周志軍 尚娜 常巖林 石福明

（1. 河北大學生命科學學院，保定 071002；2. 河北大學圖書館，保定 071002）

DNA 條形碼技術是基于線粒體DNA 細胞色素C 氧化酶亞基I 基因（Mitochondrial COI）5'端一段約650 bp 的標準基因片段在DNA 水平上進行物種區(qū)分［1］，已被廣泛用于魚類、鳥類、哺乳類、鱗翅目、鞘翅目、雙翅目、甲殼類及洞穴蜘蛛等的物種鑒定［2-11］。在利用DNA 條形碼進行物種鑒定過程中，關于劃分物種的序列分歧的“閾值”問題一直存在較大的爭議。Hebert 等［1］曾提出基于DNA 條形碼序列分歧劃分物種的“閾值”，無脊椎動物為3%，鳥類和哺乳類為2%。Yang 等［11］研究發(fā)現(xiàn)，北京百花山地區(qū)夜蛾科的種間平均遺傳距離（11.29%）遠大于種內(nèi)（0.03%），采用1%作為種間序列差異閾值的鑒定準確率可達95%。Meyer 等［12］對維多利亞湖9 屬14 種麗魚科魚研究發(fā)現(xiàn)，盡管這些物種間具有明顯的形態(tài)學和生態(tài)學變異，但其序列分歧＜1%。Hebert 等［6］基于對北美260 種鳥的研究再次提出相對種間分歧界定，即種間差異≥種內(nèi)變異10 倍。但是，該物種界限缺乏生物學支持，在一些地理分布廣泛或親緣關系很近的物種間經(jīng)常存在種間差異和種內(nèi)變異重疊現(xiàn)象［13-15］。

線粒體假基因（Nuclear sequences of mitochondrial origin，numts）廣泛存在于不同生物類群的基因組中［16-21］，在使用線粒體COI 作為DNA 條形碼進行物種鑒定時，核內(nèi)與其同源的numts 極易被共擴增，導致物種鑒定錯誤和物種多樣性高估。通常認為，由于核基因組中的numts 失去了其原有功能，進化方式不同于mtDNA 序列，無凈化選擇（purify selection），各種突變?nèi)菀追e累（終止密碼子、插入/缺失及移碼突變等），因此，多數(shù)numts 可以通過序列比對或在翻譯成氨基酸后被識別出來并加以剔除［5］，只有近期轉移入核的numts 才難以被識別［22，23］。Moulton 等［24］研究發(fā)現(xiàn)，在直翅目昆蟲中存在一些核內(nèi)numts，由于不存在插入/缺失、提前出現(xiàn)終止密碼子及移碼突變等現(xiàn)象，而難以與線粒體COI 區(qū)分，并建議使用氨基酸序列進行核查并加以剔除，剔除標準為堿基替代導致≥2 個氨基酸非同義替換。

紡織娘亞科Mecopodinae 我國僅記錄1 屬2種，即紡織娘屬Mecopoda Audinet-Sermille，1831的紡織娘M. elongata L.，1758 和日本紡織娘M. niponensis De Haan，1842［25］，其作為鳴蟲在我國具有悠久的人工飼養(yǎng)歷史。兩種紡織娘種間區(qū)別并不困難，但由于分布廣泛，種內(nèi)存在一定的形態(tài)變異。此前，國內(nèi)外尚無關于這兩種紡織娘之間關系的研究。GenBank 數(shù)據(jù)庫中僅有我們提交的紡織娘（JQ917910）和日本紡織娘（JQ917909）線粒體基因組全序列［26］。為探討DNA 條形碼技術在其物種鑒定中的可行性，本研究對我國分布的這兩種紡織娘標準DNA 條形碼片段進行了測定，并對在日本紡織娘中發(fā)現(xiàn)的線粒體COI 極高的numts 和異質(zhì)性（或無法使用常規(guī)方法甄別的numts）現(xiàn)象進行了分析，試圖從DNA 條形碼數(shù)據(jù)的后期質(zhì)量控制著手，對numts 進行甄別，以保證基于DNA 條形碼進行物種鑒定的準確性。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用兩種紡織娘標本信息如表1。野外采集到的標本，立即置于無水酒精中浸泡保存，次日更換酒精，帶回實驗室后于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA 提取、PCR 擴增及測序 使用TIANamp Genomic DNA Kit（天根，北京），按照操作說明，取酒精浸泡標本的后足股節(jié)肌肉組織進行DNA 提取。根據(jù)GenBank 數(shù)據(jù)庫中收錄的直翅目線粒體基因組數(shù)據(jù)修改后的引物LCO1490（5'-TCAACAAATCATAAGGACATTGG-3'）和HCO2198（5'-TAAACTTCAGGGTGTCCAAAGAATCA-3'）被用于擴增DNA 條形碼標準區(qū)段［27］。PCR 擴增反應體系為：總DNA 模 板 3 μL，DNA 聚 合 酶 2.5 U（TaKaRa），dNTPs 0.2 mmol/L，引物各1 mmol/L，超純水補足50 μL。擴增條件為：94℃預變性4 min；94℃變性30 s，50℃退火30 s，70℃延伸90 s，共35 個循環(huán)；70℃延伸7 min。PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳切膠純化后，送上海鉑尚生物技術有限公司進行雙向測序。最初PCR 擴增采用寶生物rTaq DNA 聚合酶進行，PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳切膠回收、純化后，全部日本紡織娘個體直接測序結果峰圖雜亂，表明可能存在多種擴增產(chǎn)物。因此，改用寶生物高保真LA Taq DNA 聚合酶重新進行PCR 擴增，使用PMD?-19T 載體（寶生物，大連）進行克隆，并隨機挑取5-17 個單克隆測序。

