王一淇，李宗軍*

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 湖南 長沙 410028）

湖南芥菜腌制發(fā)酵過程中的菌相變化規(guī)律

王一淇，李宗軍*

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 湖南 長沙 410028）

從動態(tài)角度研究湖南芥菜發(fā)酵過程中6種菌相階段性變化，為其實現(xiàn)從自然發(fā)酵到人工發(fā)酵提供科學(xué)依據(jù)。結(jié)果表明：芥菜發(fā)酵主要分為3個階段。第1階段發(fā)酵液pH＞5.0，細(xì)菌總數(shù)、腸道桿菌及酵母菌數(shù)量先下降后上升，乳酸球菌為優(yōu)勢菌種，數(shù)量達(dá)到106CFU/g；第2階段發(fā)酵液pH值降至5.0以下，細(xì)菌總數(shù)、腸道桿菌及酵母菌數(shù)量在一個數(shù)量級內(nèi)上下波動，分別為105、104、105，乳酸桿菌成為優(yōu)勢菌種，數(shù)量級為106，球菌為105；第3階段發(fā)酵液pH＜4.0，細(xì)菌、酵母菌和乳酸菌的數(shù)量開始明顯減少，腸道桿菌生長基本受到抑制，乳酸桿菌仍是優(yōu)勢菌種，數(shù)量級在 104。醋酸菌數(shù)量一直處于一個非常低的水平。為實現(xiàn)芥菜的自然發(fā)酵到人工發(fā)酵，可以用乳酸球菌和乳酸桿菌組合當(dāng)發(fā)酵劑，并且適當(dāng)降低發(fā)酵初始pH值。

芥菜；發(fā)酵；菌相變化

大約3000年前，我國就有了發(fā)酵蔬菜的制作工藝，如四川泡菜、榨菜、揚州醬菜等。傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜是我國蔬菜加工產(chǎn)品中產(chǎn)量最多的一種[1]。傳統(tǒng)的蔬菜腌制是利用高鹽濃度的滲透作用及乳酸菌在蔬菜中的生長代謝，利用乳酸發(fā)酵賦予腌菜特有風(fēng)味。但目前，一些地區(qū)蔬菜腌制產(chǎn)品工藝依然停留在自然發(fā)酵水平。其發(fā)酵周期長，生產(chǎn)過程不易控制及易引起環(huán)境污染等一系列問題，腌制過程中的雜菌尤其是硝酸鹽還原菌，能夠產(chǎn)生亞硝酸鹽等對人體有害的物質(zhì)，導(dǎo)致腌菜企業(yè)難以實現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)?；a(chǎn)[2]。同時由于消費者對食品安全和健康的追求，迫切需要發(fā)酵蔬菜低鹽、低亞硝酸鹽含量的產(chǎn)品，實現(xiàn)加工標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)?；Ｈ斯ぐl(fā)酵蔬菜正好可以滿足人們的這些要求。本實驗針對湖南芥菜加工現(xiàn)狀，檢測其發(fā)酵過程中的菌相變化，為實現(xiàn)自然發(fā)酵到人工發(fā)酵提供科學(xué)依據(jù)[3-4]。

1 材料與方法

1.1 材料與培養(yǎng)基

1.1.1 芥菜品種

芥菜來自湖南省長沙市黃興鎮(zhèn)。

1.1.2 培養(yǎng)基

PCA（plate count agar）培養(yǎng)基（培養(yǎng)細(xì)菌用）：胰蛋白胨5.0 g/L、酵母浸粉2.5 g/L、葡萄糖1.0 g/L、瓊脂15 g/L，pH7.0，121 ℃滅菌20 min。

MRS培養(yǎng)基（g/L，培養(yǎng)乳酸桿菌用）：蛋白胨10、牛肉膏10、酵母提取物5、K2HPO42、檸檬酸二銨2、乙酸鈉5、葡萄糖20、MgSO4·7H2O 0.58、MnSO4·4H2O 0.25、瓊脂15、吐溫-80 1 mL/L，pH6.2～6.4，121 ℃滅菌20 min。

M17培養(yǎng)基（g/L，培養(yǎng)乳酸球菌用）：大豆蛋白胨5.0、蛋白胨2.5、酪蛋白胨 2.5、酵母浸粉2.5、牛肉浸粉5.0、乳糖5.0、抗壞血酸0.5、β-甘油磷酸二鈉19、瓊脂15，pH7.1，121 ℃滅菌20 min。

