張繼太 祝 雪 張盛周

（安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物環(huán)境與生態(tài)安全省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蕪湖241000）

肝糖原是人和動(dòng)物體內(nèi)的貯備多糖，有“動(dòng)物淀粉”之稱，肝糖原在酶促作用下合成和分解以維持血糖濃度穩(wěn)定。檢測(cè)肝糖原含量變化在醫(yī)學(xué)病理學(xué)上可用于糖原累積病﹑糖尿病和某些腫瘤的診斷［1］，在養(yǎng)殖生產(chǎn)實(shí)踐中可用于了解動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)狀況以指導(dǎo)合理飼喂。高碘酸希夫氏 （periodic acid－Schiff′s，PAS）染色法是檢測(cè)糖原的經(jīng)典組織化學(xué)方法，該法先用高碘酸將糖類相鄰兩個(gè)碳上的羥基氧化成醛基，再用Schiff＇s試劑（無(wú)色品紅）和醛基反應(yīng)產(chǎn)生紅色或紫紅色物質(zhì)，紅色的深淺反映組織細(xì)胞中糖原的含量。目前對(duì)肝糖原PAS染色過(guò)程中樣品固定、染色試劑的配制與儲(chǔ)存、染色時(shí)間等方面研究報(bào)道較多［2－4］，切片方法均為石蠟切片，冰凍切片制作過(guò)程時(shí)間短、效率高，但尚未見有關(guān)用冰凍切片檢測(cè)肝糖原的研究報(bào)道。

牛蛙屬經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖型蛙類，具有重要的生態(tài)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，也是重要的科研和教學(xué)用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。本試驗(yàn)分別制作了牛蛙肝組織石蠟和冰凍切片，采用PAS染色法檢測(cè)肝糖原，通過(guò)光密度分析測(cè)定糖原含量，比較了兩種切片的染色效果，供相關(guān)教學(xué)與科研技術(shù)人員參考。

材料和方法

1．材料

成體牛蛙3只，重250－300g，購(gòu)自蕪湖市黃山菜市場(chǎng)，穿刺脊髓處死，迅速解剖，取出肝臟，用吸水紙輕輕拭干，勿用水或生理鹽水清洗。

2．實(shí)驗(yàn)方法

2．1石蠟切片

將肝臟切成約1cm×1cm×0．5cm的小塊，用Carnoy固定液于低溫4℃固定約4h，分別用95%乙醇和無(wú)水乙醇脫水2h、二甲苯透明、浸蠟、包埋，常規(guī)切片厚5μm，水中展片。

2．2冰凍切片

將肝臟切成約0．5cm×0．5cm×0．5cm的小塊，放在組織支撐器上，滴加冷凍包埋劑后放入冰凍切片機(jī)中低溫固化后切片，切片厚5μm。

2．3PAS染色

對(duì)照組取石蠟切片常規(guī)脫蠟至50%乙醇后稍水洗，與冰凍切片同時(shí)滴加唾液淀粉酶溶液于37℃溫箱中消化處理30min，消化過(guò)程中實(shí)驗(yàn)組石蠟切片脫蠟至50%乙醇后稍水洗，將實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組的石蠟、冰凍切片入0．5%高碘酸氧化7min，流水沖洗5min再用蒸餾水浸洗兩次；冰箱取出無(wú)色品紅待至室溫后避光染色15－20min；用0．5%的偏重亞硫酸鈉漂洗兩次，每次約1min，流水沖洗5min，蒸餾水洗后 Harris蘇木精染色2min；自來(lái)水洗，0．1%的鹽酸乙醇分化1min，水洗充分后溫水返藍(lán)，流水沖洗，42℃溫箱烘干24h，中性樹膠封固。

2．4光密度測(cè)定與數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

在Olympus BX61型顯微鏡下觀察拍照，采用Image－Pro Plus圖像分析軟件對(duì)染色陽(yáng)性部位進(jìn)行光密度分析，測(cè)出切片中PAS陽(yáng)性部位的累積光密度（integrated optical density，IOD）和面積，算出平均光密度（mean optical density，MOD）。采用單因素方差分析（one－way ANOVA）進(jìn)行差異顯著性比較，P＜0．05為差異顯著。

結(jié) 果

PAS染色后糖原顆粒呈紅色或紫紅色，石蠟切片染色后肝臟組織結(jié)構(gòu)較為清晰，但肝細(xì)胞內(nèi)有較多空泡，糖原流失較多，且偏向了細(xì)胞的一側(cè)（圖1），冰凍切片肝細(xì)胞形態(tài)保持完好，糖原顆粒明顯比石蠟切片中大，且糖原保持較好的原位狀態(tài)（圖2）。光密度分析顯示冰凍切片糖原含量顯著高于石蠟切片（P＜0．05）（表1），與冰凍切片相比，石蠟切片中糖原流失了28%左右。

圖1 石蠟切片檢測(cè)牛蛙肝糖原，糖原呈紅色，PAS染色，標(biāo)尺：50μm圖2 冰凍切片檢測(cè)牛蛙肝糖原，糖原呈紅色，PAS染色，標(biāo)尺：50μmFig．1The liver glycogen of bullfrog detected with paraffin section，the glycogen appears red，PAS staining，scale bar：50μmFig．2The liver glycogen of bullfrog detected with frozen section，the glycogen appears red，PAS staining，Scale bar：50μm

