強(qiáng)脊髓背根谷氨酸和P物質(zhì)等疼痛遞質(zhì)的釋放［8］，進(jìn)一步參與傷害性信息的傳遞和脊髓水平疼痛的形成。在糖尿病外周神經(jīng)炎癥時(shí)，脊髓背根的CGRP的表達(dá)量與病變程度成正比［9］。在神經(jīng)病理性痛模型中，當(dāng)鞘內(nèi)注射CGRP受體拮抗劑后，不僅機(jī)械痛覺過敏的程度被減輕，而且神經(jīng)病理性痛發(fā)生的時(shí)間窗也被推遲了［10］。但是在化療藥物所誘導(dǎo)的外周神經(jīng)病變中，CGRP的作用仍然是個(gè)未知數(shù)。

本實(shí)驗(yàn)，我們應(yīng)用奧沙利鉑腹腔注射成功建立了大鼠神經(jīng)病變模型，一次性注射奧沙利鉑后，大鼠在短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)機(jī)械性痛閾下降，表現(xiàn)出機(jī)械性痛敏現(xiàn)象，而且這種痛覺超敏逐漸加重，并一直持續(xù)到第7天。同時(shí)，大鼠的冷疼痛過敏現(xiàn)象也很突出，這與臨床上奧沙利鉑誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛多因冷促發(fā)相一致。為了進(jìn)一步了解OXIPN的發(fā)病機(jī)制，我們檢測(cè)了造模前后脊髓背根神經(jīng)節(jié)中CGRP的蛋白表達(dá)水平，檢測(cè)結(jié)果提示，正常大鼠中CGRP的表達(dá)水平低，但應(yīng)用奧沙利鉑化療后，脊髓中CGRP的表達(dá)水平上調(diào)，并且我們通過免疫組化原位檢測(cè)進(jìn)一步證實(shí)了奧沙利鉑化療前后，CGRP在脊髓背根神經(jīng)節(jié)中的表達(dá)差異，提示奧沙利鉑可以促進(jìn)脊髓背根神經(jīng)元表達(dá)并釋放CGRP。并且，隨著神經(jīng)病理性疼痛程度的加重，CGRP的表達(dá)水平也隨之升高，與周圍神經(jīng)病變的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。

因此，我們可以推測(cè)，CGRP在奧沙利鉑誘導(dǎo)的周圍神經(jīng)病變中發(fā)揮了促進(jìn)作用，抑制CGRP在脊髓背根的表達(dá)或阻斷CGRP與受體結(jié)合，可能為防止和治療OXIPN提供一條新的途徑，但這仍需要進(jìn)一步的干預(yù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

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