王啟貴，高廣亮，馬廣偉，張心揚，李輝

（1.農(nóng)業(yè)部雞遺傳育種重點實驗室，哈爾濱 150030；2.黑龍江省普通高等學(xué)校動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，哈爾濱 150030；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030；4.重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460）

雞肝臟膽汁酸結(jié)合蛋白基因啟動子活性分析

王啟貴1,2,3,4，高廣亮1,2,3,4，馬廣偉1,2,3，張心揚1,2,3，李輝1,2,3

（1.農(nóng)業(yè)部雞遺傳育種重點實驗室，哈爾濱 150030；2.黑龍江省普通高等學(xué)校動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，哈爾濱 150030；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030；4.重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460）

研究對雞肝臟膽汁酸結(jié)合蛋白基因（L-BABP）啟動子活性進行研究。利用在線分析軟件分析L-BABP基因啟動子區(qū)，發(fā)現(xiàn)CCAAT box（-306）、TATA box（-995）、GATA-1（-1844）和SRE（-1866）等調(diào)控元件，沒有發(fā)現(xiàn)CpG島。擴增雞L-BABP基因5′側(cè)翼區(qū)約2 kb的DNA片段，構(gòu)建雞L-BABP基因報告基因系列缺失載體。報告基因結(jié)果表明，雞L-BABP基因啟動子-1 096/-66區(qū)域具有最強的啟動子活性，-545/-62區(qū)域啟動子活性最弱；C/ EBPα可以顯著抑制雞L-BABP基因的表達，可為深入研究雞L-BABP的表達調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)。

雞；肝臟膽汁酸結(jié)合蛋白；啟動子；活性分析

脂肪酸結(jié)合蛋白家族（Fatty acid binding pro?teins,FABPs）對細胞內(nèi)脂肪酸的運輸起重要作用[1-3]，通過與脂肪酸結(jié)合增加脂肪酸可溶性，并將其運輸?shù)骄€粒體、過氧化氫酶體等位置進行氧化，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等位置酯化成甘油三酯或磷脂[4]。肝臟型膽汁酸結(jié)合蛋白（Liver bile acid binding protein,L-BABP）屬于FABPs中一員，對脂肪酸結(jié)合能力較弱，而對膽汁酸具有較強親和力，且能夠結(jié)合兩分子膽汁酸[5-6]，該基因特異地存在禽類肝臟組織中[7]。禽類膽固醇在肝臟中可分解為膽汁酸，所以膽汁酸對日糧中脂肪消化和吸收有重要影響[8]，膽固醇經(jīng)肝左右管—肝總管—膽總管，進入十二指腸，參加消化，小腸中的膽汁酸被重吸收，經(jīng)肝門靜脈進入肝臟完成循環(huán)。

目前對于膽汁酸進出肝細胞和小腸上皮細胞受體系統(tǒng)和外排系統(tǒng)的分子機理較為清楚，而膽汁酸在肝臟和小腸細胞中的運輸機制仍不清晰，然而對禽類的L-BABP基因功能研究報道主要集中在對其晶體結(jié)構(gòu)方面研究。晶體結(jié)構(gòu)研究中證實L-BABP基因可能為膽汁酸的運輸者[6]，推測L-BABP基因可能參與膽汁酸的運輸并在膽汁酸代謝途徑中發(fā)揮重要作用。FABPs基因家族各種啟動子保守性非常高，各個成員均既有TATA box[9]，推測C/EBPα基因在轉(zhuǎn)錄水平上對L-BABP基因有一定影響。

本研究構(gòu)建雞L-BABP基因啟動子系列載體并分析其活性，確定其有基本轉(zhuǎn)錄活性啟動子區(qū)域及C/EBPα基因?qū)ζ鋯踊钚杂绊?，為進一步研究雞L-BABP表達調(diào)控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