表1 石蠟和冰凍切片檢測(cè)牛蛙肝糖原含量Table 1 The content of glycogen in the liver of bullfrog detected with paraffin and frozen section

討 論

1．取材與固定

制作石蠟切片時(shí)，不同的固定方法對(duì)肝糖原的顯示影響較大，采用Carnoy固定液固定可較好地保存糖原，此外，低溫4℃下固定也可防止糖原丟失［2］；冰凍切片無(wú)需對(duì)材料進(jìn)行固定處理，直接取材冷凍包埋后切片即可。

2．切片與展片

王玨等認(rèn)為肝臟的石蠟切片厚度一般在3μm為宜，組織太厚或太薄均不利于觀察［3］。制作3μm冰凍切片材料極易破碎，本實(shí)驗(yàn)冰凍切片厚度為5 μm，染色后效果亦較為理想。有報(bào)道認(rèn)為在70%酒精中展片可防止糖原流失染色效果較好，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在70%酒精中和清水中展片染色效果無(wú)明顯差異，可能是由于材料經(jīng)石蠟包埋，短時(shí)間水中展片不會(huì)導(dǎo)致糖原的流失。

3．試劑配制

實(shí)驗(yàn)采用無(wú)色品紅染色，本試劑因配制需活性炭吸附過(guò)濾，配制耗時(shí)較長(zhǎng)，可適量多配制一些后在4℃冰箱避光保存。另外，本實(shí)驗(yàn)在配制無(wú)色品紅時(shí)發(fā)現(xiàn)若未經(jīng)活性炭吸附時(shí)溶液已基本無(wú)色，則該試劑與經(jīng)活性炭吸附后的試劑染色效果相同。有研究認(rèn)為，對(duì)于失效無(wú)色品紅溶液，在約每100ml試劑中加入0．5g偏重亞硫酸鈉，可恢復(fù)其染色能力［4］，其他試劑均可現(xiàn)配現(xiàn)用。

4．對(duì)照實(shí)驗(yàn)

可用0．1%淀粉酶與37℃保溫箱中反應(yīng)1h左右，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)將唾液稀釋6－9倍于雙層紗布過(guò)濾兩次后在37℃保溫箱中反應(yīng)30min左右，效果亦較為理想。不過(guò)，反應(yīng)時(shí)間應(yīng)把握較為準(zhǔn)確，時(shí)間太短糖原未分解徹底，時(shí)間太長(zhǎng)又易致其它組織結(jié)構(gòu)分解，且染色沖洗時(shí)易掉片。實(shí)驗(yàn)組兩種切片經(jīng)高碘酸氧化后均不易掉片，但對(duì)照組由于經(jīng)過(guò)酶消化易掉片，沖洗時(shí)應(yīng)小心，對(duì)照組染色后PAS陰性，證明實(shí)驗(yàn)組PAS陽(yáng)性物質(zhì)為糖原。

5．染色結(jié)果

石蠟切片染色后肝臟組織結(jié)構(gòu)雖然較為清晰，但肝細(xì)胞內(nèi)有較多空泡，可能是由于制片脫水過(guò)程中糖原溶解流失形成的。糖原偏向了細(xì)胞的一側(cè)，有報(bào)道認(rèn)為這是由于固定劑把細(xì)胞內(nèi)的糖原推向固定劑對(duì)組織浸透的方向而造成［2］；冰凍切片為切片后直接染色，因此可很好地保留糖原及其在細(xì)胞中的位置。

總之，石蠟和冰凍兩種切片方式均可用于糖原染色，由于糖原易溶于水，兩種切片材料未經(jīng)高碘酸氧化前均不宜與水接觸，但制作石蠟切片時(shí)脫水脫蠟過(guò)程中不可避免要與水接觸，必然會(huì)造成不同程度的糖原流失，而冰凍切片可直接切片染色，無(wú)需與水接觸，不會(huì)造成糖原流失；石蠟切片制作實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)較多，耗時(shí)較長(zhǎng)，通常要48－72h，而冰凍切片制作實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)較少、耗時(shí)短，只需5－6h。但冰凍切片需要冰凍切片機(jī)，價(jià)格較昂貴，沒(méi)有石蠟切片機(jī)那么普及。本研究結(jié)果顯示，在條件許可的情況下，臨床病理診斷和生產(chǎn)實(shí)踐中檢測(cè)糖原含量變化時(shí)，應(yīng)選用制作方便、耗時(shí)短且糖原不易流失的冰凍切片。

［1］付銀鋒．PAS染色方法及應(yīng)用．河南科技大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2008，26（2）：100－101

［2］尹洪萍，袁紅．不同固定方法對(duì)肝糖原顯示的影響．杭州師范學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2005，4（6）：479－480

［3］王玨，王莉，張?。煌M織中PAS染色的特點(diǎn)．鄖陽(yáng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，（5）：505

［4］方慶全，葉美華，黃紅浪．提高病理高碘酸雪夫氏法染色效果的體會(huì)．臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2009，8（12）：125－126