王國麗 大寶貴嗣 山崎和生 Stefania Danko 鈴木裕＊

（1中國醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，沈陽110001；2旭川醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)講座，日本 旭川078－8501）

SERCA1a是肌漿網(wǎng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶 （sarco－endoplasmic calcium transporting ATPase，SERCA）的成人骨骼肌型，通過主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)鈣離子入肌漿網(wǎng)，維持細(xì)胞正常的鈣離子濃度及梯度，保證肌肉收縮舒張的正常進(jìn)行［1］。在應(yīng)用突變法研究SERCA1a結(jié)構(gòu)及功能關(guān)系時(shí)，有些變異型SERCA1a在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)后，無法提取足夠的微粒體蛋白進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。為尋找SERCA1a表達(dá)的最適條件，解決這類蛋白質(zhì)獲取不足問題，本文通過比較COS1表達(dá)的外源性SERCA1a表達(dá)量及酶活性的檢測(cè)結(jié)果，對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)溫度、時(shí)間、轉(zhuǎn)染試劑用量以及攜帶兔SERCA1a cDNA的p MT2質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染用量等可能影響SERCA1a表達(dá)的因素進(jìn)行了評(píng)估。

材料和方法

1.一般材料

非洲綠猴腎細(xì)胞COS1細(xì)胞購自ATCC。DMEM、FBS、Lipofactamine、plus reagent購自Invitrogen。p MT2載體和p MT2－SERCA1a質(zhì)粒獲贈(zèng)于加拿大多倫多大學(xué)D.H.Mac Lennan教授。其余試劑分別購自日本和光株式會(huì)社和Sigma公司。

2.細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

COS1細(xì)胞在10 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。培養(yǎng)基為含10%FBS的DMEM，無抗生素。培養(yǎng)箱設(shè)置100%濕度、5%CO2，常規(guī)培養(yǎng)溫度為37℃。

細(xì)胞融合度70%左右進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染過程中使用無血清DMEM。常規(guī)每皿加入p MT2空質(zhì)?；騪 MT2－SERCA1a質(zhì)粒 DNA 8μg、lipofactamine 60μl、plus reagent 40μl混合物孵育5 h。更換含血清的DMEM后，于37℃或者降低至34℃、31℃繼續(xù)培養(yǎng)2至5 d。每皿DNA 4μg或lipofactamine 30μl、plus reagent 20μl的常規(guī)半量轉(zhuǎn)染亦分別進(jìn)行，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)與常規(guī)全量轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)相同。

3.微粒體制備

將10 cm培養(yǎng)皿內(nèi)貼壁生長的COS1細(xì)胞用5 ml PBS洗2次后收集至2 ml含5 mmol／l EDTA的PBS液，再用5 ml PBS洗1次。加2 ml低滲液（10 mmol／l Tris－HCl、p H 7.5、0.5 mmol／l MgCl2），10 min后加入蛋白酶抑制劑aprotinin 200μ和100 mmol／l PMSF 20μl，使用Dounce玻璃勻漿器勻漿40下。加入2 ml溶液A（蔗糖0.5 mol／l、β巰基乙醇6 mmol／l、CaCl240μmol／l、KCI 300 mmol／l、Tris－HCl 10 mmol／l，p H 7.5），繼續(xù)勻漿20下，10000 g離心20 min。將上清與2.5 mol／l KCl 0.9 ml混勻，150000 g離心10 min（Himac CS 100FX，Hitachi）。微粒體沉淀用100μl溶液B混懸，零下80℃保存。溶液B成分為蔗糖0.25 mol／l、β巰基乙醇3 mmol／l、CaCl220μ mol／l、KCI 150 mmol／l、Tris－HCl 10 mmol／l，p H 7.5。離心在4℃進(jìn)行，其它步驟均在低溫實(shí)驗(yàn)室內(nèi)冰上完成。

4.蛋白質(zhì)定量

微粒體蛋白濃度的檢測(cè)應(yīng)用Lowry法，每樣本或標(biāo)準(zhǔn)品設(shè)4平行孔，變異系數(shù)低于2%。

微粒體中的SERCA1a蛋白由雙抗體夾心ELISA法定量。固相抗體為羊抗兔SERCA1a IgG，一抗為鼠SERCA1a單克隆抗體（MA3－911，Affinity Bioreagents），二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體IgG，底物為TMB（Life Technologies）。加入0.2 N硫酸終止顯色反應(yīng)，450 nm測(cè)吸光度。每個(gè)樣本或每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)品均設(shè)5個(gè)平行孔。

