張 瑩，郭琛琛，黑東燕，張 偉，魯 偉，金明飛,*

（1.華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200241；2.泰興市東圣食品科技有限公司，江蘇 泰興 225411）

復(fù)合誘變法選育谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶高產(chǎn)菌株

張 瑩1，郭琛琛1，黑東燕1，張 偉1，魯 偉2，金明飛1,*

（1.華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200241；2.泰興市東圣食品科技有限公司，江蘇 泰興 225411）

為篩選谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶高產(chǎn)菌株，利用紫外-硫酸二乙酯復(fù)合誘變、一次篩選的方法誘變生產(chǎn)菌株茂源鏈霉菌（Streptoymyces mobaraensis），結(jié)合高通量篩選技術(shù)篩選高產(chǎn)菌株。結(jié)果表明：復(fù)合誘變的方式較單獨(dú)誘變的方式效率高。經(jīng)過誘變的高產(chǎn)菌株由于酶的成熟加快或者蛋白表達(dá)量增加而提高了酶活力，最高可達(dá)7.02 U/mL，比野生菌株提高了54%。進(jìn)一步研究高產(chǎn)菌株發(fā)現(xiàn)，高產(chǎn)菌株谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的成熟加快，可提前24 h結(jié)束發(fā)酵；發(fā)酵液中酶原含量高，會降低發(fā)酵液中酶活性。

谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶；茂源鏈霉菌；硫酸二乙酯；紫外；復(fù)合誘變

微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶（EC. 2.3.2.13，microbial transglutaminase，MTG）作為一種蛋白的“超級黏合劑”[1]，在食品行業(yè)中有著廣泛的應(yīng)用[2-3]，2012年國內(nèi)的銷售總額近1億元，已經(jīng)成為最大的單一食品用酶制劑。盡管如此，生產(chǎn)菌株茂源鏈霉菌（Streptomyces mobaraensis）的MTG產(chǎn)量較低，產(chǎn)酶水平只有日本味之素公司的1/3～1/5左右，跟國際水平相比具有較大的提升空間[4-5]。作為食品用酶，對MTG的生產(chǎn)有著嚴(yán)格的規(guī)定，必須符合相關(guān)法律和GB2760—2011《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》等要求，要提高其產(chǎn)量目前最好的方法是傳統(tǒng)的誘變育種技術(shù)[6]。紫外（ultraviolet，UV）誘變雖然誘變譜比較廣泛，但較難獲得某些氨基酸的突變，而且突變效率較低[7-8]；而硫酸二乙酯（diethyl sulfate，DES）的誘變譜可與紫外誘變形成互補(bǔ)[9]。目前UV-DES復(fù)合誘變主要有兩種方法：直接用UV、DES對菌懸液誘變后再涂布篩選[10]，對茂源鏈霉菌來說其缺點(diǎn)是致死率過高，難以得到理想的高產(chǎn)菌株；用UV（或DES）誘變后篩選高產(chǎn)菌株，再用DES（或UV）對高產(chǎn)菌株進(jìn)行誘變、篩選[11]，這個(gè)方法一般耗時(shí)較長。本實(shí)驗(yàn)探討了鏈霉菌孢子經(jīng)UV（或DES）誘變后直接擴(kuò)增培養(yǎng)，然后收集擴(kuò)增后的孢子再進(jìn)行DES（或UV）誘變、篩選，以提高誘變效率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

茂源鏈霉菌（Streptomyces mobaraensis，ATCC27441），本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

高氏一號培養(yǎng)基（g/L）：NaCl 0.5、MgSO4?7H2O 0.5，KNO31、K2HPO4?3H2O 0.5、FeSO4?7H2O 0.01、可溶性淀粉20、瓊脂20，pH 7.2～7.4。

種子培養(yǎng)基（g/L）：MgSO4?7H2O 2 、K2HPO4?3H2O 2、酵母膏5、甘油20、魚粉蛋白胨25，pH 7.4。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：MgSO4?7H2O 2、K2HPO4?3H2O 2、酵母膏6、甘油20、魚粉蛋白胨25，pH 7.4。

