曹志平，張慧，李輝

（農(nóng)業(yè)部雞遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030）

雞Spot14α基因多態(tài)性與體重的相關(guān)研究

曹志平，張慧，李輝*

（農(nóng)業(yè)部雞遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030）

以雞Spot14α基因作為影響雞體重候選基因，采用PCR-RFLP、變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和DNA測(cè)序方法檢測(cè)雞Spot14α基因多態(tài)性，以東北農(nóng)業(yè)大學(xué)F2資源群體（NEAUF2）為研究材料，進(jìn)行Spot14α基因多態(tài)性與雞體重相關(guān)分析。結(jié)果表明，Spot14α基因A-40G、3 bp插入/缺失以及兩個(gè)位點(diǎn)構(gòu)建單倍型的多態(tài)性均與5～12周齡體重和屠體重顯著相關(guān)（P＜0.05），推測(cè)Spot14α基因是影響雞體重的主效基因或與主效基因相連鎖。

雞；Spot14α基因；多態(tài)性；單倍型；體重

數(shù)量遺傳學(xué)和分子遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，畜禽數(shù)量性狀受微效多基因或主效基因（Major gene）控制，選擇與數(shù)量性狀基因座（Quantitative trait loci，QTL）相連鎖分子遺傳標(biāo)記（基因的或非基因的）可實(shí)現(xiàn)基因型直接選擇。將傳統(tǒng)育種方法和現(xiàn)代分子遺傳學(xué)方法結(jié)合運(yùn)用于家禽育種實(shí)踐，能有效提高選擇效率和生產(chǎn)性能。

甲狀腺激素誘導(dǎo)的核內(nèi)蛋白（Thyroid hormo?neinducible nuclear protein spot14）稱甲狀腺激素響應(yīng)Spot14蛋白（THRSP）。Seelig在研究甲狀腺激素作用，甲狀腺激素和飲食在調(diào)節(jié)基因表達(dá)中相互作用的分子機(jī)制時(shí)，從鼠肝中分離出231種mRNA中發(fā)現(xiàn)Spot14[1]，其mRNA能對(duì)甲狀腺激素迅速響應(yīng)，因此稱為甲狀腺激素響應(yīng)Spot14蛋白基因。該基因啟動(dòng)子區(qū)含有3個(gè)甲狀腺素應(yīng)答元件（Thyroid responseelements，TRE），對(duì)甲狀腺激素刺激產(chǎn)生快速應(yīng)答[2]。雞Spot14基因首次從雞肝臟中分離并得到確定[3]，后被定位于染色體1q41-44位置[4]，有兩個(gè)亞型，Spot14α和Spot14β。雞的Spot14α基因含有兩個(gè)外顯子和一個(gè)內(nèi)含子，外顯子長(zhǎng)分別為422和355 bp，內(nèi)含子長(zhǎng)637 bp，只有第一外顯子編碼蛋白[5]。盡管雞Spot 14基因編碼氨基酸序列與哺乳動(dòng)物的相似性較低[6]，但在亞細(xì)胞定位、轉(zhuǎn)錄控制和功能結(jié)構(gòu)域方面卻高度保守[7]。

Spot14α基因是甲狀腺激素敏感基因，該基因?qū)C(jī)體生長(zhǎng)具有重要作用。本研究以Spot14α基因作為影響雞體重候選基因，在專門設(shè)計(jì)的資源群體中研究該基因變異，結(jié)合數(shù)量遺傳學(xué)、生物統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析這些變異對(duì)雞體重影響程度，探討Spot14α基因是否為影響雞體重的主效基因及能否作為分子標(biāo)記對(duì)家禽體重進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)雞群和性狀測(cè)定

本研究以東北農(nóng)業(yè)大學(xué)F2資源群體（NEAUF2）為試驗(yàn)動(dòng)物。該群體以東北農(nóng)業(yè)大學(xué)高、低脂雙向選擇品系的高脂系肉雞為父本，白耳雞為母本雜交產(chǎn)生F1代雞群，F(xiàn)1代自交后產(chǎn)生F2代資源群體，F(xiàn)2雞群共12個(gè)半同胞家系，1 011只個(gè)體。在F2代雞只出生及1～12周齡時(shí)，稱量體重；在12周齡時(shí)翅靜脈采血，EDTA-Na2抗凝。