克隆所用菌株DH5α由農(nóng)業(yè)部雞遺傳育種重點實驗室保存；pMD18-T Simple Vector、限制性內(nèi)切酶MluⅠ、BglⅡ和XhoⅠ內(nèi)切酶和DNA分子質(zhì)量Marker、LA Taq酶，dNTPs購自TaKaRa公司；熒光素酶報告基因載體、pGL3-Basic及海腎熒光素酶報告基因載體pRL2TK購自Promega公司；T4DNA聚合酶、T4DNA連接酶購自北京NEB公司；質(zhì)粒回收試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自AXYGEN生物技術(shù)有限公司；轉(zhuǎn)染試劑Fu GENE HD購自羅氏公司、DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清購自GIBCO公司；熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自Promega公司；引物合成由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成；測序由北京華大基因有限公司完成；人肝癌細胞系（HEPG2）由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院饋贈；C/EBPα表達載體由農(nóng)業(yè)部雞遺傳育種重點實驗室構(gòu)建。

1.2 方法

1.2.1 啟動子的序列分析

利用在線分析軟件MOTIF Search(http://motif.genome.jp/)和TFSEARCH(http://cbrc.jp/research/db/ TFSEARCH.html)分析L-BABP基因轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。利用CpG Island(http://www.bio2soft.net/sms/ cpg_island.html)對序列進行CpG島分析。

1.2.2 雞L-BABP基因啟動子報告基因載體的構(gòu)建

根據(jù)GenBank中雞L-BABP基因序列（Acces?sion，AF380998），設(shè)計特異性引物（見表1）用于擴增雞L-BABP基因啟動子區(qū)，目標片段長度分別為1 922、1 043和479 bp。將擴增的L-BABP-1988/-66，L-BABP-1109/-66，L-BABP-545/-62，片段分別連接到pMD-18-Tsimple亞克隆載體上，利用引物兩端設(shè)計的Mlu I和Xho I單酶切位點，將目的片段從亞克隆載體上切割并回收，回收目的片段并與pGL3-Basic載體連接，利用雙酶切方法篩選陽性重組質(zhì)粒，測序鑒定。

1.2.3 細胞培養(yǎng)

人肝癌細胞系（HEPG2）細胞用含10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基，37℃5%CO2條件下培養(yǎng)，飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)，0.25%胰酶消化液消化傳代，每1.5 d傳代1次。所有試驗均采用對數(shù)生長期的細胞。

1.2.4 雞L-BABP基因啟動子活性分析

細胞接種于12孔板中，待細胞生長至80%匯合時，采用羅氏HD轉(zhuǎn)染試劑按照廠商推薦的方法轉(zhuǎn)染細胞。每孔轉(zhuǎn)染DNA總量為1 μg，pGL3-LBABP系列質(zhì)粒分別與海腎熒光素酶報告基因載體（pRL2TK）的比為100∶1。海腎熒光素酶報告基因載體作為內(nèi)源參照，以消除由于轉(zhuǎn)染效率及細胞活性等因素帶來的差異。轉(zhuǎn)染48 h后，根據(jù)Pro?mega公司熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書，進行熒光素酶活性檢測。試驗重復(fù)5次，每次有3個平行試驗，啟動子相對活性用目的基因熒光/海腎熒光值（Fluc/Rluc）比值表示。

1.2.5 C/EBP基因?qū)﹄uL-BABP基因啟動子活性影響分析

C/EBPα真核表達載體PCMV-HA-L-BABP與分別與不同長度雞L-BABP基因啟動子報告基因載體共轉(zhuǎn)染HEPG2細胞，PCMV-HA載體與不同長度雞L-BABP基因啟動子報告基因載體共轉(zhuǎn)染HEPG2細胞作為對照組。內(nèi)源參照為海腎熒光素酶報告基因載體。以報告基因相對表達量反映啟動子活性。48 h后分別檢測螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性。試驗重復(fù)5次，每次3個平行試驗，啟動子相對活性用目的基因熒光/海腎熒光值（Fluc/Rluc）比值表示。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均為5次獨立試驗結(jié)果，Mean±SD表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析與t檢驗。P＜0.05為差異顯著，P＜0.01差異極顯著。

表1 L-BABP基因引物設(shè)計序列（引物序列中酶切位點序列用下劃線表示）Table 1 Gene-specific primers of L-BABP used for PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 雞L-BABP基因啟動子的生物信息學(xué)分析