1.1.3 試劑

還原型谷胱甘肽 中國醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司；N-芐氧羰基-L-谷氨酰甘氨酸（Na-CBZ-Gln-Gly） 上海多肽公司合成；其他試劑均為分析純試劑 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 技術(shù)路線

茂源鏈霉菌孢子培養(yǎng)→收集孢子→第1輪UV（或DES）誘變→擴(kuò)增培養(yǎng)、收集孢子→第2輪DES（或UV）誘變→涂布、獲取單菌落→高通量篩選→搖瓶復(fù)篩→突變菌株表達(dá)比較

1.2.2 誘變

以前期篩選到的穩(wěn)定高產(chǎn)突變株作為出發(fā)菌株，在多次傳代純化的基礎(chǔ)上選擇其中1株開展本實(shí)驗(yàn)[12-13]。根據(jù)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)優(yōu)化的條件進(jìn)行紫外誘變[12-13]；DES誘變條件參考文獻(xiàn)[14]進(jìn)行，具體條件為：將孢子濃度為108個(gè)/mL的菌液700 μL用PBS稀釋10 倍，實(shí)驗(yàn)組加入0.5% DES，用鋁泊紙包裹避光，置于37 ℃搖床中反應(yīng)55 min，取出立即2 500 r/min離心10 min，離心后棄上清，用無菌水重懸，稀釋涂板。

第1輪用UV誘變，不經(jīng)篩選擴(kuò)增，所有突變菌株第2輪用DES誘變的實(shí)驗(yàn)組記為UV/DES組；同樣地，第1輪用DES誘變，第2輪用UV誘變的實(shí)驗(yàn)組記為DES/UV組。兩輪均未誘變的記為CK組，而第1輪用UV或DES誘變，第2輪未經(jīng)處理的記為UV組或DES組。

1.2.3 篩選

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室優(yōu)化的篩選方法進(jìn)行[12-13]。即根據(jù)菌落形態(tài)，用96孔板高通量篩選的方法進(jìn)行初步篩選，然后對候選的菌株利用搖瓶培養(yǎng)進(jìn)行復(fù)篩。

正負(fù)突變率的計(jì)算：菌株發(fā)酵酶活力高于野生菌株酶活力的110%記為正突變，低于野生菌株發(fā)酵酶活力的90%記為負(fù)突變；其余則為等義突變?？偼蛔兟蕿檎?fù)突變率之和。

（正/負(fù)）突變率/%=（正/負(fù)）突變菌株數(shù)/總菌株數(shù)×100

1.2.4 酶活力測定

按照比色法測定發(fā)酵液中MTG酶活力[6]。

1.2.5 蛋白表達(dá)量檢測

[15]的方法用SDS-PAGE檢測發(fā)酵液中MTG的表達(dá)情況，上樣量為總蛋白含量120μg。蛋白含量測定用美國Bio-Rad公司的ChemiDoc? XRS成像儀自帶掃描軟件分析，通過灰度掃描和蛋白總量計(jì)算每個(gè)條帶的蛋白含量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

圖像處理和數(shù)據(jù)分析用GraphPad Prism5軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合誘變的篩選

圖1 復(fù)合誘變的突變率Fig.1 Mutation rates induced by the combined mutagenesis

如圖1所示，復(fù)合誘變與單純的UV誘變或DES誘變相比，正突變率沒有顯著差異，但不論是DES/UV或者UV/DES的組合方式，負(fù)突變率及總的突變率均較單純的誘變方式有顯著提高。

圖2 復(fù)合誘變初篩菌株的酶活力Fig.2 Enzymatic activities of screened mutants

如圖2篩選結(jié)果所示，復(fù)合誘變的平均酶活力比對應(yīng)的單一誘變或者野生菌株均有所下降，UV/DES組合誘變組與單純用UV誘變或DES誘變組平均酶活力顯著降低，這些結(jié)果與突變率一致（圖1）。由于突變一般都是負(fù)突變較多，因此這也說明復(fù)合誘變的突變頻率高于單一誘變，效果可能優(yōu)于單一誘變。此外復(fù)合誘變組中有某些特別高產(chǎn)的菌株出現(xiàn)。此外這些結(jié)果提示DES的誘變效率可能高于UV。

