早勝牛類群A-FABP基因SNPs及其與胴體品質(zhì)和肉質(zhì)性狀的相關(guān)性分析

唐紅杰 趙生國 雷趙民 王欣榮 王建福 蔡原 吳建平

脂肪型脂肪酸結(jié)合蛋白（A-FABP）屬于脂肪酸結(jié)合蛋白家族，是脂結(jié)合蛋白超家族的成員。A-FABP（Adipocyte fatty acid binding-protein）基因，也稱為Ap2、ALBP或FABP4，主要在脂肪細胞中表達，在甘油三酯形成及脂解過程中參與調(diào)控脂生成或溶解的生化過程［1］。牛A-FABP基因定位于牛14號染色體［2］，DNA 全長 4391bp，mRNA 全長 625bp，編碼132個氨基酸。關(guān)于雞［3］、豬［4］等畜禽的研究表明，A-FABP基因能夠增加肌內(nèi)脂肪含量，且只在脂肪組織中表達。多態(tài)性的研究表明，雞［5，6］、鴨［7］、豬［8］、牛［9-11］A-FABP 基因多態(tài)性與肌內(nèi)脂肪沉積相關(guān)，可作為牛肉大理石花紋和肌間脂肪（IMF）含量等肉質(zhì)性狀的侯選基因［1，12］。A-FABP基因的突變對“日本和?！晾拘僚！盕2雜種牛的大理石花紋、皮下脂肪厚度［10］、牛背部脂肪厚度［13］及朝鮮牛大理石花紋［14］都存在相應(yīng)的影響。鑒于A-FABP基因在脂質(zhì)代謝過程中的重要作用，本研究以5個甘肅早勝牛類群為研究對象，利用PCR-SSCP技術(shù)，對A-FABP基因外顯子3進行多態(tài)性檢測，并分析多態(tài)位點與肉質(zhì)性狀的相關(guān)性，旨在找出與生產(chǎn)性狀相關(guān)的遺傳標記，為選育優(yōu)良肉牛提供遺傳學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗樣品來源及基因組DNA提取 采集的牛耳組織樣（表1），置于盛有75％酒精的5mL EP管中，-20℃保存。采集的牛頸靜脈血樣6-8mL，加入1mL ACD抗凝劑，-20℃保存。用酚/氯仿法提取耳組織和血液基因組DNA［15］，TE溶解，并用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度法檢驗DNA的純度和濃度，然后稀釋成100 ng/μL備用。

表1 樣品信息

1.1.2 肉用性狀指標 隨機選取平?jīng)鲱惾?7頭和西雜牛32頭進行胴體性狀（宰前活重，胴體重，屠宰率，凈肉率，胴體背膘厚，眼肌面積）和肉質(zhì)性狀（失水率，大理石花紋等級，肉色，剪切力，pH和蒸煮損失）測定，所檢測牛為相同管理條件下無親緣關(guān)系的22月齡健康公（閹）牛，肉用性狀的測定方法參照《養(yǎng)牛學(xué)》［16］。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與PCR反應(yīng)體系 根據(jù)EMBL（ENSBTAT00000000079）公布牛A-FABP基因全序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計A-FABP基因外顯子3引物，預(yù)期擴增片段長度219bp，引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列 F：5'-ATTATCCCCACAGAGCATCG-3'，R：5'-TTTTCATTCTACAAGGGCGATT-3'，PCR反 應(yīng) 體 系為 25μL ：其 中 Premix Taq 12.5μL（1.25U），DNA模版 1μL（100ng/μL），上下游引物各 0.5μL（10 pmol/μL），ddH2O 10.5μL。反應(yīng)條件 ：94℃預(yù)變性 3min；94℃變性30s，59℃退火30s，72℃延伸30s，35個循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存。

1.2.2 PCR產(chǎn)物檢測、變性及SSCP檢測 PCR產(chǎn)物采用1％瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。取2μL PCR擴增產(chǎn)物，加入8μL變性上樣緩沖液（98％去離子甲酰胺、10mmol/L EDTA（pH8.0）、0.025％二甲苯氰FF、0.025％溴酚藍），98℃變性10min，冰浴10min，采用 14％ 丙烯酰胺凝膠（（Acr∶Scr=29∶1）進行檢測，180V電泳10h結(jié)束后銀染。

