黃秋桂，張靈枝*，龔雪梅，楊偉瓊，曾淑婷

（華南農(nóng)業(yè)大學園藝學院，廣東 廣州 510642）

黑茶優(yōu)勢菌對綠茶浸提液發(fā)酵過程多酚類化合物的影響

黃秋桂，張靈枝*，龔雪梅，楊偉瓊，曾淑婷

（華南農(nóng)業(yè)大學園藝學院，廣東 廣州 510642）

利用從普洱茶中分離出的黑曲霉、根霉和從茯磚茶中分離出的冠突散囊菌接種云南大葉種曬青毛茶茶湯，進行單一菌株發(fā)酵，對發(fā)酵過程茶多酚類化合物的含量變化進行分析。結(jié)果表明：隨著發(fā)酵時間的延長，茶多酚含量顯著降低，黃酮類化合物總量在黑曲霉、冠突散囊菌作用下分別減少72%、31.76%，在根霉作用下增加了94.92%；兒茶 素各組分的含量變化較大，其中表沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯均呈現(xiàn)顯著的下降趨勢，而兒茶素、沒食子酸在不同菌株作用下表現(xiàn)出不同的變化規(guī)律；茶黃素在黑曲霉、根霉作用下先增加后減少，冠突散囊菌則相反；茶紅素總體呈下降趨向，茶褐素在根霉、冠突散囊菌作用下顯著增加。

黑曲霉；根霉；冠突散囊菌；液態(tài)發(fā)酵；多酚類化合物

普洱茶為代表的黑茶具有“醇、厚、甘、甜、滑”的獨特品質(zhì)，同時微生物代謝作用賦予其抗氧化、降血脂、減肥等特殊生理功效[1-2]。目前國內(nèi)外為了揭示黑茶品質(zhì)和保健功能形成機理，進行了大量的相關(guān)研究，其中比較深入的研究主要包括以下四方面：一是后發(fā)酵過程微生物類群，對微生物進行分離、鑒定[3-4]；二是微生物對后發(fā)酵茶品質(zhì)的影響，包括品質(zhì)成分分析和感官品質(zhì)評定[5-6]；三是后發(fā)酵過程微生物分泌的胞外酶變化規(guī)律及對品質(zhì)的影響[4,7]；四是后發(fā)酵茶的保健功能[8]。但對后發(fā)酵工序中微生物參與轉(zhuǎn)化的機理和轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的研究還很有 限。

普洱茶渥堆發(fā)酵過程中主要的微生物有黑曲霉、根霉屬等[9]，冠突散囊菌則是茯磚茶加工發(fā)花過程中的優(yōu)勢菌，其數(shù)量和質(zhì)量被作為判斷茯磚茶品質(zhì)優(yōu)劣的標準[10]。這些黑茶優(yōu)勢菌的生長代謝產(chǎn)生酶，促使茶葉內(nèi)質(zhì)成分發(fā)生復雜的變化，對其品質(zhì)的形成起著重要的作用。

本研究利用從普洱茶中分離得到的黑曲霉、根霉和從茯磚茶中分離得到的冠突散囊菌接種云南大葉種曬青毛茶茶湯，進行單一菌株發(fā)酵，擺脫多種微生物的混合作用，對發(fā)酵過程中茶多酚類化合物的變化規(guī)律進行分析，為探明黑茶后發(fā)酵過程微生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)、活性及其轉(zhuǎn)化形成機理提供參考依據(jù)，進而構(gòu)建黑茶優(yōu)勢菌對多酚類化合物的生物轉(zhuǎn)化體系。

1 材料與方法

1.1 材料與菌種

云南大葉種曬青毛茶，購自廣州芳村茶葉市場。

黑曲霉、根霉、冠突散囊菌從普洱茶和茯磚茶中分離得到，實驗室保存。

1.2 儀器與設(shè)備

THA-82A臺式恒溫振蕩器 上海一恒科學儀器有限公司；7200型可見分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司；Agilent 1200LC高效液相色譜儀 美國安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的活化培養(yǎng)

將4 ℃保存的黑曲霉、根霉、冠突散囊菌菌種取出，25 ℃條件下培養(yǎng)24h，用接種環(huán)挑取菌種菌絲在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）平板上劃線，28 ℃條件下培養(yǎng)4d。

1.3.2 孢子懸液的制備

取2cm2活化后的黑曲霉、根霉、冠突散囊菌菌片，分別接種于茶水比（m/V）為1∶30、1∶30、1∶60的茶湯培養(yǎng)基中，黑曲霉、根霉25 ℃、130 r/min培養(yǎng)2d，冠突散囊菌28 ℃、120 r/min培養(yǎng)6d，備用[11-12]。