McConkey培養(yǎng)基（g/L，培養(yǎng)腸道桿菌用）：蛋白胨20、牛膽鹽5、氯化鈉5、乳糖10、結(jié)晶紫0.001、中性紅0.025、瓊脂15，pH6.2～6.4，121 ℃滅菌20 min。

MEA（Malt Extract Agar）培養(yǎng)基（g/L，培養(yǎng)酵母菌用）：麥芽膏粉130、氯霉素0.1、瓊脂15，121 ℃滅菌20 min。

DMS（deoxycholate mannitol sorbitol）培養(yǎng)基[5-6]（g/L，培養(yǎng)醋酸菌用）：蛋白胨10、酵母提取物3、乳酸鈣 15、葡萄糖1、山梨糖醇1、甘露糖1、磷酸鉀1、脫氧膽酸鈉0.1、硫酸鎂0.02、溴甲酚0.03、放線菌酮0.1、瓊脂 18，pH4.5，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

超凈工作臺 安徽蚌埠市瑞風(fēng)凈化設(shè)備工程；電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；酸度計中國杭州雷磁分析儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵工藝流程

芥菜 →切碎→撒鹽（質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的鹽）→裝袋→密封→保溫發(fā)酵1 d→小袋分裝→密封→恒溫20 ℃發(fā)酵

1.3.2 取樣

在發(fā)酵第0、5、10、15、20、30、45、60、75、90天取樣，每次取1小袋（約500 g）樣品進(jìn)行檢測。

1.3.3 微生物指標(biāo)測定

采用稀釋平板計數(shù)法：無菌稱取25 g樣品于裝有225 mL無菌生理鹽水的三角瓶中，制成10-1稀釋液后于試管內(nèi)進(jìn)行梯度稀釋，稀釋至適宜度數(shù)進(jìn)行以下各種微生物的分離培養(yǎng)與計數(shù)。

細(xì)菌總數(shù)的測定：傾注PCA培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)48 h計數(shù)，由于乳酸菌在PCA生長微弱，所以細(xì)菌總數(shù)不包括乳酸菌的數(shù)量。乳酸桿菌的測定：傾注MRS培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)48 h計數(shù)。乳酸球菌的測定：傾注M17培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)48 h計數(shù)。腸道桿菌屬的測定：傾注McConkey培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)48 h計數(shù)。酵母菌的測定：傾注MEA培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)48 h計數(shù)。醋酸菌的測定：傾注DMS培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)48 h計數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

運用PASW Statistics Base 18分析，數(shù)據(jù)用±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 芥菜自然發(fā)酵過程中pH值的變化

圖1 芥菜發(fā)酵過程中pH值的變化Fig.1 pH change during the fermentation process of Chinese leaf mustard

由圖1可知，芥菜在自然發(fā)酵過程中，隨著發(fā)酵時間的延長，有機酸累積、pH值逐漸下降，發(fā)酵前期（0～15d）pH值一直維持在5.0以上，發(fā)酵中期（15～60d）pH降到了5.0以下；發(fā)酵后期（60～90d），

pH值降到了4.0以下，并維持在一個較低值。

2.2 芥菜自然發(fā)酵過程中酵母菌及腸道桿菌總數(shù)的變化

圖2 芥菜發(fā)酵過程中腸道桿菌總數(shù)、酵母菌總數(shù)的變化Fig.2 Change in the amounts of Enterobacteriaceae and yeast duringthe fermentation process of Chinese leaf mustard

由圖2可知，芥菜發(fā)酵過程中，其自帶的大量酵母菌，在鹽含量10%的環(huán)境中，數(shù)量略有下降，之后在發(fā)酵過程中酵母菌總數(shù)都保持在5（lg（CFU/g）），說明在芥菜自然發(fā)酵微生物區(qū)系中，酵母菌對整個發(fā)酵過程起了重要作用。pH值在4.0以上的變化對酵母菌總數(shù)影響不大，但pH值低于4.0時，酵母菌生長受到抑制，降到了4（lg（CFU/g））。芥菜自帶大量腸桿菌。在高鹽濃度環(huán)境下，其數(shù)量在第5天明顯下降。由于自然發(fā)酵雜菌混多，導(dǎo)致產(chǎn)酸慢，到第60天的過程中，腸道桿菌數(shù)一直處于相對穩(wěn)定的4（lg（CFU/g））內(nèi)。pH值降到4.0以下時，基本上抑制了其生長，在稀釋10倍的平皿上已經(jīng)檢測不到腸道桿菌的存在。