2.2 突變菌株的復(fù)篩

將經(jīng)過初步篩選后產(chǎn)量高于野生菌株酶活力110%的菌株作為候選菌株進(jìn)行搖瓶復(fù)篩。如圖3所示，除了1株只經(jīng)DES誘變的菌株外，在發(fā)酵至72h時(shí)，各復(fù)合誘變菌株的酶活力均較野生菌株高。但是在發(fā)酵至48h時(shí)，UV、DES單獨(dú)誘變及UV/DES復(fù)合誘變的菌株各有1株較野生菌株酶活力高，而DES/UV復(fù)合誘變菌株有3株的酶活力高于野生菌株。

圖3 各突變菌株復(fù)篩酶活力Fig.3 Time course of TG activity in cultures with different secondround screened mutants

綜合2.1節(jié)的結(jié)果， DES/UV的復(fù)合誘變方式優(yōu)于DES或UV單獨(dú)誘變的效果。而由于這種誘變方式只需要篩選一次，因此較傳統(tǒng)的誘變-篩選-再誘變的方式效率高；結(jié)合高通量的篩選方法[12]，使得本誘變育種技術(shù)勞動(dòng)強(qiáng)度大大下降，篩選量和成功率大大提高。

選取高產(chǎn)菌株，進(jìn)一步的搖瓶發(fā)酵的發(fā)酵液中酶活力顯示，酶活力最高的突變菌株DES/UV2（7.02 U/mL）比野生菌株（4.56 U/mL）產(chǎn)量提高了50%以上（數(shù)據(jù)未顯示），而突變菌株在培養(yǎng)48h時(shí)最高酶活力已經(jīng)可以達(dá)到5.83 U/mL，比野生菌株最高酶活力時(shí)高了近30%。從生產(chǎn)角度來說，該菌株不僅提高了產(chǎn)量，還大大縮短了產(chǎn)酶時(shí)間，可以大大節(jié)約成本。

2.3 高產(chǎn)菌株MTG表達(dá)

在獲得高產(chǎn)菌株的基礎(chǔ)上，對部分復(fù)篩效果較好的菌株利用SDS-PAGE技術(shù)進(jìn)行分析，嘗試對其高產(chǎn)機(jī)制進(jìn)行初步研究。如圖4所示，這些高產(chǎn)菌株的產(chǎn)酶活性提高并不是單純的表達(dá)量增加所引起，最重要的還與成熟機(jī)制有關(guān)。

圖4 不同發(fā)酵時(shí)間突變菌株MTG蛋白的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of protein expression with high-yield mutants at different time points of culture

24 h時(shí)突變株7（泳道7）發(fā)酵液中的總MTG表達(dá)量較野生菌株（泳道8）高，但酶活力為2.71 U/mL，比野生菌株的2.79 U/mL略低。發(fā)酵至48 h后這種成熟的差異更加明顯，如突變菌株3的總MTG量比突變菌株4低，但其酶活力（5.8 U/mL）卻比后者（3.18U/mL）高了近1倍。而48 h時(shí)酶活力較高的其他幾個(gè)菌株：突變菌株1（5.83 U/mL）、突變菌株5（4.48 U/mL）及突變菌株7（5.16 U/mL）均是MTG成熟較早、MTG比例較高的菌株。

這些結(jié)果說明，突變菌株產(chǎn)量（發(fā)酵液酶活力）的提高可能與酶原（Pro-MTG）、成熟MTG量的相互比例有關(guān)。高產(chǎn)菌株的高產(chǎn)機(jī)制可能與MTG的成熟相關(guān)。