利用MOTIF Search和TFSEARCH網(wǎng)站分析雞L-BABP基因5′側(cè)翼區(qū)序列，結(jié)果表明在該基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游處存在調(diào)控基因表達的基本調(diào)控元件，如CCAAT box（-306）、TATA box（-995）、GATA-1（-1844）和SRE（-1866），在轉(zhuǎn)錄起始位點上游1 343處存在C/EBPα的結(jié)合位點。啟動子區(qū)調(diào)控元件見圖1。CpG Island在線分析軟件分析結(jié)果表明，雞L-BABP基因5′側(cè)翼區(qū)2 kb范圍內(nèi)沒有CpG島存在。用該軟件同時分析人和鼠L-BABP基因5′側(cè)翼區(qū)2 kb區(qū)域均無CpG島。

2.2 雞L-BABP基因啟動子的生物信息學(xué)分析

根據(jù)NCBI提供的雞L-BABP(Accession No：AF380998)序列設(shè)計引物，以雞基因組為模板，擴增片段pGL3-L-BABP-1988/-66、pGL3-L-BABP-1096/-66以及pGL3-L-BABP-545/-62（見圖2），并將L-BABP基因系列缺失載體克隆到報告基因載體PGL3-Basic上。提取質(zhì)粒分別用MluⅠ/BglⅡ和MluⅠ/XhoⅠ雙酶切，得到質(zhì)粒初步鑒定為陽性克隆，再通過測序進一步驗證（見圖3）。

圖1 L-BABP基因5′側(cè)翼區(qū)生物信息學(xué)分析Fig.1 Schematic diagram of chicken L-BABP gene promoter

圖2 L-BABP基因啟動子區(qū)系列載體構(gòu)建Fig.2 Schematic diagram of a series of recombination plasmids of chicken L-BABP gene

圖3 pGL3-L-BABP-1988/-66、pGL3-L-BABP-1096/-66以及pGL3-L-BABP-545/-62測序結(jié)果與NCBI提供的雞L-BABP序列比對結(jié)果Fig.3 Result of pGL3-L-BABP-1988/-66、pGL3-L-BABP-1096/-66 and pGL3-L-BABP-545/-62 plasmids blast with the chicken sequence

2.3 雞L-BABP基因啟動子報告基因分析

為進一步研究雞L-BABP基因啟動子不同區(qū)域的活性，將帶有不同長度L-BABP基因啟動子的報告基因表達載體分別與海腎質(zhì)粒（pRL2TK）共轉(zhuǎn)染HEPG2細胞，48 h后分別檢測螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，克隆的三段啟動子報告基因載體均有明顯的啟動活性，與對照空載體質(zhì)粒（pGL3-Basic）相比，差異均達到極顯著水平（P＜0.01）（見圖4）。在-1096/-66區(qū)域，報告基因活性最強，隨著片段由5′端逐漸縮短，報告基因活性逐漸減弱，在-545/-62達到最弱。

2.4 雞C/EBPα基因?qū)-BABP基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控

為進一步研究雞C/EBPα基因?qū)-BABP基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，將不同長度L-BABP基因啟動子的報告基因載體分別與C/EBPα基因真核表達載體共轉(zhuǎn)染HEPG2細胞，48 h后分別檢測螢火蟲熒光素酶活性。結(jié)果表明，C/EBPα基因?qū)-BABP基因啟動子區(qū)有負調(diào)控作用，而且對各片段均有作用，尤其對-1096/-66區(qū)域啟動子活性作用更為明顯，該區(qū)域活性降低了59.24倍（見圖5）。結(jié)果表明，雞L-BABP基因可能受C/EBPα的負調(diào)控，而且啟動子區(qū)內(nèi)存在多個C/EBPα結(jié)合位點。

圖4 L-BABP基因啟動子報告基因活性分析Fig.4 Deletion analysis of the chicken L-BABP promoter fragment

圖5 C/EBPa基因?qū)-BABP基因啟動子報告基因活性的影響Fig.5 C/EBPα activate the L-BABP promoter

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，雞L-BABP基因5′端-1096/-66區(qū)域，報告基因活性最強；在-545/-62區(qū)域，報告基因活性最弱。因此，推測在-1096/-66區(qū)域有重要的正調(diào)控因子結(jié)合位點；-1988/-66區(qū)域有重要的負調(diào)控因子結(jié)合位點。