1.2.3 序列測定及分析 根據(jù)SSCP分析結(jié)果，挑選不同基因型的PCR擴增產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司進行純化并測序。用MEGA5軟件將測序結(jié)果與GenBank（NM-174314.2）序列進行比對。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 運用PopGen32軟件計算基因型頻率、等位基因頻率、純合度（Ho）、雜合度（He）、有效等位基因數(shù)（Ne）、并進行群體內(nèi)基因型分布的Hardy-Weinberg平衡檢驗，采用PIC軟件計算多態(tài)信息含量（PIC）；用卡方獨立性檢驗分析基因型在種群間的分布，并配合下列模型進行最小二乘方差分析，比較各性狀在不同基因型之間的差異，用SPSS19.0的一般線性模型（General linear model，GLM）過程完成。統(tǒng)計模型為：Yij=μ+GENi+GROj+（GEN×GRO）ij+eij其中，Yij為個體某性狀表型值；μ為群體均值；GENi為基因型效應(yīng)；GROj為類群效應(yīng)；（GEN×GRO）ij為基因型與類群的互作效應(yīng)；為eij為隨機誤差。

2 結(jié)果

2.1 A-FABP基因PCR產(chǎn)物擴增結(jié)果

牛A-FABP基因PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖1），片段條帶清晰，無雜帶，特異性較好，可用于SSCP檢測。

圖1 A-FABP基因PCR擴增產(chǎn)物檢測

2.2 SSCP電泳結(jié)果及測序分析

SSCP結(jié)果（圖2）發(fā)現(xiàn)3種帶型，推測為3種基因型，3種基因型的測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫公布的原始序列（NM-174314.2）進行比對，結(jié)果在A-FABP基因第3外顯子G408＞C處發(fā)現(xiàn)一個突變位點，即G→C堿基突變（圖3）。

圖2 A-FABP基因SSCP檢測結(jié)果

2.3 A-FABP基因遺傳多態(tài)性分析

根據(jù)SSCP檢測結(jié)果進行分析發(fā)現(xiàn)（表2），除西雜牛GC基因型頻率高于GG基因型頻率外，其他4個類群GC基因型頻率均低于GG基因型頻率，高于CC基因型頻率。在5個早勝牛類群中，G等位基因頻率均高于C等位基因型頻率為優(yōu)勢等位基因。χ2適合性檢驗表明，慶陽類群和秦雜牛c.408G＞C位點χ2值達到顯著水平，表明其基因型分布處于Hardy-Weinberg非平衡狀態(tài)（P＜0.05），而其他3個類群的基因型分布處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P＜0.05）。

χ2獨立性檢驗結(jié)果（表3）表明，西雜牛與平?jīng)鲱惾夯蛐头植疾町愶@著（P＜0.05），與慶陽類群、秦雜牛、南雜牛差異極顯著（P＜0.01）；其他類群間基因型分布差異不顯著（P＞0.05）。

A-FABP基因c.408G＞C位點在5個類群中的純合度（Ho）、雜合度（He）、有效等位基因數(shù)（Ne）和多態(tài)信息含量（PIC）見表4。慶陽類群和平?jīng)鲱惾篜IC＜0.25，處于低度多態(tài)。其他3個類群均處于中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.5）。

2.4 基因型與胴體、肉質(zhì)性狀的相關(guān)性分析

圖3A-FABP基因不同基因型序列分析

對屠宰牛的6個胴體性狀（包括宰前活重、胴體重、屠宰率、凈肉率、胴體背膘厚、眼肌面積）按A-FABP基因外顯子3基因型分型后進行方差分析，結(jié)果（表5）表明，GG基因型胴體重顯著低于CC基因型（P＜0.05）；GG基因型屠宰率極顯著低于GC基因型（P＜0.01），顯著低于CC基因型（P＜0.05）；GG基因型凈肉率顯著低于GC基因型（P＜0.05）；GG基因型眼肌面積顯著低于GC和CC基因型（P＜0.05），GC和CC基因型之間差異不顯著（P＞0.05）。其他性狀在3個基因型間的差異不顯著（P＞0.05）。