圖3 芥菜發(fā)酵過程中細(xì)菌總數(shù)的變化Fig.3 Change in the amount of total bacteria during the fermentation process of Chinese leaf mustard

2.3 芥菜自然發(fā)酵過程中細(xì)菌總數(shù)的變化由圖3可知，芥菜自然發(fā)酵過程中，細(xì)菌總數(shù)基本處于一個下降的過程。第5天數(shù)量略為下降，第10天其數(shù)量達(dá)到峰值6.8（lg（CFU/g））；在第15～60天，細(xì)菌總數(shù)保持在

5（lg（CFU/g）），這是由于在發(fā)酵的初期，環(huán)境中營養(yǎng)物質(zhì)還比較豐富，酸度還不是很大，使得微生物類群大量生長；到了發(fā)酵中后期，厭氧或兼性厭氧的乳酸菌在各菌相中占據(jù)了優(yōu)勢，pH＜4.0時，細(xì)菌總數(shù)大部分被抑制住，總數(shù)明顯下降，第90天降至3.75（lg（CFU/g））。

2.4 芥菜自然發(fā)酵過程中乳酸球菌與乳酸桿菌總數(shù)的變化

圖4 芥菜過程中乳酸球菌總數(shù)、乳酸桿菌總數(shù)的變化Fig.4 Change in the amounts of Lactobacillus and Lactococcus during the fermentation process of Chinese leaf mustard

由圖4可知，在芥菜自然發(fā)酵過程中，乳酸菌生長可分成3個階段。發(fā)酵前期（0～15d），主要是乳酸球菌處于優(yōu)勢地位， pH值維持在5.0以上，乳酸球菌具有繁殖快、耐酸性差的特點；發(fā)酵中期（15～60d），pH值下降到5.0以下，這時乳酸球菌的活動受到抑制，桿菌數(shù)量始終高于球菌，球菌的數(shù)量在5（lg（CFU/g））開始有下降趨勢；發(fā)酵到第60天，pH值降至4.0，乳酸桿菌數(shù)量達(dá)到峰值6.86（lg（CFU/g）），乳酸球菌的數(shù)量因桿菌的生長和pH值的變化受到抑制，數(shù)量開始顯著下降；發(fā)酵后期（60～90d），pH＜4.0，乳酸球菌的數(shù)量大量減少，桿菌的生長在后期因營養(yǎng)物質(zhì)減少，代謝物質(zhì)的增加，數(shù)量也開始明顯減少，但仍大量存在。

2.5 芥菜自然發(fā)酵過程中醋酸菌總數(shù)的變化

圖5 芥菜發(fā)酵過程中醋酸菌的總數(shù)變化Fig.5 Change in the amount of acetic acid bacteria during the fermentation process of Chinese leaf mustard

由圖5可知，芥菜在未發(fā)酵前自帶一定量的醋酸菌，但在高鹽厭氧環(huán)境中，醋酸菌數(shù)量迅速下降，在稀釋10倍的樣品中已經(jīng)檢測不到醋酸菌的存在。說明在芥菜的發(fā)酵過程中，醋酸菌的作用甚微。

3 討 論

蔬菜發(fā)酵是中國保藏食品傳統(tǒng)方法之一，因其具有獨特的風(fēng)味所以流行至今。慢慢人們發(fā)現(xiàn)發(fā)酵蔬菜的未來市場廣闊[7]，但其發(fā)酵周期長，難以實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)；同時人們也開始意識到自然發(fā)酵蔬菜處理不當(dāng)[8]，存在許多健康隱患，如亞硝酸鹽含量高等。于是大量的研究開始針對各種發(fā)酵蔬菜其微生物組成，大多研究[9-10]是對已經(jīng)腌制好的成品進(jìn)行分析，并從中分離優(yōu)勢菌種來作為后期研究，這些樣品具有較高酸度，所以分離出的優(yōu)勢菌種大多為乳酸桿菌。