5.SERCA1a蛋白特異的的Ca2＋－ATP酶活性檢測(cè)

應(yīng)用同位素法對(duì)SERCA1a水解ATP的酶活性進(jìn)行檢測(cè)。ATP水解的速率在25℃測(cè)定。反應(yīng)體系為50μl，含10μg／ml微粒體蛋白、50 mmol／l MOPS／Tris（p H 7.0）、0.1 mol／l KCl、7 mmol／l MgCl2、0.55 mmol／l CaCl2、0.5mmol／l EGTA、1μmol／l A23187、0.1 mmol／l［γ－32P］ATP。反應(yīng)時(shí)間為5、10、15、20 min。萃取游離磷酸，進(jìn)行β閃爍計(jì)數(shù)。其時(shí)間放射性曲線為直線，斜率即單位時(shí)間內(nèi)被0.5μg微粒體蛋白水解的ATP量。上述ATP酶活性需減去非鈣離子依賴的ATP酶活性，方為Ca2＋依賴的ATP酶活性。非鈣離子依賴的ATP酶活性檢測(cè)體系含5 mmol／l EGTA，但不加CaCl2，其余同上。計(jì)算過表達(dá)的外源SERCA1a蛋白特異的Ca2＋－ATP酶活性，還需要減去由p MT2空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞制備的對(duì)照微粒體蛋白的Ca2＋－ATP酶活性本底，該本底為COS1細(xì)胞內(nèi)源蛋白的Ca2＋－ATP酶活性，低于外源性SERCA1a蛋白Ca2＋－ATP酶活性的3%。

6.SERCA1a蛋白的EP生成量測(cè)定

EP生成量在0℃測(cè)定。反應(yīng)體積為50μl，含50 μg／ml微粒體蛋白、50 mmol／l MOPS／Tris （p H 7.0）、0.1 mol／l KCl、7 mmol／l MgCl2、0.55 mmol／l CaCl2、0.5mmol／l EGTA、1 μmol／l A23187、0.01 mmol／l［γ－32P］ATP。反應(yīng)10 s，加入15%TCA 及0.3 mol／l Pi。離心，5%SDS－PAGE分離沉淀蛋白質(zhì)后，與標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)進(jìn)行放射自顯影定量?？召|(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的微粒體蛋白EP生成量做為本底被減去，其EP生成量低于含外源SERCA1a的微粒體蛋白的EP生成量的5%。

7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

1.SERCA1a蛋白表達(dá)量檢測(cè)

p MT2－SERCA1a質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞提取的微粒體蛋白含外源DNA過度表達(dá)的野生型SERCA1a（wild type，wt），而p MT2空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞提取的微粒體蛋白僅含內(nèi)源性鈣離子ATP酶SER－CA，故作為分析和計(jì)算的對(duì)照或本底（control，ct）。37℃培養(yǎng)的細(xì)胞微粒體蛋白的產(chǎn)量約為0.1 mg／皿，而其中SERCA1a的含量大致為1－2%。

質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染用量、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間對(duì)微粒體蛋白表達(dá)量及SERCA1a表達(dá)量的影響分別參見表1和圖1。37℃培養(yǎng)的結(jié)果與34℃培養(yǎng)接近，不同條件的常規(guī)全量轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染的微粒體蛋白及SERCA1a定量結(jié)果與半量試劑轉(zhuǎn)染結(jié)果無明顯差異，故本文圖表未列出37℃培養(yǎng)及常規(guī)全量試劑轉(zhuǎn)染的具體數(shù)據(jù)。

Lowry定量結(jié)果（表1）表明，微粒體蛋白表達(dá)量在培養(yǎng)3至4 d達(dá)到高峰，培養(yǎng)溫度變化對(duì)其無顯著影響。培養(yǎng)1 d微粒體蛋白量隨著培養(yǎng)溫度升高而增長，符合細(xì)胞生長增殖與溫度的正相關(guān)關(guān)系。培養(yǎng)5 d，4μg DNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞微粒體蛋白量明顯高于8μg DNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞（P＜0.01）。