1.3.3 茶湯培養(yǎng)基制備

將茶葉用粉碎機粉碎后，過40目篩，分別按茶水比為1∶30和1∶60的比例稱取茶葉，在100 ℃蒸餾水中浸提20min，過濾，分裝于250 mL的三角瓶中，每瓶裝100 mL，于120 ℃條件下滅菌20min，冷卻，備用。

1.3.4 液體發(fā)酵培養(yǎng)

將制備好的黑曲霉、根霉、冠突散囊菌孢子懸浮液各取1.0 mL分別接種到已滅菌的1∶30、1∶30、1∶60的茶湯培養(yǎng)基中，黑曲霉、根霉于25 ℃、130 r/min的條件下發(fā)酵4d，每1d取一次樣，冠突散囊菌于28 ℃、120 r/min的條件下發(fā)酵8d，每2d取一次樣[11-12]。設(shè)黑曲霉、根霉以茶水比1∶30的自然發(fā)酵茶湯為對照CK1，冠突散囊菌以茶水比1∶60的自然發(fā)酵茶湯為對照CK2。

1.3.5 樣品處理

過濾各階段發(fā)酵液，以相同茶水比的自然發(fā)酵液為對照樣，測定多酚類總量、兒茶素各組分含量、沒食子酸、黃酮苷、茶黃素、茶紅素、茶褐素含量，以上各項指標的測定均重復3次。

1.3.6 指標測定

茶多酚總量：GB/T 8313—1987《茶 茶多酚測定》中的酒石酸鐵比色法測定。

黃酮類化合物總量：三氯化鋁比色法測定。

茶色素：分光光度計法[13]測定。

兒茶素（ctechin，C）組分、沒食子酸（gallic acid，GA）：高效液相色譜法，色譜分析條件：色譜柱：Agilent TC-C18（4.6mm×250mm，5 μm）；檢測器：紫外檢測器278nm；樣品采用梯度洗脫，洗脫液由A、B兩相組成，A相：甲醇，B相：0.05%三氟乙酸水溶液，流速：0.8 mL/min，柱溫：35 ℃，進樣量：20 μL；采用外標法測定。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與作圖

采用Excel 2003和SPSS 13.0軟件進行處理，用SigmaPlot 10.0軟件作圖，并對實驗數(shù)據(jù)進行顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過程茶湯多酚類總量變化動態(tài)

圖1 茶湯發(fā)酵過程中茶多酚的含量變化Fig.1 Change in the content of tea polyphenols in tea infusion during fermentation

由圖1A可知，黑曲霉、根霉液態(tài)發(fā)酵過程中，茶多酚含量隨著發(fā)酵時間的延長而顯著降低（P＜0.05）。與發(fā)酵初期相比，黑曲霉發(fā)酵液中茶多酚含量降低了74.42%，根霉發(fā)酵液降低了83.77%。說明黑曲霉、根霉發(fā)酵過程中多酚類物質(zhì)發(fā)生明顯轉(zhuǎn)化，且根霉的轉(zhuǎn)化能力強于黑曲霉，這是由于兩者產(chǎn)生的多酚氧化酶活性不同造成的。

由圖1B可知，發(fā)酵前4d，冠突散囊菌發(fā)酵液中的茶多酚含量變化趨勢與自然發(fā)酵茶湯相比，無顯著差異（P＞0.05），這是由于發(fā)酵初期冠突散囊菌生長速度較為緩慢；發(fā)酵后4d差異顯著（P＜0.05），在冠突散囊菌的作用下，茶多酚含量減少了31.73%，較自然發(fā)酵茶湯降低了19.46%，與冠突散囊菌發(fā)酵過程中分泌胞外酶，催化茶多酚氧化、縮合以及產(chǎn)物之間的聚合等系列反應(yīng)有關(guān)[14]。此外，根據(jù)文獻[12]報道，菌絲體在生長過程能吸收茶湯中部分茶多酚。實驗過程中發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵4d后冠突散囊菌生物量明顯增加，對茶多酚的吸收也因此增加，這可能是發(fā)酵后期茶湯中多酚含量顯著下降的另一個原因。

2.2 發(fā)酵過程中茶湯黃酮類化合物總量的變化動態(tài)

黃酮類化合物是一類重要的生物學活性物質(zhì)，具有改善血液循環(huán)、提高免疫力等多種保健功效，其含量的高低與茶湯的滋味色澤密切相關(guān)[15]，可作為評判普洱茶品質(zhì)的指標之一。

圖2 茶湯發(fā)酵過程中黃酮類化合物的含量變化Fig.2 Change in the content of flavonoids in tea infusion during fermentation