1.2 引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增

根據(jù)GenBank中提供的雞Spot14α基因的mRNA序列（Genbank NO:AY568628）與雞基因組比對(duì)后的雞Spot14α基因的基因組序列共設(shè)計(jì)3對(duì)引物，進(jìn)行雞Spot14α基因的多態(tài)性檢測(cè)和基因型分析。具體引物信息見表1。

表1 雞Spot14α基因的引物信息Table 1 Information of primers within the Spot14α gene

PCR擴(kuò)增體系為25 μL，反應(yīng)體系中含10×PCR buffer 2.5 μL、10 mmol·L-1dNTPs 2 μL、10 pmol·L-1上下游引物各0.5 μL、Taq酶1.0 U、50 ng·μL-1DNA模板1 μL、ddH2O 18.3 μL。PCR擴(kuò)增條件94℃變性7 min，94℃30 s，55～58℃30 s，72℃40 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保溫。

1.3 基因型分析

本研究采用PCR-RFLP和變性聚丙烯酰胺凝膠電泳方法進(jìn)行基因型分析。利用引物S2擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物，經(jīng)過MSPI內(nèi)切酶37℃消化3 h后，用14%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳、銀染后記錄基因型。引物S3擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物用滅菌去離子水稀釋20～30倍,取1 μL稀釋產(chǎn)物，加入等量上樣緩沖液（含ROX350分子質(zhì)量?jī)?nèi)標(biāo)）。上樣前，95℃變性5 min，取出后立即插置冰上。變性的PCR產(chǎn)物用6%變性聚丙烯酰胺凝膠在ABI377序列分析儀上電泳3 h，收集膠圖像。應(yīng)用Genotyper TM2.5軟件進(jìn)行基因分型。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)F2資源群體的特點(diǎn)，構(gòu)建如下統(tǒng)計(jì)模型：

Y=μ+H+G+S+G*H+G*S+F+D（F）+e

其中：Y為性狀觀察值，μ為群體均值，G為基因型固定效應(yīng)，L為品系固定效應(yīng)，F(xiàn)（L）為品系內(nèi)家系的隨機(jī)效應(yīng)，D（F，L）為家系與品系內(nèi)母雞的隨機(jī)效應(yīng)，H為孵化批次固定效應(yīng)，S為性別固定效應(yīng)，F(xiàn)為家系隨機(jī)效應(yīng)，D（F）家系內(nèi)母雞的隨機(jī)效應(yīng)，e為剩余值。使用統(tǒng)計(jì)軟件JMP 4.0（SAS Institute，2000）檢驗(yàn)F2群體基因型與性狀間的相關(guān)程度，并估計(jì)性狀的最小二乘均值。

本研究采用的是Hedrick等[8]度量連鎖不平衡簡(jiǎn)化模型，假設(shè)2個(gè)位點(diǎn)，共形成4種單倍型，單倍型頻率分別表示為f11，f12，f21，f22。而f1+=f11+f12，f+1=f11+f21，f2+=f21+f22，f+2=f12+f22。連鎖不平衡定義式是：D=f11f22-f12f21。2個(gè)最常用連鎖不平衡度量標(biāo)準(zhǔn)是r2和D′。r2值大小和關(guān)聯(lián)分析效力直接相關(guān)[9]。如果r2＞0.1，可以認(rèn)為構(gòu)建單倍型的兩個(gè)標(biāo)記之間為有意義連鎖、作為一整體遺傳[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞Spot14α基因多態(tài)性檢測(cè)

將引物S1擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆測(cè)序，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)。一個(gè)是位于雞Spot14α基因5′調(diào)控區(qū)的A/G突變，命名為A-40G（見圖1）；一個(gè)是位于3′調(diào)控區(qū)的3 bp插入/缺失，命名為3bpI/ D（見圖2）。

圖1 Spot14α基因A-40G對(duì)應(yīng)的測(cè)序結(jié)果Fig.1 Sequence results of Spot14α gene A-40G

圖2 Spot14α基因3bpI/D對(duì)應(yīng)的測(cè)序結(jié)果Fig.2 Sequence results of Spot14α gene 3 bp insertionion/deletion