FABPs基因家族是組織特異性基因并且絕大多數(shù)是在轉(zhuǎn)錄水平上進行調(diào)控的，該基因家族各種啟動子保守性非常高且協(xié)同相互作用[10]。生物信息學(xué)軟件分析結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)錄起始位點上游-306、-617和1343處存在C/EBPα的結(jié)合位點。C/EBP基因序列在人和雞之間具有高度保守，氨基酸保守性很高[11-12]。在不同物種間C/EBPs家族都具有重要生物學(xué)作用的功能基因[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)C/ EBPα對L-BABP基因啟動子區(qū)各片段均有負調(diào)控作用，且隨著片段的逐漸縮短，C/EBPα對L-BABP基因抑制作用逐漸減弱。因此，推斷這段區(qū)域內(nèi)可能存在3個或3個以上C/EBPα結(jié)合位點。L-BABP基因特異存在于禽類的肝臟組織中，目前沒有在哺乳動物的肝臟組織中發(fā)現(xiàn)該基因[15]。人肝臟細胞中沒有發(fā)現(xiàn)該基因，但人肝臟組織中的環(huán)境與禽類的肝臟所提供環(huán)境相似，因此L-BABP基因啟動子報告基因系列缺失載體在人肝癌細胞系（HEP? EG2）中有表達。

4 結(jié)論

研究克隆并構(gòu)建雞L-BABP基因啟動子系列缺失載體，通過對其啟動子活性進行分析和表達調(diào)控研究，發(fā)現(xiàn)雞L-BABP基因受多種轉(zhuǎn)錄因子和上游序列的調(diào)控，C/EBPα基因?qū)ζ淦鸬截撜{(diào)控作用。

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Activity analysis of chicken liver bile acid binding protein gene promoter

WANG Qigui1,2,3,4,GAO Guangliang1,2,3,4,MA Guangwei1,2,3,ZHANG Xinyang1,2,3,LI Hui1,2,3
(1.Key Laboratory of Chicken Genetics and Breeding,Ministry of Agriculture,Harbin 150030,China;2.Key Laboratory of Animal Genetics,Breeding and Reproduction,Education Department of Heilongjiang Province,Harbin 150030,China;3.School of Animal Science and Technology,Northeast Agricultural Univerity,Harbin 150030,China;4.ChongqingAcademy ofAnimal Science,Chongqing 402460,China)

The objective of this study was to analyze the promoter structure and activity of the chicken liver bile acid binding protein(L-BABP)gene.Bioinformatics analysis revealed that the chicken L-BABP gene promoter fragment included HNF-1,SREBP-1,AP-1,C/EBP,Oct-1,TATA,CCAAT,GATA-1 and other regulatory elements binding sites and the gene promoter region cannot find CpG islands.The 5′flanking 2 kb of chicken L-BABP gene was amplified by PCR,cloned and sequenced.A series of recombination plasmids of L-BABP gene were constructed and transiently transfected into Human hepatoma cell line 2(HEPG2).Then their luciferase activity was measured by dual luciferase reporter gene assay system.The activity of the promoter region analysis by Luciferase reporter assays demonstrated that promoter region(-1 096/-66) was strongest promoter activity and the promoter region(-545/-62)was worse,and C/EBPα could repress the chicken L-BABP gene expression.This study will provide the foundation for in-depth study of the chicken L-BABP gene expression regulation mechanism.

chicken;L-BABP;promoter;activity analysis

S767.5；X172

A

1005-9369（2014）04-0088-06

2013-07-21

國家自然科學(xué)基金（30972087）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項目（CARS-42）；黑龍江省高等學(xué)?？萍紕?chuàng)新團隊建設(shè)項目（2010td02）

王啟貴（1974-），男，教授，博士，研究方向為分子遺傳學(xué)。E-mail:wangqigui@hotmail.com

時間2014-4-21 13:25:33[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140421.1325.034.html

王啟貴,高廣亮,馬廣偉,等.雞肝臟膽汁酸結(jié)合蛋白基因啟動子活性分析[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2014,45(4)∶88-93.

Wang Qigui,Gao Guangliang,Ma Guangwei,et al.Activity analysis of chicken liver bile acid binding protein gene promoter [J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(4)∶88-93.(in Chinese with English abstract)