如圖2A、B所示，不同微生物在液態(tài)發(fā)酵過程中對黃酮類化合物總量的影響規(guī)律不同。黑曲霉發(fā)酵液中黃酮類總量在發(fā)酵前期（0～2d）顯著下降，下降幅度為72%，發(fā)酵后期（2～4d）無明顯變化。冠突散囊菌發(fā)酵前期（0～4d）黃酮類總量降低了31.76%，達到顯著差異水平（P＜0.05）。說明黑曲霉、冠突散囊菌生長繁殖過程中分泌胞外酶以及有機酸[9,16]，促使黃酮類物質(zhì)發(fā)生酶促氧化 和酸水解等一系列生化反應(yīng)，同時，黃酮類氧化產(chǎn)物還可與咖啡堿形成絡(luò)合物[17]。黃酮類物質(zhì)的減少有助于茶湯滋味的醇化和改善茶湯湯色，隨著發(fā)酵時間的延長，黑曲霉發(fā)酵液、冠突散囊菌發(fā)酵液湯色逐漸變得“橙黃明亮”，說明黃酮類物質(zhì)含量的降低，有利于改善茶湯湯色。而根霉發(fā)酵液中黃酮類物質(zhì)總量隨著發(fā)酵時間的延長呈顯著上升趨勢（P＜0.05），與發(fā)酵前相比增加了94.92%。這是由于茶葉中黃酮類物質(zhì)大部分是以糖苷形式存在，在高溫高濕的滅菌環(huán)境下迅速水解[17]，含量降低。而根霉的淀粉酶活性很高[18]，茶湯發(fā)酵過程中淀粉迅速降解，促使黃酮類與糖重新結(jié)合，從而含量增加。此外，冠突散囊菌容易分泌淀粉酶[19]，其發(fā)酵后期黃酮類總量的增加可能由于黃酮類與糖結(jié)合的速率高于其氧化水解速率。

2.3 發(fā)酵過程中茶湯兒茶素組分含量的變化動態(tài)

兒茶素是茶葉中的重要活性物質(zhì)，沒食子酸是普洱茶的特征成分之一，具有清除人體自由基、降脂、降糖等功效[20-21]。在渥堆工藝中，微生物能夠分泌多酚氧化酶、單寧酶等，共同促使茶多酚，尤其是兒茶素發(fā)生轉(zhuǎn)化，進而產(chǎn)生茶色素等一系列氧化產(chǎn)物。

表1 不同發(fā)酵時間茶湯兒茶素組分含量Table1 Catechin contents in tea infusion at different fermentation times

由表1可知，在黑曲霉、根霉、冠突散囊菌的作用下，表沒食子兒茶素（epiglloctechin，EGC）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epiglloctechingllte，EGCG）、表兒茶素（epicatechin，EC）、表兒茶素沒食子酸酯（epictechingllte，ECG）隨著發(fā)酵時間的延長均呈現(xiàn)顯著的下降趨勢（P＜0.05），其中根霉發(fā)酵液中兒茶素含量下降尤為顯著（P＜0.05），EGC、EGCG、EC、ECG含量與發(fā)酵前相比，分別下降了93.83%、95.35%、86.87%、98.83%。這可能是因為在微生物分泌的胞外酶作用下，酯型兒茶素降解形成簡單兒茶素，簡單兒茶素進一步發(fā)生氧化生成茶色素類物質(zhì)。此外，菌絲體生長過程中分泌有機酸以及對兒茶素的吸收，均導致發(fā)酵液中兒茶素含量的降低[22]。黑曲霉、冠突散囊菌發(fā)酵液中C含量先增加后減少，而根霉發(fā)酵液中C的含量呈下降趨勢，與自然發(fā)酵茶湯相比存在顯著差異（P＜0.05）。說明發(fā)酵初期，黑曲霉、冠突散囊菌對酯型兒茶素的降解能力高于對兒茶素的氧化能力，因此C含量呈上升趨勢；而根霉在整個發(fā)酵過程中均表現(xiàn)出很強的氧化能力，進而產(chǎn)生茶色素等一系列氧化產(chǎn)物。根霉發(fā)酵液中沒食子酸（gallic acid，GA）含量顯著下降（P＜0.05），與發(fā)酵前相比降低了97.21%，而黑曲霉發(fā)酵中GA含量先增加后減少，而冠突散囊菌作用下GA含量則表現(xiàn)為先減少后增加，這也是由于不同微生物對GA的生成轉(zhuǎn)化速率不同而引起的。

2.4 發(fā)酵過程茶湯茶色素的變化動態(tài)