本實驗是利用微生物培養(yǎng)的方法，從一個動態(tài)的角度，完整的觀察了蔬菜發(fā)酵不同階段的菌相變化。這樣不僅是為了分離出優(yōu)良的發(fā)酵劑菌種，還為了了解芥菜發(fā)酵過程中優(yōu)勢菌種的變化以及其對不同發(fā)酵階段的意義，為選擇發(fā)酵菌種提供依據(jù)。本實驗針對發(fā)酵蔬菜中普遍存在的幾大菌群進(jìn)行了動態(tài)數(shù)量分析。

3.1 乳酸球菌與乳酸桿菌

由本實驗結(jié)果可知，前期以乳酸球菌為主要優(yōu)勢菌和后期主要以乳酸桿菌來完成發(fā)酵，結(jié)合乳酸球菌不耐酸和桿菌耐酸能力強等特點，以及參考相關(guān)文獻(xiàn)，此結(jié)果與前人所研究的結(jié)果是一致的。關(guān)倩倩[11]對泡菜自然發(fā)酵過程中的菌系結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，得出在此過程中，乳酸菌總數(shù)在起始發(fā)酵階段相對較少，為2.19（lg（CFU/mL）），在發(fā)酵中期才成為優(yōu)勢菌。值得提出的是，包括上述這份報道在內(nèi)的國內(nèi)關(guān)于我國傳統(tǒng)泡菜乳酸菌的研究中，乳酸菌在初期并不是優(yōu)勢菌種。而本研究中，蔬菜本身自帶大量的乳酸菌，而且在發(fā)酵前中階段，乳酸菌就一直屬于優(yōu)勢菌種。除此之外，在本實驗中，乳酸球菌與桿菌的數(shù)量雖始終有個數(shù)量級的落差，但是整體上是同升同降，并不存在桿菌的大量繁殖而抑制球菌的數(shù)量的現(xiàn)象[4]。出現(xiàn)這些不同結(jié)果的原因可能有兩種：1）樣品表面附著的菌系結(jié)構(gòu)會因蔬菜種類，地區(qū)，氣候等因素的不同而產(chǎn)生差異；2）發(fā)酵蔬菜在腌制過程中，會因為操作、鹽度、溫度的不同也會導(dǎo)致微生物群的差異。

3.2 酵母菌

酵母菌作為發(fā)酵過程中不能忽視的一大類菌。酵母菌可以從蔬菜的本身帶來，也可以從腌制工具和空氣中來[3]。它參與發(fā)酵，給予發(fā)酵蔬菜特殊的風(fēng)味。但是大量的繁殖也會帶給腌制品不愉快的酸臭味，導(dǎo)致腌制品變質(zhì)。有研究[12]表明，在運用變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）分析發(fā)酵蔬菜中的菌相變化中，發(fā)酵性酵母可在整個主發(fā)酵及二次發(fā)酵階段生長，酵母的數(shù)量變化主要由發(fā)酵pH值階段變化來決定，這與本實驗的結(jié)果相一致。在本實驗中，在主要的發(fā)酵階段酵母的數(shù)量僅次于乳酸菌。這一結(jié)果表明，在湖南芥菜腌制過程中，酵母菌這一菌群也起著非常重要的作用。

3.3 腸道桿菌

腸道桿菌對于整個發(fā)酵屬于有害菌。根據(jù)施安輝等[3]的研究，蔬菜腌制中有害微生物的生長繁殖在pH4.5以下時是受到抑制的。其中大腸桿菌所能忍受的最低pH值為5.0～5.5。結(jié)合本實驗結(jié)果，在人工發(fā)酵芥菜中，在初始發(fā)酵時添加適當(dāng)?shù)乃醽斫档蚿H值，可以大量抑制發(fā)酵液中的有害菌，同時還能為乳酸菌提供更適的生長環(huán)境。

3.4 醋酸菌

在蔬菜發(fā)酵中普遍存在一些醋酸菌，其在好氧的條件下，把酒精轉(zhuǎn)化為醋酸[3]。適量的醋酸菌及其活動是對泡菜有利的[9]。對于醋酸菌的相關(guān)研究中[13]，常規(guī)篩選培養(yǎng)基具有黏度小、傾倒平板時用于產(chǎn)酸指示劑作用的碳酸鈣很容易在平皿底沉淀的特點，這樣導(dǎo)致上層碳酸鈣含量低，不利于好氧菌醋酸菌的的觀察。針對醋酸菌的分離培養(yǎng)，本實驗使用的是DMS培養(yǎng)基，不同于常規(guī)醋酸菌篩選培養(yǎng)基，其黏度適中，使用溴甲酚紫作為指示劑，其產(chǎn)生的變色反應(yīng)能很好的觀察醋酸菌的生長。

