姚慶收 姜吉剛 武玉永 梁乘榜

白藜蘆醇是一種天然的抗氧化劑，具有重要的藥用價值［1，2］。近年來，Ri質(zhì)粒及其發(fā)根培養(yǎng)系統(tǒng)因其在次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)方面的優(yōu)越性而被廣泛重視［3，4］，并成為藥用植物可持續(xù)發(fā)展的有效途徑之一。花生中含有較高的白藜蘆醇，花生（包括根、莖、果仁）將會成為生產(chǎn)白藜蘆醇及與其相關(guān)醫(yī)藥、保健品的重要植物資源［5］，因此利用花生毛狀根進行白藜蘆醇的生產(chǎn)具有現(xiàn)實意義。

本試驗利用發(fā)根農(nóng)桿菌R1601介導，對花生葉片進行誘導，獲得毛狀根后，經(jīng)PCR鑒定，選取轉(zhuǎn)染成功的生長快的毛狀根株系，利用不同培養(yǎng)基培養(yǎng)，對經(jīng)培養(yǎng)后毛狀根的生物量和毛狀根中白藜蘆醇含量進行測定，探究不同培養(yǎng)基對毛狀根的生物量和白藜蘆醇含量的影響，旨在為進一步篩選并建立適宜的花生毛狀根培養(yǎng)體系，用于生產(chǎn)白藜蘆醇奠定研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 發(fā)根農(nóng)桿菌R1601，魯花11號，毛狀根株系。

1.1.2 主要試劑 主要試劑均為國產(chǎn)分析純，分子生物學試劑購自上海生工生物工程有限公司，白藜蘆醇標準品購自上海融禾醫(yī)藥科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 MS、B5和N6培養(yǎng)基的組分參照李志勇等［6］，配制的培養(yǎng)基pH為5.8。1/2MS培養(yǎng)基是在MS培養(yǎng)基的基礎上，大量元素、微量元素、鐵鹽、有機成分、蔗糖用量均減半，其他同MS培養(yǎng)基。配制加入抗生素的MS培養(yǎng)基，在原有MS培養(yǎng)基的基礎上，在培養(yǎng)基滅菌冷卻但未凝固時加入500mg/L的羧芐西林鈉，其他條件同MS培養(yǎng)基。其中1/2MS培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基，其它為固體培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 花生毛狀根的誘導及鑒定 主要試驗過程參照文獻［7］，取花生魯花11號葉片，流水沖洗30min，用4％的NaClO浸泡5-10min后，無菌水沖洗3-4次，每次5min，將葉片切成0.5cm左右，并輕輕劃上傷口，置于發(fā)根農(nóng)桿菌R1601培養(yǎng)液（A600=0.8）中5-10min，取出外植體，置于MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)2-3d，轉(zhuǎn)移到含500mg/L羧芐西林鈉的MS培養(yǎng)基上2-3d（根據(jù)發(fā)根農(nóng)桿菌生長情況，可以多次進行該步驟，直至發(fā)根農(nóng)桿菌被去除），置于無激素MS培養(yǎng)基上，誘導毛狀根。另做一份為對照，除不與發(fā)根農(nóng)桿菌接觸外，其余操作均相同。誘導出毛狀根后，剪取毛狀根，移到含500mg/L羧芐青霉素的MS培養(yǎng)基上除菌培養(yǎng)，每3-5d轉(zhuǎn)接1次，直至去除發(fā)根農(nóng)桿菌R1601后，繼代培養(yǎng)用于后續(xù)試驗。利用CTAB法提取花生毛狀根和葉片DNA，根據(jù)Ri質(zhì)粒序列，設計PCR擴增引物進行PCR鑒定。

1.2.2 毛狀根的繼代培養(yǎng) 選取一株經(jīng)PCR鑒定的優(yōu)良的花生毛狀根繼代培養(yǎng)，擴繁，并作為培養(yǎng)株系用于生物量和白藜蘆醇含量的測定。每瓶加入80mL MS培養(yǎng)基（培養(yǎng)瓶為ZP16-340廣口瓶，上海稼豐園藝用品有限公司生產(chǎn)）。具體培養(yǎng)條件為MS培養(yǎng)基、B5培養(yǎng)基、N6培養(yǎng)基和MS+500mg/mL培養(yǎng)基為固體，培養(yǎng)條件為26℃，光照條件為2000 lx，12h/d光照，培養(yǎng)，1/2MS培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為26℃，160r/min，暗黑條件。

1.2.3 毛狀根生物量測定 將培養(yǎng)4周的毛狀根進行生物量（生物量=收獲量-接種量）的測定，將毛狀根團塊中所含的培養(yǎng)基去掉，用水洗凈晾干，稱鮮重，對不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的毛狀根株系的生物量進行統(tǒng)計分析。

1.2.4 毛狀根中白藜蘆醇含量的測定

1.2.4.1 白藜蘆醇的提取 對不同培養(yǎng)基上收獲的毛狀根，于60℃烘干，將同一培養(yǎng)基收獲的毛狀根混合，隨機分為3組，按照文獻［8］中超聲波提取法對不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的毛狀根進行白藜蘆醇的提取，作為測試樣品備用。