茶黃素（theaflavin，TF）、茶紅素（thearubigin，TR）、茶褐素（theabrownin，TB）均為茶多酚不同程度的氧化產(chǎn)物，是普洱茶的主要色素物質(zhì)。隨著發(fā)酵時間的增加，茶多酚氧化程度逐漸加深，茶黃素與茶紅素的積累進一步轉(zhuǎn)化為茶褐素[23]。

圖3 茶湯發(fā)酵過程中花色素含量變化Fig.3 Change in the content of tea pigments in tea infusion during fermentation

由圖3A、B分析可知，黑曲霉、根霉發(fā)酵過程中，茶黃素含量先增加后減少，這是由于發(fā)酵初期（0～1d）兒茶素氧化聚合形成茶黃素的速率遠遠大于茶黃素進一步氧化的速率，發(fā)酵后期則相反；而冠突散囊菌發(fā)酵液中的茶黃素含量先減少后增加，說明發(fā)酵前期（0～4d）多酚類總量無明顯變化，發(fā)酵后期茶多酚大量轉(zhuǎn)化為茶色素，與上述冠突散囊菌發(fā)酵液中茶多酚含量變化情況相符。黑曲霉、根霉、冠突散囊菌發(fā)酵液中，茶紅素含量在整個發(fā)酵過程中呈總體下降趨向，達顯著差異水平（P＜0.05）。黑曲霉發(fā)酵第3天，茶紅素含量的略微上升與茶紅素作為聚合過程的中間產(chǎn)物有關(guān)，一方面通過TF的氧化聚合而增加，另一方面TR進一步氧化聚合而減少。根霉、冠突散囊菌發(fā)酵液中茶褐素含量顯著增加，增加速率根霉高于冠突散囊菌。與發(fā)酵前相比，根霉、冠突散囊菌發(fā)酵液茶褐色含量分別增加了6.4、1倍，具顯著差異性（P＜0.05）。說明一定數(shù)量根霉的存在，有利于形成普洱茶醇厚品質(zhì)。黑曲霉發(fā)酵液與自然發(fā)酵茶湯相比，茶褐素含量變化趨勢無顯著差異（P＞0.05）。

3 結(jié) 論

隨著發(fā)酵過程的進行，茶多酚含量顯著降低，黃酮類化合物總量在黑曲霉、冠突散囊菌作用下分別減少72%、31.76%，在根霉作用下增加了94.92%；兒茶素各組分的含量變化較大，其中表型兒茶素EGC、EGCG、EC、ECG均呈現(xiàn)顯著的下降趨勢，而C、GA則在不同菌株作用下表現(xiàn)出不同的變化規(guī)律；茶黃素在黑曲霉、根霉作用下先增加后減少，冠突散囊菌則相反；茶紅素呈總體下降趨向，茶褐素在根霉、冠突散囊菌作用下顯著增加。研究結(jié)果對進一步探明轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分子結(jié)構(gòu)、活性及其轉(zhuǎn)化形成的機理具有一定參考價值。

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Effect of Fermentation with Preponderant Fungi from Dark Tea on Tea Polyphenols of Green Tea Extracts

HUANG Qiu-gui, ZHANG Ling-zhi*, GONG Xue-mei, YANG Wei-qiong, ZENG Shu-ting
(College of Horticulture, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

In this study, Aspergillus niger and Rhizopus isolated from Pu-erh tea and Eurotium cristatum isolated from Fuzhuan tea were used for the fermentation of aqueous infusions of the sun-dried green tea as the raw material for Pu-erh tea, respectively. Results showed that the content of tea polyphenols was significantly decreased with increasing fermentation time. Aspergillus niger and Eurotium cristatum reduced the total flavonoid content by 72% and 31.76%, respectively. On the contrary, Rhizopus increased the total flavonoid content by 94.92%. The contents of epiglloctechin (EGC), epiglloctechingllte (EGCG), epicatechin (EC), epictechingllte (ECG) were significantly lowered, while catechin (C) and gallic acid (GA) showed different variation patterns under the influence of different microbes. Theaflavins increased firstly and then decreased by Aspergillus niger and Rhizopus, while Eurotium cristatum had the opposite effect. Thearubigins content increased during the fermentation process. Theabrownins were increased significantly by Aspergillus niger and Eurotium cristatum.

Aspergillus niger; Rhizopus; Eurotium cristatum; liquid-state fermentation; polyphenols

TS272.5

A

1002-6630（2014）11-0164-04

10.7506/spkx1002-6630-201411033

2013-05-24

廣東省自然科學基金項目（5300-E12237）

黃秋桂（1989—），女，碩士，研究方向為茶葉生物化學與茶葉深加工綜合利用。E-mail：hqg19892012@163.com

*通信作者：張靈枝（1972—），女，副教授，博士，研究方向為茶葉深加工與綜合利用。E-mail：lingzhi@scau.edu.cn