表1 Lowry法微粒體蛋白定量結(jié)果Table 1 Detection of microsomal proteins by Lowry method

ELISA檢測(cè)結(jié)果（圖1）顯示降低細(xì)胞培養(yǎng)溫度及提高DNA轉(zhuǎn)染用量，可一定程度提高SERCA1a表達(dá)量。SERCA1a表達(dá)量在8μg DNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞31℃培養(yǎng)3 d最高，顯著高于其他轉(zhuǎn)染及培養(yǎng)條件下的SERCA1a表達(dá)量（P＜0.01）。其他轉(zhuǎn)染及培養(yǎng)條件均在4 d達(dá)到高峰。

圖1 微粒體蛋白中SERCA1a濃度的ELISA檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Detection of SERCA1a in microsomal proteins by ELISA

2.SERCA1a酶活性評(píng)估

34℃表達(dá)的SERCA1a的ATP酶活性顯著高于31℃表達(dá)的SERCA1a（P＜0.01，圖2），但仍明顯低于37℃表達(dá)的SERCA1a水解ATP的速度3.36±0.03 mol／min／mg（P＜0.05）［2］。31℃表達(dá)的SERCA1a的ATP酶活性隨著細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間延長而增加（P＜0.01），此變化趨勢(shì)在34℃不典型。37℃SERCA1a的ATP酶活性在細(xì)胞培養(yǎng)2至5 d期間無明顯變化，亦不受其他轉(zhuǎn)染及培養(yǎng)條件影響。

圖2 SERCA特異性的鈣離子ATP酶活性Fig.2 Specific Ca2＋ATPase of SERCA

EP定量結(jié)果與ATP酶活性的結(jié)果的變化趨勢(shì)基本一致（圖3）。37℃表達(dá)的SERCA1a生成EP總量為3.31±0.41 nmol／mg2，顯著高于31℃表達(dá)的SERCA1a（P＜0.01），但是僅略高于34℃表達(dá)的SERCA1a，甚至略低于34℃培養(yǎng)5 d的細(xì)胞表達(dá)的SERCA1a。

圖3 SERCA1a的磷酸化酶中間體EP的生成水平Fig.3 Phosphorylation level of SERCA1a

討 論

檢測(cè)結(jié)果表明：微粒體蛋白量在細(xì)胞培養(yǎng)3至4 d達(dá)到高峰，改變轉(zhuǎn)染及細(xì)胞培養(yǎng)條件，未見明顯變化；降低細(xì)胞培養(yǎng)溫度及提高DNA轉(zhuǎn)染用量，可增加SERCA1a表達(dá)量，SERCA1a表達(dá)量在8μg DNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞31℃培養(yǎng)3 d達(dá)到最高；降低細(xì)胞培養(yǎng)溫度后，SERCA1a的ATP酶活性及EP生成量也隨之下降，并且ATP酶活性比EP生成量的下降幅度更大。在最低的細(xì)胞培養(yǎng)溫度31℃，SERCA1a的ATP酶活性及EP生成量隨著細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間延長而增加，而此趨勢(shì)在34℃和37℃表達(dá)的SERCA1a卻不明顯。

通過一系列實(shí)驗(yàn)，可以確定瞬時(shí)轉(zhuǎn)染COS1細(xì)胞表達(dá)外源SERCA1a蛋白的最適條件為常規(guī)的半量轉(zhuǎn)染試劑、全量DNA、37℃培養(yǎng)3至4 d。不過全量DNA轉(zhuǎn)染與半量DNA轉(zhuǎn)染相比，SERCA1a表達(dá)量雖然最高可增至1.5倍，在質(zhì)粒DNA量不十分充足時(shí)，增加培養(yǎng)皿的數(shù)目比單皿DNA用量加倍可收獲更多SERCA1a蛋白。而應(yīng)用常規(guī)半量轉(zhuǎn)染試劑的優(yōu)勢(shì)則十分突出，比使用全量轉(zhuǎn)染試劑經(jīng)濟(jì)，又在不減少SERCA1a產(chǎn)量的前提下，降低轉(zhuǎn)染試劑對(duì)細(xì)胞的毒性。