1.2.4.2 對照品溶液和測試樣品溶液的制備 精密稱取白藜蘆醇對照品5mg，于25mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得到0.20mg/mL的對照品溶液，備用。

1.2.4.3 樣品中白藜蘆醇含量的測定 色譜條件和標準曲線的繪制按照文獻［8］進行，繪制得到回歸方程。然后測定待測溶液的峰面積并將此值帶入回歸方程求得待測溶液中白藜蘆醇的含量。

1.2.5 不同培養(yǎng)基毛狀根中白藜蘆醇總量 設定同一培養(yǎng)基毛狀根中白藜蘆醇總量=毛狀根生物量（干重總量）×毛狀根中白藜蘆醇含量，計算不同培養(yǎng)基中毛狀根中白藜蘆醇的總量（以每種培養(yǎng)基接種相同瓶數(shù)為基礎）。

2 結(jié)果

2.1 花生葉片毛狀根的誘導及PCR鑒定

用發(fā)根農(nóng)桿菌R1601侵染花生的葉片，1周左右感染發(fā)根農(nóng)桿菌的花生葉片在傷口部位出現(xiàn)白色突起，2周左右分化為白色細根（圖1），生長速度快，生根密度大。

圖1 花生葉片誘導的毛狀根

通過設計rolB基因的特異引物，進行PCR擴增，如圖2中1、2、5、6泳道所示，能夠以葉片誘導的毛狀根的DNA為模板擴增到預期的條帶（865bp），說明所獲得的毛狀根為發(fā)根農(nóng)桿菌誘導的遺傳轉(zhuǎn)化體，可以用于繼代培養(yǎng)。

圖2 毛狀根PCR檢測電泳圖

2.2 花生毛狀根繼代培養(yǎng)

固體培養(yǎng)基中，在相同時間內(nèi)，MS培養(yǎng)基中的花生毛狀根克隆系生長快，生長勢強，根呈乳白色，不發(fā)生褐化現(xiàn)象，較少出現(xiàn)表皮褐化（圖3），大約經(jīng)過4周左右即可長滿培養(yǎng)基。加入500mg/mL的MS固體培養(yǎng)基中的花生毛狀根生長慢，在3周后根尖開始出現(xiàn)老化，表皮褐化，4周左右不能長滿培養(yǎng)基，抗生素有效抑制雜菌，很少發(fā)生污染，但對毛狀根的生長有抑制作用，形態(tài)上與MS培養(yǎng)基中的毛狀根也略有區(qū)別，主干根段變粗，顏色略黃（圖4）。B5和N6培養(yǎng)基中的花生毛狀根生長勢弱，生長慢，外部形態(tài)縮短變粗現(xiàn)象比加抗生素的MS培養(yǎng)基明顯，隨著生長表皮褐化，4周左右也不能長滿培養(yǎng)基（圖5）。

1/2MS培養(yǎng)基是液體培養(yǎng)基，生長速度快，外部形態(tài)生長正常，無縮短變粗現(xiàn)象，但表皮褐化較快，只有根尖保持乳白色，4周時已經(jīng)能夠長滿培養(yǎng)液（圖 6）。

由于固體和液體培養(yǎng)基中，生長最快的經(jīng)過4周左右即可長滿培養(yǎng)基，故選取4周的毛狀根進行生物量和白藜蘆醇的測定。

圖3 MS固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的毛狀根

圖4 MS+500mg/mL羧芐西林鈉固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的毛狀根

圖5 N6固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的毛狀根

圖6 1/2MS液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的毛狀根

2.3 不同培養(yǎng)基中毛狀根生物量測定

選取4周的毛狀根進行生物量測定，不同培養(yǎng)基之間的生物量如表1所示。

表1 不同培養(yǎng)基毛狀根生物量測定及分析

對不同培養(yǎng)基之間的生物量進行統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示，不同培養(yǎng)基之間生物量的變化明顯不同，4周內(nèi)，1/2MS培養(yǎng)基和MS培養(yǎng)基花生毛狀根的生物量積累明顯要快；MS+羧芐西林鈉（500mg/L）、B5和N6的培養(yǎng)基上花生毛狀根生物量的積累慢，產(chǎn)量遠低于1/2MS培養(yǎng)基和MS培養(yǎng)基上的毛狀根，1/2MS培養(yǎng)基和MS培養(yǎng)基之間無差異，但與其他3種培養(yǎng)基差異極顯著，但MS+羧芐西林鈉（500mg/L）、B5和N6的培養(yǎng)基之間有差異顯著但無極顯著性差異。說明不同培養(yǎng)基對毛狀根生物量的積累有明顯差異，其中1/2MS培養(yǎng)基和MS培養(yǎng)基有利于毛狀根生物量的積累。

2.4 不同培養(yǎng)基毛狀根中白藜蘆醇含量的測定

根據(jù)不同濃度梯度的白藜蘆醇標準品得到HPLC的線性回歸方程：y=7.8×107x+6390，R2=0.9931。由HPLC測定得知白藜蘆醇在tR=5.070附近出峰。根據(jù)回歸方程得出供試樣品濃度，計算各樣品白藜蘆醇含量及SAS8.1軟件統(tǒng)計分析如表2所示。

