史艷芬，胡高峰，羅 杰，鐘定榮，續(xù) 薇

（1.中日友好醫(yī)院 病理科，北京 100029；2.北京醫(yī)院 國(guó)家老年醫(yī)學(xué)中心 國(guó)家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院老年醫(yī)學(xué)研究院，北京 100730；3.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 檢驗(yàn)科，長(zhǎng)春 130021）

微小RNAs（miRNAs）是一種被廣泛研究的穩(wěn)定性較好的非編碼RNA，研究認(rèn)為，miRNAs 可作為腫瘤標(biāo)志物應(yīng)用于不同疾病的診斷和預(yù)后[1，2]，也可參與腫瘤的治療如直接抑制腫瘤或調(diào)控化療耐藥[3]，而miRNAs 調(diào)控靶基因表達(dá)是miRNA 發(fā)揮生物學(xué)作用的重要方式，雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)方法是現(xiàn)今最常用的研究miRNA 和靶基因直接作用關(guān)系的實(shí)驗(yàn)，雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)在熒光素酶質(zhì)粒選擇、抑制物/類(lèi)似物（inhibitor/mimc）選擇等細(xì)節(jié)方面各有不同[4，5]，尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道這些差異是否會(huì)影響其結(jié)果判斷。為探索適合的雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)方法，本研究從胃癌細(xì)胞BGC823 基因組中提取了T-細(xì)胞淋巴瘤侵襲轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)基因（T-lymphom invasion and metastasis gene，TIAM1）的3’非編碼區(qū)（3’-UTR）片段全長(zhǎng)，將TIAM1-3’UTR 構(gòu)建在2種不同的熒光素酶基因質(zhì)粒上，通過(guò)在線數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)及在前期研究的基礎(chǔ)上，選取8 種可能作用于TIAM1-3’UTR 的miRNAs，分別轉(zhuǎn)染其抑制物和類(lèi)似物進(jìn)行雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)研究。

1 材料與方法

1.1 材料

細(xì)胞系： 人胃癌細(xì)胞系BGC823 獲贈(zèng)于吉林大學(xué)第一醫(yī)院檢驗(yàn)科單洪麗博士。質(zhì)粒：熒光素酶質(zhì) 粒psi-CHECK2、pGL-CMV-promoter、Renilla均獲贈(zèng)于吉林大學(xué)第一醫(yī)院轉(zhuǎn)化研究院艾滋病與病毒研究中心杜娟課題組。

1.2 試劑和儀器

DMEM、RPMI1640 和胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Hyclone 公司，Opti-MEM、胎牛血清（FBS）購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司，限制性?xún)?nèi)切酶（XbaⅠ、XhoⅠ、NotⅠ、EcoRⅠ） 和T4 DNA 連接酶購(gòu)自美國(guó)New England BioLabs 公司，基因組DNA 提取試劑盒、感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞和LipofectamineTM3000 購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司，KD 聚合酶、質(zhì)粒小提試劑盒和雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)試劑盒購(gòu)自中國(guó)北京Transgene 公司，miRNAs 的類(lèi)似物和抑制物購(gòu)自中國(guó)廣州Ribobio 公司。發(fā)光檢測(cè)儀為Promega 公司的Glo-MaxTM 20/20 Luminometer。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

采用含有10%FBS 的RPMI1640，在37℃含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。選取miRNAs通過(guò)在線數(shù)據(jù)庫(kù)（Targetscan、miRDB、miRWalk、miRNet、MicroT-CDS、miRSystem 和miRNAMap）預(yù)測(cè)及課題組前期研究基礎(chǔ)[6]，選擇影響TIAM1 mRNA 表達(dá)且可能作用于TIAM1-3’UTR 的8 種miRNAs（見(jiàn)表1）。