3.5 細(xì)菌

傳統(tǒng)蔬菜腌制，利用的就是蔬菜自帶的細(xì)菌進(jìn)行發(fā)酵，除了以上幾大菌群之外，發(fā)酵液中還存在大量的其他細(xì)菌。這一部分微生物組成相對復(fù)雜，但是其生長狀況對最后蔬菜品質(zhì)存在重要意義。董玲[14]對四川傳統(tǒng)腌制的冬菜進(jìn)行了細(xì)菌多樣性研究，發(fā)現(xiàn)其細(xì)菌主要由變形桿菌門、厚壁菌門和放線菌門組成，而其中芽孢桿菌對冬菜腌制成熟起重要作用。本實驗對于細(xì)菌總數(shù)的研究，意在觀察其與發(fā)酵階段以及其他幾大菌群的消長規(guī)律，結(jié)果表明：高鹽的環(huán)境能抑制一部分細(xì)菌的生長，但就整個發(fā)酵階段來看，其主要受發(fā)酵酸度變化的影響，與其他菌群消長關(guān)系不大。

根據(jù)以上研究分析，如果要實現(xiàn)湖南芥菜的工業(yè)化生產(chǎn)，在選擇發(fā)酵劑菌種時應(yīng)選擇組合菌種發(fā)酵效果會比較好，可以用乳酸球菌和乳酸桿菌進(jìn)行組合。因為這樣更接近它自然發(fā)酵的狀態(tài)，并且乳酸菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量有機酸，其既能抑制其他有害微生物的生長，還能提高產(chǎn)品的營養(yǎng)價值[15-16]。除此之外，可以在發(fā)酵初期添加適當(dāng)?shù)乃?，降低其初始pH值到5.0左右，這樣可以有效抑制有害菌群的生長，同時也為乳酸菌提供更適合的生長環(huán)境，相信在一定程度上也可以縮短發(fā)酵周期以及降低亞硝酸鹽含量[17-18]。湖南芥菜是湖南本地人經(jīng)常用來作為腌制酸菜吃的，基本融入了每家每戶的生活，通過發(fā)展發(fā)酵劑，期望能在保留原有風(fēng)味的同時，讓人們吃得更方便和健康。

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Changing Patterns of Microflora during Natural Fermentation of Chinese Leaf Mustard (Brassica juncea coss) Grown in Hunan Province, China

WANG Yi-qi, LI Zong-jun*
(College of Food Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410028, China)

Dynamic changes in the numbers of six microbial populations at diffe rent stages of natural fermentation of Chinese leaf mustard (Brassica juncea coss) were investigated by microbial culture methods. The results showed that the fermentation process of Chinese leaf mustard included three stages: 1) the fermented juice was at a pH greater than 5.0, the numbers of total bacteria, Enterobacteriaceae and yeast were increased and subsequently decreased, and the dominant bacterium was Lactobacillus, reaching 106CFU/g; 2) the pH of fermented juice was reduced to below 5.0, the numbers of total bacteria, Enterobacteriaceae and yeast were fluctuated within orders of magnitude of 105, 104and 105, respectively, and Lactococcus became the dominant bacterium at an order of magnitude of 106, compared to 105for Lactobacillus; 3) the pH of fermented juice was further reduced to smaller than 4.0, the numbers of total bacteria and yeast began to significantly decline, the growth of Enterobacteriaceae was almost inhibited, and Lactococcus remained dominant at a level of 104, whereas acetic acid bacteria were always at very low levels. Artificial fermentation with a composite starter culture consisting of Lactobacillus and Lactococcus at appropriately low levels of initial pH may be an alternative to natural fermentation.

Chinese leaf mustard; fermentation; microf oral change

R151.3

A

1002-6630（2014）11-0200-04

10.7506/spkx1002-6630-201411040

2013-09-21

王一淇（1989—），女，碩士研究生，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：wangyiqiice@163.com

*通信作者：李宗軍（1968—），男，教授，博士，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：hnlizongjun@163.com