表2 A-FABP基因基因型頻率和基因頻率

表3 5個牛類群A-FABP基因外顯子3基因型分布的獨立性檢驗

表4 5個牛類群A-FABP基因外顯子3遺傳多態(tài)性分析

對屠宰牛的6個肉質(zhì)性狀（包括失水率、大理石花紋、肉色、剪切力、蒸煮損失、pH）按A-FABP基因外顯子3基因型分型后進行方差分析，結(jié)果（表6）表明，GG基因型失水率顯著高于CC基因型（P＜0.05）；GG基因型剪切力極顯著高于GC和CC基因型（P＜0.01），GC和CC基因型之間差異不顯著；GG基因型蒸煮損失和pH均顯著高于GC基因型（P＜0.05），極顯著高于CC基因型（P＜0.01）。大理石花紋和肉色在3個基因型間的差異不顯著（P＞0.05）。

3 討論

3.1 A-FABP基因外顯子3多態(tài)性及群體遺傳分析

牛A-FABP基因多態(tài)性研究發(fā)現(xiàn)秦川牛A-FABP基因第1內(nèi)含子和第4外顯子上存在突變，而第3外顯子相對保守［9］，也有研究認為秦川牛、南陽牛、魯西牛、夏南牛和郟縣紅牛A-FABP基因5'側(cè)翼區(qū)、第2和3外顯子及3'側(cè)翼區(qū)都有變異［17］，在朝鮮牛的2、3、4外顯子也存在突變位點［18］。本研究對5個早勝牛類群A-FABP基因第3外顯子（c.408G＞C）多態(tài)性檢測發(fā)現(xiàn)，除平?jīng)鲱惾翰缓珻C型外，其他類群3種基因型（GG、GC和CC）都存在，即在AFABP基因編碼區(qū)檢測到G/C，與朝鮮牛A-FABP基因第3外顯子上檢測到的突變相同［18］。該研究結(jié)果在平?jīng)鲱惾簺]有檢測到CC基因型，這種基因型分布的差異可能是由于平?jīng)鲱惾翰煌谄渌?個類群的遺傳特性，CC基因型非優(yōu)勢基因型，在長期的自然選擇或人工選擇中被淘汰。

經(jīng)卡方檢驗，西雜牛與平?jīng)鲱惾夯蛐头植疾町愶@著（P＜0.05），與慶陽類群、秦雜牛、南雜牛差異極顯著（P＜0.01），這進一步證實了不同群體間遺傳特性的差異，由于群體間遺傳背景本身存在較大的差異，在選育過程中不同等位基因的間接選擇壓力不同，遺傳變異程度不同。多態(tài)信息含量（PIC）、有效等位基因數(shù)（Ne）和雜合度（He）都是衡量群體內(nèi)遺傳變異大小的指標，這些數(shù)值在大小上均有一致性，多態(tài)信息含量大，有效等位基因數(shù)和雜合度就相對較大［19］。這3個參數(shù)較大時說明群體在該位點的變異性高，有較大的選擇潛力，可以嘗試利用該位點進行標記輔助選擇。遺傳多態(tài)性分析結(jié)果表明，平?jīng)鲱惾汉蛻c陽類群的PIC分別為0.21、0.24，屬于低度多態(tài)（PIC＜0.25）。南雜牛、秦雜牛和西雜牛 PIC分別為 0.37、0.28、0.30、0.37，均處于0.25-0.5之間，屬于中度多態(tài)，說明A-FABP基因編碼區(qū)G408C位點可以進行標記輔助選擇。χ2適合性檢驗表明，慶陽類群和秦雜牛處于Hardy-Weinberg非平衡狀態(tài)，說明該類群自然選擇或者人工選擇對該基因分布的影響較大，造成其分布的不平衡，這可能與育種的個體選擇有關(guān)。其他3個類群均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)狀態(tài)，說明這3個類群的牛已經(jīng)形成了適應(yīng)各自生存環(huán)境的遺傳特性，該突變位點在所在群體內(nèi)能夠穩(wěn)定遺傳。