1.3.2 質(zhì)粒構(gòu)建

使用基因組DNA 提取試劑盒，從BGC823 細(xì)胞系中提取基因組DNA。使用KD 聚合酶，采用普通PCR 的方法，將TIAM1-3’UTR 片段全長(zhǎng)（1950bp）從基因組DNA 中擴(kuò)增出來(lái)，根據(jù)使用引物不同（見(jiàn)表2），獲得2 種TIAM1-3’UTR 片段，一種兩端含有XhoⅠ和NotⅠ酶切位點(diǎn)，另一種兩端含有XbaⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，分別酶切后備用。將psi-CHECK2 質(zhì)粒進(jìn)行XhoⅠ和NotⅠ雙酶切，使用T4 DNA 連接酶，將備用的TIAM1-3’UTR 片段通過(guò)酶切位點(diǎn)插入到Renilla 熒光素酶基因下游，構(gòu)建的質(zhì)粒命名為psi-TIAM1-3’UTR。對(duì)于pGL-CMV-promoter 質(zhì)粒，首先使用設(shè)計(jì)的突變引物和KD 聚合酶進(jìn)行連續(xù)3 個(gè)堿基的突變，使Firefly 熒光素酶基因下游出現(xiàn)EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，再進(jìn)行XbaⅠ和EcoRⅠ雙酶切，使用T4 DNA 連接酶，將備用的TIAM1-3’UTR 片段通過(guò)酶切位點(diǎn)插入到Firefly 熒光素酶基因下游，構(gòu)建的質(zhì)粒命名為pGL3-TIAM1-3’UTR。將構(gòu)建的2種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞，擴(kuò)增培養(yǎng)后，挑取單克隆菌落，使用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒并送測(cè)序。測(cè)序確認(rèn)TIAM1-3’UTR 序列均正確插入，2 種質(zhì)粒構(gòu)建成功，其結(jié)構(gòu)示意圖見(jiàn)圖1。

表1 應(yīng)用2 種雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)胃癌相關(guān)miRNAs 靶向TIAM1 的結(jié)果（改變倍數(shù)，x±s）

表2 從基因組上擴(kuò)增出TIAM1-3’UTR 所用引物

1.3.3 轉(zhuǎn)染

將等量待轉(zhuǎn)染細(xì)胞鋪在24 孔板中，次日細(xì)胞貼壁后且密度達(dá)80%左右進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將質(zhì)粒、miR-類(lèi)似物/抑制物和P3000TM 加入到Opti-MEM 后靜置5min，將Lipofectamine 3000 加入另一管Opti-MEM 后靜置5min，將稀釋后的2 種液體混勻后再靜置20min，吸凈待轉(zhuǎn)染細(xì)胞的舊培養(yǎng)基并加入上述轉(zhuǎn)染液，置入培養(yǎng)箱中2h 后更換普通培養(yǎng)液，48h 后收集細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖1 pGL3-TIAM1-3’UTR 和psi-TIAM1-3’UTR質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖

圖2 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)時(shí)pGL3-TIAM1-3’UTR 和psi-TIAM1-3’UTR 質(zhì)?？沙霈F(xiàn)不同的結(jié)果

1.3.4 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)

轉(zhuǎn)染后48h 收獲細(xì)胞，PBS 潤(rùn)洗2 次后加入裂解液，室溫裂解10min，4℃條件下12000g 離心10min，吸取20滋l 上清置于1.5ml EP 管中，該EP管中已提前加入配好的100滋l 熒光素酶底物試劑，混勻后立即在發(fā)光檢測(cè)儀中檢測(cè)熒光值，該數(shù)值即反應(yīng)熒光素酶的活性。再加入100滋l 另一種熒光素酶底物試劑，檢測(cè)另一種熒光素酶活性。Firefly 熒光素酶的反應(yīng)后熒光在波長(zhǎng)560nm 處檢測(cè)，Renilla 熒光素酶的反應(yīng)后熒光在波長(zhǎng)470nm 處檢測(cè)。由于miRNA 經(jīng)典作用方式為結(jié)合靶基因3’UTR 位點(diǎn)，影響靶基因的翻譯過(guò)程，本研究中將TIAM1-3’UTR 插入到熒光素酶基因下游，因此試劑盒檢測(cè)出的相對(duì)熒光素酶活性改變將間接反映miRNA 對(duì)TIAM1-3’UTR 的作用。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)來(lái)源于至少3 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用SPSS20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用x±s描述，組間比較采用t 檢驗(yàn)。采用Graphpad 軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 用不同的質(zhì)粒進(jìn)行雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)

BGC-823 細(xì)胞系中分別轉(zhuǎn)染pGL3-TIAM1-3’UTR 和psi-TIAM1-3’UTR 質(zhì)粒，觀察miR-抑制物處理后熒光素酶活性變化。miR-10b-抑制物處理后，2 種質(zhì)粒的熒光素酶活性均升高，說(shuō)明miR-10b-5p 對(duì)2 種質(zhì)粒上熒光素酶基因的調(diào)控可能相同；miR-651-抑制物處理后2 種質(zhì)粒的熒光素酶活性變化完全相反，miR-653-抑制物處理后也是如此，表明miR-651-3p 和miR-653-5p 對(duì)2 種質(zhì)粒上的熒光素酶基因的調(diào)控有差異 （見(jiàn)圖2）。