表1 樣本信息

1.2.2 序列分析 測序結果導入Lasergene 6 軟件包中的SeqMan 軟件［28］，進行序列拼接與手工校正，確定分析序列。為避免核基因組中numts 序列的干擾，拼接好的序列，首先使用Lasergene 6 中的EditSeq 軟件［28］篩查存在終止密碼子的numts，然后使用序列比對軟件ClustalX［29］篩查存在堿基插入/缺失和移碼突變的numts，最后使用MEGA 5.0［30］分析剩余序列對應的氨基酸序列變異位點，參考Moulton 等［24］標準，將堿基突變引起≥2 個氨基酸非同義替換作為numts 篩選標準，對近期由線粒體轉入核內(nèi)的numts 進行篩選。利用MEGA 5.0［30］計算兩種紡織娘種間、種內(nèi)個體間及日本紡織娘同一個體內(nèi)部不同克隆之間的Kimura 2-parameter（K2P）遺傳距離，并基于鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育關系樹。

2 結果

2.1 線粒體COI序列分析與numts確定

使用DNA 條形碼通用引物LCO1490/HCO2198進行PCR 擴增，兩種紡織娘均可獲得單條清晰、整齊的靶標條帶。6 個紡織娘個體的PCR 法直接測序結果良好，序列拼接比對發(fā)現(xiàn)靶標片段長度均為658 bp，無堿基插入/缺失、移碼突變及翻譯提前終止等現(xiàn)象，用無脊椎動物線粒體基因組密碼子表推斷產(chǎn)生的氨基酸序列完全一致。8 個日本紡織娘個體的PCR 法直接測序結果峰圖雜亂，而克隆法測定的85 個克隆拼接后的序列長度介于580-662 bp。以此前基于L-PCR 技術結合嵌套PCR 二次擴增獲得的線粒體基因組全序列中的COI 序列作為參照序列（JQ917909）［26］，發(fā)現(xiàn)其中20 條克隆序列存在終止密碼子或堿基插入/缺失，為明顯的numts（4 條由于異常終止密碼子出現(xiàn)致使翻譯終止，15 條存在堿基插入/缺失，1 條存在讀碼框擺動）；在剩余的65條長度均為658 bp，無終止密碼子的克隆序列中發(fā)現(xiàn)38 條序列含≥2 個氨基酸非同義替換位點的疑似numts，氨基酸序列變異情況見圖1。

2.2 遺傳距離分析

K2P 模型分析顯示，兩種紡織娘之間的K2P 距離為0.077，紡織娘及日本紡織娘不同個體間的K2P距離分別為0-0.008 及0.007-0.044，個體內(nèi)不同克隆之間的K2P 距離分別為0-0.143（含numts）及0-0.076（不含numts）（表2）。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹構建

利用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）選擇K2P遺傳距離模型，同時采用1 000 次Bootstrap 重復抽樣檢驗各分支置信度，構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。由圖2 可見，全部紡織娘個體以極高的置信度（99%）聚為一個單系分支G，而日本紡織娘的聚類結果比較復雜，5 條numts 序列在系統(tǒng)樹基部形成兩個分支H 和I，3 條numts 序列與代表紡織娘的分支G 形成姊妹分支F，分支B（僅1 條序列）和E 均為numts序列，分支D 由單條COI 序列形成，分支C 及A 則分別主要由numts 序列及COI 序列形成。