2.4 MTG高產(chǎn)差異比較

MTG在胞內(nèi)被合成（pre-pro-TG）后，切除信號肽以酶原（pro-TG，本研究標(biāo)識為Pro-MTG）的形式被分泌到胞外，在經(jīng)過一系列蛋白酶的切割后，最終形成成熟的MTG[16]。由此可見，發(fā)酵液中MTG的酶活力不僅與MTG胞內(nèi)合成——即總MTG質(zhì)量（包括酶原、酶）有關(guān)，還受到成熟進(jìn)程的影響。

在對高產(chǎn)機(jī)制有了初步認(rèn)識的基礎(chǔ)上，為了進(jìn)一步研究酶原與酶之間的相關(guān)關(guān)系，本研究對部分經(jīng)復(fù)合誘變獲得的高產(chǎn)菌株進(jìn)行了進(jìn)一步的分析。幾株高產(chǎn)菌株的發(fā)酵液上清經(jīng)電泳后利用ChemiDoc? XRS+成像儀掃描分析酶原（Pro-MTG）和成熟酶（MTG）的蛋白質(zhì)量和相對含量，結(jié)果如表1所示。

表1 高產(chǎn)菌株發(fā)酵液上清中酶原、酶的蛋白質(zhì)量和百分比Table1 Protein amounts and proportions of pro-MTG and MTG in cultures of high yield mutants

由表1可知，高產(chǎn)菌株之間的產(chǎn)酶時(shí)間存在較大差異，MU2雖然72h時(shí)酶活力最高，但是48h時(shí)產(chǎn)酶活性甚至低于野生菌株。MU4菌株雖然與野生菌株相比最高酶活力差異較小，但48h時(shí)的酶活力比野生菌株高了近50%。

進(jìn)一步分析可以發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵液中MTG的酶活力不僅跟MTG表達(dá)量有關(guān)，還受Pro-MTG蛋白量的抑制，最明顯的是48h時(shí)，MU2中MTG的含量與MU1相似，但其酶活力卻只有MU1的60%左右；而MU4發(fā)酵液中MTG的含量雖然只有野生菌株的90%左右，酶活力卻比野生菌株高41.5%。

線性回歸分析（99%可信度）發(fā)現(xiàn)，酶活力與Pro-MTG蛋白量、MTG蛋白量、Pro-MTG比例和MTG比例的相關(guān)系數(shù)分別為－0.7607（P=0.0010）、0.9286（P ≤0.0001）、－0.5929（P=0.0198）和0.7393（P= 0.0016），均有較高的相關(guān)性，且酶活力與MTG含量正相關(guān)、與Pro-MTG含量負(fù)相關(guān)，這也進(jìn)一步證明發(fā)酵液中MTG活性確實(shí)會受到酶原的抑制。

這些結(jié)果說明部分突變菌株產(chǎn)量提高是由于成熟方式發(fā)生了改變，加快MTG的成熟可以提高發(fā)酵液中MTG的酶活力。

3 3 討 論

連續(xù)對孢子進(jìn)行UV、DES誘變的策略由于每種單個(gè)突變本身頻率低，使得有利突變組合概率極低；先DES（或UV）誘變后篩選高產(chǎn)菌株，再對高產(chǎn)菌株進(jìn)行UV（或DES）的方法，易把那種某個(gè)單獨(dú)突變不能明顯提高產(chǎn)量而與其他突變組合能顯著提高產(chǎn)量的突變遺漏。而本實(shí)驗(yàn)用UV（或DES）對鏈霉菌孢子懸液進(jìn)行誘變，將誘變后的懸液涂布擴(kuò)增孢子后不經(jīng)篩選直接用DES（或UV）進(jìn)行誘變，將二次誘變后的懸液稀釋涂布、挑單菌落篩選這樣的育種工藝雖然較直接將孢子懸液連續(xù)用DES及UV誘變后涂布篩選的方法繁瑣，但是卻可以對某種誘變方式誘變后獲得的有利突變（不一定明顯提高產(chǎn)量）通過菌株擴(kuò)大培養(yǎng)而得到保留，從而為二次誘變時(shí)提供更多的突變組合，提高了獲得必須擁有UV及DES誘變才能提高產(chǎn)量的菌株。