圖3 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)時(shí)miR-抑制物和miR-類(lèi)似物可出現(xiàn)相同結(jié)果

2.2 抑制物和類(lèi)似物同時(shí)進(jìn)行雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)

本研究在BGC823 細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染psi-TIAM1-3’UTR 質(zhì)粒后，分別用miR-抑制物和miR-類(lèi)似物處理，觀察熒光素酶活性變化。miR-10b-5p 的抑制物和類(lèi)似物處理組熒光素酶活性分別增高和減弱，表明miR-10b-5p 通過(guò)直接作用于TIAM1-3’UTR 序列影響基因表達(dá)；而miR-372-3p、miR-373-3p 和miR-653-5p 的抑制物和類(lèi)似物處理組熒光素酶活性均升高，miR-335-3p的抑制物和類(lèi)似物處理組熒光素酶活性均減低（見(jiàn)圖3）。

3 討論

3.1 同種miRNA 在2 種熒光素酶質(zhì)粒的結(jié)果

本文以胃癌相關(guān)miRNAs 靶向TIAM1-3’UTR 為例，研究了雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)適合的實(shí)驗(yàn)條件，結(jié)果顯示，同種miR-抑制物分別作用在pGL3-TIAM1-3UTR 和psi-TIAM1-3’UTR 2 種質(zhì)粒上，可能會(huì)產(chǎn)生不同的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果（表1 和圖2）。由于pGL3-TIAM1-3’UTR 質(zhì)粒常共轉(zhuǎn)Renilla 質(zhì)粒做內(nèi)參[7]，與psi-TIAM1-3UTR 質(zhì)粒的內(nèi)參基因不同。有研究報(bào)道睪丸受體4（TR4，或稱(chēng)NR2C2）的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致Renilla 的表達(dá)降低，說(shuō)明海腎熒光素酶基因的表達(dá)會(huì)受到其他物質(zhì)調(diào)控[8]，而miRNA 在復(fù)雜的生物體內(nèi)可能會(huì)有多個(gè)靶基因和調(diào)控通路，所以推測(cè)某些miRNA 可能會(huì)間接影響Renilla 的表達(dá)，出現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)中的結(jié)果。而且因?yàn)槭褂胮GL3-TIAM1-3UTR 這種質(zhì)粒時(shí)，其內(nèi)參基因在共轉(zhuǎn)的另一個(gè)質(zhì)粒上，只是理論上認(rèn)為2 種質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率一致，增加了更多的不確定性。因此目前也有研究報(bào)道認(rèn)為這種將2 種熒光素酶合成在同一質(zhì)粒上的方法更為合適[9]。

3.2 同種熒光素酶質(zhì)粒使用抑制物/類(lèi)似物

對(duì)于同種熒光素酶質(zhì)粒，使用抑制物和類(lèi)似物的雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能不同。本研究中miR-372-3p、miR-373-3p 和miR-653-5p 在轉(zhuǎn)染抑制物時(shí)相對(duì)熒光素酶活性增加，表明此3 種miRNAs 能夠靶向作用于TIAM1-3’UTR，但是在轉(zhuǎn)染類(lèi)似物時(shí)的結(jié)果并不支持這一結(jié)論； 類(lèi)似的miR-335-3p 只在轉(zhuǎn)染類(lèi)似物時(shí)能得出靶向作用于TIAM1-3’UTR 的結(jié)論，轉(zhuǎn)染抑制物時(shí)則不支持。上述4 種miRNAs 中，有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-653-5p 在乳腺癌中能夠靶向TIAM1[10]，其余miRNAs和TIAM1 的關(guān)系均尚無(wú)報(bào)道，在本實(shí)驗(yàn)的條件下，我們的數(shù)據(jù)不支持其直接靶向作用與TIAM1-3’UTR。因此綜合抑制物和類(lèi)似物兩方面的結(jié)果來(lái)判斷，至少對(duì)于雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)是很有必要的。

綜上，miR-10b-5p 能夠直接靶向作用于TIAM1-3’UTR，研究中納入的其余miRNAs 均不支持與TIAM1-3’UTR 有直接靶向作用關(guān)系。本研究有助于優(yōu)化miRNA 與靶基因關(guān)系、miRNA與腫瘤關(guān)系的研究。