2.2 個(gè)體基因型分析

針對(duì)測(cè)序發(fā)現(xiàn)的A-40G、3 bpI/D兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性引物S2和S3，以NEAUF2資源群體基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PCR擴(kuò)增特異性良好，片段長(zhǎng)度與所設(shè)計(jì)的片段大小一致（引物S2擴(kuò)增長(zhǎng)度190 bp，引物S3擴(kuò)增長(zhǎng)度213 bp），可以用于后續(xù)的基因型分析。

A-40G的PCR產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳后，結(jié)果檢測(cè)出3種基因型，分別命名為GG、GH、HH型，見圖3。3bpI/D的PCR產(chǎn)物通過測(cè)序后，結(jié)果檢測(cè)出3種基因型，分別命名為MM（含有3 bp）、MN、NN（缺失3 bp）型。

圖3 不同基因型個(gè)體的聚丙烯凝膠電泳Fig.3 Polyacrilamide gel electrophoresis of different individuals

2.3 雞Spot14α基因多態(tài)性與體重的相關(guān)分析

以NEAUF2群體為研究群體，對(duì)雞Spot14α基因多態(tài)性與體重進(jìn)行相關(guān)分析（見表2），結(jié)果表明，A-40G多態(tài)性位點(diǎn)產(chǎn)生3種基因型對(duì)雞6～12周齡體重及屠體重有顯著影響（P＜0.05），在該群體中分別對(duì)3種基因型個(gè)體間體重的最小二乘均值進(jìn)行多重比較（見表3），結(jié)果表明，HH基因型個(gè)體的5～12周齡體重和屠體重顯著的高于GG基因型個(gè)體；3 bp I/D多態(tài)性位點(diǎn)產(chǎn)生3種基因型對(duì)5～12周齡體重及屠體重有顯著影響（P＜0.05），在該群體中分別對(duì)3種基因型個(gè)體間體重的最小二乘均值進(jìn)行多重比較（見表4），結(jié)果表明，NN基因型個(gè)體5～12周齡體重和屠體重顯著高于MM基因型個(gè)體。

表2 雞Spot14α基因多態(tài)位點(diǎn)與體重的相關(guān)分析Table 2 Association between the polymorphisms of Spot14α gene with body weight in chicken (g)

表3 Spot14α基因A-40G多態(tài)位點(diǎn)的不同基因型對(duì)雞體重的影響（最小二乘均值）Table 3 Effects of Spot14α A-40G polymorphism site on body weight(LSM）

表4 Spot14α基因3 bp插入/缺失位點(diǎn)的不同基因型對(duì)雞體重的影響（最小二乘均值）Table 4 Effects of Spot14α 3 bp insertion/deletion polymorphism site on body weight(LSM）

表5 雞Spot14α基因單倍型的構(gòu)建Table 5 Haplotype construction of chicken Spot14α gene

在NEAUFF2群體中，A-40G和3 bpI/D兩個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性均與5～12周齡體重顯著相關(guān)，且兩個(gè)位點(diǎn)又位于基因的兩端。因此，本研究利用A-40G和3 bpI/D兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)對(duì)該基因進(jìn)行單倍型分析。在NEAUF2群體中，A-40G和3 bpI/D多態(tài)性位點(diǎn)的連鎖不平衡系數(shù)r2值大于0.1（r2= 0.13），見表5，兩個(gè)位點(diǎn)是有意義連鎖，其單倍型塊可作為一個(gè)整體遺傳。因此，對(duì)其進(jìn)行單倍型與體重的相關(guān)分析，結(jié)果見表2。結(jié)果表明A-40G和3 bpI/D兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的單倍型對(duì)5周齡體重有顯著影響（P＜0.05），6～12周齡體重以及屠體重有極顯著影響（P＜0.01）。分別對(duì)六種單倍型基因型個(gè)體間體重的最小二乘均值進(jìn)行多重比較（見表6），結(jié)果表明，在NEAUF2群體中，NH/NH基因型個(gè)體的5～12周齡體重和屠體重顯著高于MG/MG基因型個(gè)體。