表2 不同培養(yǎng)基毛狀根白藜蘆醇含量測定分析

由表2可見，在不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的毛狀根中，B5培養(yǎng)基中培養(yǎng)的毛狀根中白藜蘆醇的含量最高；1/2MS 培養(yǎng)基中的毛狀根中白藜蘆醇的含量最低。MS+羧芐西林鈉（500mg/L）與MS培養(yǎng)基中毛狀根的白藜蘆醇含量差異顯著，但無極顯著差異；B5和N6培養(yǎng)基中毛狀根的白藜蘆醇含量無顯著差異。說明B5和N6培養(yǎng)基適合于以獲得白藜蘆醇為目的的毛狀根培養(yǎng)。

2.5 不同培養(yǎng)基毛狀根中白藜蘆醇的總量

根據(jù)毛狀根中白藜蘆醇總量=毛狀根生物量（干重總量）×毛狀根中白藜蘆醇含量，計算出同一培養(yǎng)基中毛狀根中白藜蘆醇的總量，結(jié)果（表3）顯示，根據(jù)生物量或者白藜蘆醇含量這兩個因素中的任何一個因素的量高或量低，并不能就能確定最終收獲的白藜蘆醇的量多或量少，判定某種培養(yǎng)基是最適合的培養(yǎng)基，或者調(diào)整某種培養(yǎng)基，需要結(jié)合生物量和白藜蘆醇的含量共同判斷。

表3 不同培養(yǎng)基毛狀根白藜蘆醇總量

3 討論

由于毛狀根起源于單細胞，這些細胞在結(jié)構(gòu)、大小、遺傳和生理生化等特征上各不相同，其代謝狀態(tài)和合成次生物質(zhì)的能力也不同［9］。本試驗選取了PCR技術(shù)鑒定為轉(zhuǎn)染成功并生長旺盛的毛狀根單克隆系作為繼代培養(yǎng)的材料，以期為后續(xù)試驗提供一個統(tǒng)一的基礎條件，盡量減少試驗影響因素。

各種培養(yǎng)基由于所含組分及其比例不同，對毛狀根生長和次生產(chǎn)物的形成有不同的影響［10-16］。本試驗中選取的5種培養(yǎng)基的成分不盡相同，MS培養(yǎng)基是富集元素平衡培養(yǎng)基［17］，成分較多，營養(yǎng)元素豐富；1/2MS培養(yǎng)基是在MS培養(yǎng)基基礎上不添加瓊脂粉外對各成分減半獲得，B5和N6培養(yǎng)基是高硝酸鉀含量培養(yǎng)基［17］。試驗顯示1/2MS和MS培養(yǎng)基有利于生物量的積累，這可能與其營養(yǎng)元素全面相關(guān)，毛狀根的生長是細胞不斷分裂和生長的結(jié)果，涉及的生化代謝過程特別復雜，培養(yǎng)基成分全面就有助于這些生化過程的進行，有助于生物量的積累。而添加了抗生素后由于抗生素的作用，生物量降低，說明羧芐西林鈉對毛狀根的生長有抑制作用。而B5和N6培養(yǎng)基由于屬于高硝酸鉀含量培養(yǎng)基，營養(yǎng)物質(zhì)種類較MS培養(yǎng)基少，顯示出相同時間內(nèi)生物量的積累要低，說明不同培養(yǎng)基對毛狀根的生物量積累是有很大影響的，進行培養(yǎng)基的選擇，是培養(yǎng)毛狀根獲得高生物量的前提。

培養(yǎng)基中銨態(tài)氮和硝態(tài)氮之間的比例也會影響毛狀根生長和次生代謝產(chǎn)物的合成［11，18］。本試驗中，B5和N6培養(yǎng)基最有利于白藜蘆醇量的積累，顯著優(yōu)于MS和1/2MS培養(yǎng)基。而這可能是由于B5和N6是屬于高硝酸鉀含量培養(yǎng)基，硝態(tài)氮比例高，在白藜蘆醇的合成過程中有助于其中的生化代謝途徑，從而提高了毛狀根中的白藜蘆醇含量。

本試驗表明根據(jù)單一的生物量或者白藜蘆醇含量，并不能判定某種培養(yǎng)基是最適合的培養(yǎng)基，需要結(jié)合生物量和白藜蘆醇的含量共同判斷，因此生物量和白藜蘆醇含量這兩個因素為選擇或者改進培養(yǎng)基提供了重要的依據(jù)，也為今后的試驗研究提供了思路，今后應向?qū)で竺珷罡L速度與白藜蘆醇含量達到最佳結(jié)合的培養(yǎng)基種類探索，使之達到生產(chǎn)上的最大效益。

4 結(jié)論

探究了不同培養(yǎng)基對花生毛狀根株系生物量積累和白藜蘆醇含量的影響，表明1/2MS培養(yǎng)基和MS培養(yǎng)基有利于花生毛狀根株系生物量的積累，B5培養(yǎng)基和N6培養(yǎng)基有利于花生毛狀根株系中白藜蘆醇的積累。

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