圖1 日本紡織娘線粒體COI 基因氨基酸序列變異位點

3 討論

許多學者將DNA 條形碼區(qū)分物種失敗的原因歸咎于近期分化的物種間存在的不完全譜系分選現(xiàn)象。本研究通過對兩種紡織娘14 個個體的線粒體COI序列進行拼接和校正后發(fā)現(xiàn)，日本紡織娘的線粒體COI 存在極高的numts 和異質(zhì)性（或無法使用常規(guī)方法甄別的numts），這些序列聚類形成多個不同分支。造成此現(xiàn)象的原因可能有兩種：（1）檢測到的日本紡織娘線粒體COI 變異來自PCR 擴增錯誤。為了減少PCR 擴增錯誤所帶來的影響，本研究采用了高保真的TaKaRa LA Taq 酶，如此高頻率的突變不能簡單歸因于PCR 擴增錯誤。（2）日本紡織娘線粒體COI 本身即存在極高的numts 和異質(zhì)性。類似現(xiàn)象在直翅目其他類群中已有報道。例如，Bensasson等［17］發(fā)現(xiàn)在紅股禿蝗Podisma pedestris 中存在多條不同的線粒體COI-like 序列；Moulton 等［24］研究發(fā)現(xiàn)在Anabrus simplex 等直翅目昆蟲中存在一些線粒體COI 序列，它們沒有翻譯提前終止、堿基插入/缺失或移碼突變等，但其推導的氨基酸序列存在較多的非同義突變，認為其實際為numts 序列而非異質(zhì)性。我們認為，雖然不能排除少量由于PCR 擴增錯誤所引起的變異，但絕大多數(shù)的日本紡織娘線粒體COI 變異是其自身即具有的numts 和異質(zhì)性。遺憾的是，目前尚無方法具體區(qū)分PCR 擴增錯誤和真實的線粒體DNA 分子變異。

圖2 基于Kimura 2-parameter 模型構建的兩種紡織娘線粒體COI 和numts NJ 樹

表2 基于Kimura 2-parameter 模型的日本紡織娘個體內(nèi)不同克隆間和個體間遺傳距離

參考Moulton 等［24］標準，以采用L-PCR 法獲得的線粒體COI 序列為參照（JQ917909）［26］，我們將≥2 個氨基酸非同義替換作為numts 的剔除標準，取得了一定效果，但聚類結果仍并不是十分理想，主要表現(xiàn)在：（1）在疑似numts 的分支C 中包含兩條僅含一個非同義替換位點的序列；（2）由單條COI 序列形成的分支D 在NJ 樹上的位置顯示，其與主要由線粒體COI 序列組成的分支A 的距離較疑似numt 的分支C 遠；（3）在主要由線粒體COI 序列組成的分支A 中包含數(shù)條存在≥氨基酸非同義替換的疑似numts 序列。究其原因，可能是由于日本紡織娘的進化過程中存在多次線粒體DNA 向核內(nèi)轉移的事件，導致大量沒有翻譯提前終止、插入/缺失和移碼突變的numts 出現(xiàn)，即這些numts 由線粒體DNA 新近轉移至核內(nèi)。

Numts 共擴增現(xiàn)象對于使用DNA 條形碼技術進行物種鑒定的干擾必須予以重視。為此，一些研究人員先后提出了多種高效甄別numts 的方法，如設計物種特異性引物進行擴增、L-PCR 擴增mtDNA 大片段作為模板進行二次擴增及反轉錄PCR等［24，31-34］。但是，DNA 條形碼之所以備受推崇，并得以廣泛使用，其優(yōu)勢就在于其無需預知所研究材料的遺傳背景，且操作方法簡單，易于標準化，而上述幾種方法都不同程度地違背了這些DNA 條形碼技術成立的基本條件。我們認為，在使用DNA 條形碼技術進行物種鑒定的過程中，只能從數(shù)據(jù)的后期質(zhì)量控制著手，對numts 進行甄別，例如，Chung和Steiper［35］使用HKY85 模型構建NJ 樹，根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育聚類結果對numts 進行甄別。在系統(tǒng)發(fā)育樹上，numts 可能形成獨立分支，但是，由于相似的進化速率及近期的mtDNA 核整合事件，numts 和真實的mtDNA 序列間分歧很小，用核苷酸序列可能很難區(qū)分。Numts 序列曾被認為是古線粒體DNA 向細胞核基因組轉移的“分子化石”［36］，而實際上，這種遺傳物質(zhì)的水平轉移自真核生物出現(xiàn)以來就一直在持續(xù)進行。

4 結論

利用DNA 條形碼通用引物對我國分布的兩種紡織娘14 個個體進行了擴增與測定。6 個紡織娘個體均可用PCR 產(chǎn)物直接測序法獲得良好測序結果，而8 個日本紡織娘個體測序結果峰圖雜亂。改用克隆法測定的85 條克隆序列長度介于580-662 bp，其中，20 條為明顯的numts（4 條存在終止密碼子，15 條存在堿基插入/缺失，1 條存在讀碼框擺動），38 條為疑似numts（與參考序列相比含≥2 個非同義替換位點）。鄰接法聚類結果顯示，紡織娘聚類形成一個單系分支（自舉值為99），而日本紡織娘的線粒體COI 和numts 序列則聚類形成多個分支，表明這些numts 序列可能是線粒體COI 多次向核內(nèi)轉移的結果。

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