表6 單倍型間的多重比較結(jié)果Table 6 Multi-contrast comparison among different diplotypes

3 討論與結(jié)論

Spot14基因是甲狀腺激素響應(yīng)基因，甲狀腺調(diào)節(jié)基因表達(dá)通過甲狀腺激素受體完成，甲狀腺激素受體通過結(jié)合在甲狀腺激素響應(yīng)基因上游啟動(dòng)子區(qū)調(diào)節(jié)同源基因表達(dá)。Spot14基因?qū)谞钕偌に仨憫?yīng)與結(jié)構(gòu)有關(guān)。大鼠Spot14基因是第一個(gè)在分子水平上被確定為甲狀腺素響應(yīng)的基因[11-13]，該基因啟動(dòng)子區(qū)存在3個(gè)甲狀腺激素響應(yīng)元件[12,14]。Spot14家族所有成員氨基酸序列都存在3個(gè)保守區(qū)域，即亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)和兩個(gè)疏水區(qū)域[15]。Spot14基因家族側(cè)翼基因保守性都很高[15]。甲狀腺素屬于下丘腦-垂體-甲狀腺軸，而下丘腦-垂體-甲狀腺軸通過甲狀腺素增加耗氧量和產(chǎn)生熱量調(diào)節(jié)能量動(dòng)態(tài)平衡[16-17]。擾亂甲狀腺素功能會(huì)影響體重和能量消耗[18]，推測(cè)Spot14基因與體重有密切關(guān)系。

哺乳動(dòng)物Spot14基因調(diào)控脂肪生成研究較多[19-21]，該基因是脂質(zhì)合成重要調(diào)節(jié)基因，參與肝臟、乳腺、脂肪等組織中的脂質(zhì)合成調(diào)控[22]，對(duì)乳腺癌生長(zhǎng)有重要影響[23]。小鼠Spot14基因敲除試驗(yàn)顯示，Spot14基因敲除后，小鼠體重增長(zhǎng)速度下降，這是由脂肪蓄積減少導(dǎo)致。雞Spot14基因功能研究報(bào)道很少。在杏花雞和隱形白雞雜交產(chǎn)生F2資源群體中研究結(jié)果顯示，雞Spot14基因的3個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)與雞體重和腹脂性狀顯著相關(guān)[24]。本試驗(yàn)前期研究發(fā)現(xiàn)，在NEAU F2資源群體中雞Spot14基因編碼區(qū)的兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)與雞體重性狀顯著相關(guān)[25]。本研究結(jié)果也顯示，雞Spot14基因兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)與體重顯著相關(guān)，推測(cè)雞Spot14基因?qū)ιL(zhǎng)有重要作用。本推測(cè)結(jié)果尚需進(jìn)一步分子生物學(xué)試驗(yàn)驗(yàn)證。

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Association ofSpot14αgene polymorphisms with body weight inchicken/

CAO Zhiping,ZHANG Hui,LI Hui(Key Laboratory of Chicken Genetics and Breeding, Ministry of Agriculture,School of Animal Science and Technology,Northeast Agricultural University, Harbin 150030,China)

The study was designed to investigate the associations ofSpot14αgene polymorphisms on chicken body weight.The Northeast Agricultural University F2Resource Population(NEAUF2)was used in the present study.The PCR-RFLP and PCR-Length Polymorphisms methods were then developed to genotype polymorphisms in the NEAUF2.The A-40G and 3 bp insertion/deletion of theSpot14αgene in the NEAUF2,was found to be associated with body weight,which implied thatSpot14αgene or a tightly linked gene had broad effects on growth and development in the chicken.

chicken;Spot14αgene;polymorphisms;haplotype;body weight

S831

A

1005-9369（2014）06-0091-06

時(shí)間 2014-6-11 16:21:17 [URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140611.1621.021.html

曹志平,張慧,李輝.雞Spot14α基因多態(tài)性與體重的相關(guān)研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2014,45(6):91-96.

Cao Zhiping,Zhang Hui,Li Hui.Association ofSpot14αgene polymorphisms with body weight in chicken[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(6):91-96.(in Chinese with English abstract)

2013-12-15

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金（CARS-42）；黑龍江省高等學(xué)?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目（2010td02）

曹志平（1980-），女，實(shí)驗(yàn)師，碩士，研究方向?yàn)閯?dòng)物遺傳育種。E-mail:caozhipingneau@126.com

*通訊作者：李輝，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)閯?dòng)物遺傳育種。E-mail:lihui@neau.edu.cn