表5 A-FABP基因c.408G＞C位點多態(tài)性與胴體性狀的關(guān)聯(lián)分析

表6 A-FABP基因c.408G＞C位點多態(tài)性與肉質(zhì)性狀的關(guān)系

3.2 基因多態(tài)性與肉質(zhì)性狀的關(guān)系

A-FABP基因被認為是影響動物肌內(nèi)脂肪含量的重要候選基因［10］。沉積在肌肉內(nèi)的脂肪，即肌內(nèi)脂肪（Intramuscular fat，IMF）含量與肉的嫩度和風味有直接關(guān)系［20］。鑒于A-FABP基因?qū)θ赓|(zhì)性狀的重要作用，目前國內(nèi)外展開了該基因在各種牛群體上的研究。王卓［9］對秦川牛A-FABP基因第1內(nèi)含子和第4外顯子上發(fā)現(xiàn)的多態(tài)位點進行了分型及其與肉質(zhì)性狀關(guān)聯(lián)性分析，發(fā)現(xiàn)第1內(nèi)含子的突變位點與背膘厚、嫩度、大理石花紋等指標存在相關(guān)，第4外顯子的GG基因型個體的背膘厚、大理石花紋、嫩度都顯著高于CC基因型。劉艷妍［17］認為5'側(cè)翼區(qū)的突變對肉牛的產(chǎn)肉性狀影響較大，外顯子2的SNPs與屠宰率、嫩度、胴體長和眼肌面積等相關(guān)，外顯子3的SNPs與眼肌面積相關(guān)，3'側(cè)翼區(qū)SNPs與牛胴體深相關(guān)。Cho等［13］發(fā)現(xiàn)A-FABP基因外顯子2的SNPs與牛背部脂肪厚度相關(guān)。Lee等［14］發(fā)現(xiàn)，朝鮮牛A-FABP基因外顯子3的一個同義突變位點對牛肉大理石花紋有顯著影響。Barendse等［21］發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ABP4基因的第3外顯子和第3內(nèi)含子之間存在一個剪接位點突變，該SNP與澳大利亞牛肌間脂肪沉積顯著相關(guān)。

在本研究中，A-FABP基因第3外顯子G408C位點與 Lee等［14］和 Barendse等［21］研究的突變位點一致，但該同義突變位點對大理石花紋的影響未達到顯著水平，這與報道的結(jié)果并不一致，可從其他位點研究A-FABP基因SNPs與大理石花紋等級的相關(guān)性。本研究的位點突變?yōu)橥x突變，沒有引起相應(yīng)氨基酸序列的變化，但由于堿基序列發(fā)生了變化，從而影響mRNA本身的翻譯速度，改變蛋白質(zhì)的表達質(zhì)量，甚至會導(dǎo)致蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，進而影響其功能的發(fā)揮［22］。本研究A-FABP基因SNPs在5個不同早勝牛類群的分布上存在一定差異，并與胴體重、凈肉重、屠宰率、凈肉率、眼肌面積、剪切力、失水率、蒸煮損失和pH等指標有關(guān)。本研究A-FABP基因第3外顯子區(qū)域SNPs與胴體重、屠宰率、凈肉率、眼肌面積、剪切力、失水率、蒸煮損失和pH等指標的關(guān)聯(lián)性分析在已查閱的文獻中也未見報道，結(jié)果可為后續(xù)試驗提供相應(yīng)的數(shù)據(jù)參考。對A-FABP基因的遺傳突變位點與試驗牛群體胴體品質(zhì)和肉質(zhì)性狀等主要經(jīng)濟性狀進行關(guān)聯(lián)分析，所得試驗結(jié)果表明A-FABP基因位點SNPs可作為選育和加強胴體和肉質(zhì)性狀遺傳效應(yīng)的分子標記。

4 結(jié)論

在A-FABP基因外顯子3檢測到一個突變位點，不同基因型間牛的胴體和肉質(zhì)性狀存在較大差異，可作為對牛胴體品質(zhì)和肉質(zhì)性狀選育的遺傳標記。

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