一般紫外誘變的特點(diǎn)是突變譜比較廣，但是效率比較低，不易獲得理想的突變株[14,17-18]；而化學(xué)誘變劑的突變譜相對較窄，一般情況下不能獲得AT→CG突變[9,19]。通過本研究的復(fù)合誘變方式可以有效地將兩種突變的優(yōu)勢結(jié)合。同時(shí)研究也證實(shí)，化學(xué)誘變的效果較紫外誘變好[20]，而復(fù)合誘變的效果比單種誘變效果理想。

通過復(fù)合誘變的方式，可順利篩選到了若干高產(chǎn)菌株，通過搖瓶發(fā)酵復(fù)篩驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，突變菌株最高酶活力比野生菌株提高了50%以上；突變菌株不僅產(chǎn)量有所提高，其產(chǎn)酶時(shí)間也明顯提前。該菌株在縮短1/3生產(chǎn)時(shí)間的情況下仍可以比野生菌株在正常發(fā)酵時(shí)間下的酶活力提高近20%的產(chǎn)量。

在獲得高產(chǎn)菌株的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)探討了突變菌株的高產(chǎn)機(jī)制。通過SDS-PAGE和灰度掃描的方法，首次證明發(fā)酵液中MTG的酶活力不僅僅與MTG自身的含量有關(guān)，還有酶原的含量成反比。發(fā)酵液中酶原含量的升高會直接導(dǎo)致總酶活力的下降，這可能酶原是成熟MTG的競爭性抑制劑的原因[21]。這些結(jié)果提示要獲得MTG高產(chǎn)菌株，一個(gè)重要的手段是提高酶原的轉(zhuǎn)化率和成熟速度[22]。在生產(chǎn)上，除了盡可能促使酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓腗TG[23]，還要盡可能在純化工藝中去除酶原，以解除其對MTG的抑制作用。在今后的研究中，可進(jìn)一步探索酶原對MTG抑制的原理，研究這種抑制的具體機(jī)理，以更好地促進(jìn)MTG成熟、提高M(jìn)TG的生產(chǎn)效率、降低MTG的生產(chǎn)成本。

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Screening and Characterization of High-Yield Microbial Transglutaminase-Producing Mutants Induced by a Novel Method

ZHANG Ying1, GUO Chen-chen1, HEI Dong-yan1, ZHANG Wei1, LU Wei2, JIN Ming-fei1,*
(1.School of Life Sciences, East China Normal University, Shanghai 200241, China；2. Taixing Dongsheng Food Science and Technology Co. Ltd., Taixing 225411, China)

Microbial transglutaminase (MTG)-producing strain Streptoymyces mobaraensis (S. mobaraensis) was subjected to mutagenesis using UV irradiation and diethyl sulfate (DES) treatment and the resulting colonies were screened by a high throughput method. Results showed that the combined mutagenesis had better performance than single mutagenesis. The high-yield MTG-producing mutants had either a higher MTG protein expression or a shortened maturation time of MTG. Among these, one mutant had the highest yield of 7.02 U/mL enzymatic activity, which was 54% higher than that of the wild-type strain. Further study found that this strain expressed MTG products 24 hours earlier than the wild-type one did. However, the yield of MTG could be highly inhibited by the zymogen pro-MTG.

microbial transglutaminase (MTG); Streptomyces mobaraensis; diethyl sulfate (DES); ultraviolet (UV); combined mutation

Q939.97

A

1002-6630（2014）11-0139-04

10.7506/spkx1002-6630-201411028

2013-07-12

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（78210203）；華東師范大學(xué)青年教師隊(duì)伍建設(shè)科研啟動(dòng)費(fèi)（79633430）

張瑩（1992—），女，本科，研究方向?yàn)槭称肺⑸铩-mail：510139229@qq.com

*通信作者：金明飛（1979—），男，助理研究員，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸铩-mail：mfjin@bio.ecnu.edu.cn