我們的結(jié)果與Muerhoff AS.的報(bào)道接近，提示瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞在37℃培養(yǎng)3至4 d，細(xì)胞生長增殖達(dá)及外源蛋白的表達(dá)均達(dá)到高平臺(tái)期［3］。然而在我們的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)了值得特別注意的現(xiàn)象，那就是降低細(xì)胞培養(yǎng)溫度可以提高外源蛋白的產(chǎn)量，但是這些過度表達(dá)的SERCA1a的EP生成量降低，ATP酶活性的降低更加顯著。在SERCA1a水解ATP轉(zhuǎn)運(yùn)鈣離子的5步反應(yīng)循環(huán)中［2］，SERCA1a先被ATP磷酸化形成磷酸化的酶中間體EP，然后EP被水解釋放有機(jī)磷酸，才能全部完成ATP水解成ADP和磷酸的反應(yīng)（圖4）。因此，低溫表達(dá)的SERCA1a表達(dá)量增加，EP生成量降低，ATP酶活性的降低更多，可以用低溫條件下蛋白錯(cuò)誤折疊增加而蛋白降解相關(guān)蛋白的活性下降解釋［4－6］。在31℃，細(xì)胞內(nèi)錯(cuò)誤折疊的SERCA1a增加，而細(xì)胞降解錯(cuò)誤折疊和衰老蛋白質(zhì)的能力下降，所以定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的SERCA1a有一部分結(jié)構(gòu)異常，這部分蛋白質(zhì)可能無法形成EP，即使形成EP，這些EP可能無法水解生成無機(jī)磷酸或者水解速度減低。31℃表達(dá)的SERCA1a的ATP酶活性及EP生成量隨培養(yǎng)時(shí)間延長而的變化趨勢(shì)從另一個(gè)角度支持上述觀點(diǎn)。在31℃，蛋白正確折疊與蛋白降解相關(guān)蛋白的活性下降，然而隨培養(yǎng)時(shí)間的延長，正確折疊蛋白質(zhì)的比例及應(yīng)降解蛋白質(zhì)的降解總量不斷增長，達(dá)到高平臺(tái)期的時(shí)間晚于37℃和34℃，所以呈現(xiàn)5 d內(nèi)SERCA1a的ATP酶活性及4 d內(nèi)EP生成量隨培養(yǎng)時(shí)間延長而增加的趨勢(shì)。

圖4 SERCA1a反應(yīng)循環(huán)模式圖Fig.4 The reaction cycle of SERCA1a

綜上所述，增加外源SERCA1a蛋白在COS1細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)可通過提高DNA轉(zhuǎn)染用量實(shí)現(xiàn)。降低細(xì)胞培養(yǎng)溫度雖可增加SERCA1a表達(dá)量，但引起SERCA1a蛋白的ATP酶活性和EP生成量下降。為獲取足夠的目的蛋白進(jìn)行研究，對(duì)瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)染及培養(yǎng)條件進(jìn)行最適化是必要的。需要特別注意的是某些條件下部分過度表達(dá)的外源蛋白可能不具備正常的結(jié)構(gòu)與功能。用蛋白定量替代蛋白的生物功能及生物效應(yīng)監(jiān)測(cè)的場合，需要謹(jǐn)慎地進(jìn)行結(jié)論推斷。

［1］鈴木裕.ポンプの構(gòu)造／機(jī)能連関および遺伝子異常と細(xì)胞病態(tài).生化學(xué)，2003，75（9）：1215－1224

［2］Wang GL，Yamasaki K，Daiho T，et al.Critical hydrophobic interactions between phosphorylation and actuator domains of Ca2＋－ATPase for hydrolysis of phosphorylated intermediate.J Biol Chem，2005，280：26508－26516

［3］Muerhoff AS，Dawson GJ，Dille B，et al.Enzyme－linked immunosorbent assays using recombinant envelope protein expressed in COS－1 and Drosophila S2 cells for detection of west Nile virus immunoglobulin M in serum or cerebrospinal fluid.Clin Diagn Lab Immun，2004，11（4）：651－657

［4］Sapiess C，Beil A，Ehrmann M.A temperature－dependent switch from chaperone to protease in a widely conserved heat shock protein.Cell，1999，97（3）：339－347

［5］Voges D，Zwick IP，Baumeister W.The 26S proteasome：a molecular machine designed for controlled proteolysis.Annu Rev Biochem，1999，68：1012－1068

［6］Lecker SH，Goldberg AL，Mitch WE.Protein degradation by the ubiquitin－proteasome pathway in normal and disease states.J Am Soc Nephrol，2006，17：1807－1819