向世瓊，鄔應(yīng)龍*，馮 嬌

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014）

RS4型抗性淀粉對(duì)齊口裂腹魚脂肪代謝相關(guān)酶及相關(guān)基因表達(dá)的影響

向世瓊，鄔應(yīng)龍*，馮 嬌

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014）

目的：研究RS4型抗性淀粉對(duì)齊口裂腹魚脂肪代謝相關(guān)酶及相關(guān)基因表 達(dá)的影響。方法：將體質(zhì)量75g左右的齊口裂腹魚隨機(jī)按RS4型抗性淀粉添加量分為5組：0%（對(duì)照組）、3.5%、7%、14%、28%。飼喂60d，采用銅試劑法測(cè)定脂蛋白脂酶（lipoprotein lipase，LPL）、肝脂酶（hep atic lipase，HL）活性及游離脂肪酸（free fatty acids，F(xiàn)FA）含量，并采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time-polymerase chain reaction，RT-PCR）技術(shù)檢測(cè)各組肌肉及肝臟中過(guò)氧化物酶增殖體激活受體γ（peroxisome proliferators activated receptor γ，PPARγ）、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助活 化因子（peroxisome proliferators activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α）mRNA表達(dá)水平。結(jié)果：RS4型抗性淀粉添加劑量在7%以上時(shí)能夠顯著的提高齊口裂腹魚肝臟中脂蛋白脂酶和肝脂酶活性（P＜0.05），使血清及肝臟中游離脂肪酸含量增加（P＜0.05）；添加量為3.5%對(duì)LPL、HL活性及FFA含量均無(wú)顯著影響（P＞0.05）。添加量為7%和14%時(shí)能顯著提高肌肉和肝臟中PPARγ和PGC-1α mRNA表達(dá)量（P＜0.05）。結(jié)論：適當(dāng)?shù)奶砑覴S4型抗性淀粉能提高齊口裂腹魚肌肉和肝臟中脂肪代謝相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平，同時(shí)也能夠增加齊口裂腹魚肝臟中脂肪代謝相關(guān)酶的活性，促進(jìn)甘油三酯的分解。

抗性淀粉；齊口裂腹魚；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；過(guò)氧化物酶增殖體激活受體γ；過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助活化因子

歐洲抗性淀粉研究協(xié)會(huì)1993年將抗性淀粉（resistant starch）定義為：不被健康人體小腸所吸收的淀粉及其降解產(chǎn)物的總稱。根據(jù)抗性淀粉產(chǎn)生抗性的原理不同一般將其分為4種，化學(xué)改性淀粉是RS4型抗性淀粉，相比原淀粉，其更不易消化，有更高的黏度，更耐酸和高溫[1]。近年來(lái)，抗性淀粉和含有抗性的食物因其生理功能與膳食纖維相似，能有效預(yù)防心血管疾病、高脂血癥、糖尿病的發(fā)生以及增加腸道菌群的多樣性等優(yōu)點(diǎn)，使其備受關(guān)注。

齊口裂腹魚（Schizothorax prenanti Tchang）為主要分布于大渡河、青衣江水系上游的一種冷水性魚類，屬鯉科中的裂腹魚亞科裂腹魚屬，其肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[2]。

國(guó)內(nèi)外大量研究表明抗性淀粉對(duì)小鼠的脂質(zhì)代謝有一定的調(diào)節(jié)作用，能夠改善其腸道菌群，并且對(duì)肥胖相關(guān)炎癥因子TNF-α、IL-6和MCP-1有一定的調(diào)節(jié)作用[3-8]。Takanori等[9]研究表明抗性淀粉能下調(diào)肝臟中固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1（sterol regulatory element binding protein，SREBP1-C） mRNA表達(dá)水平，進(jìn)而可能調(diào)節(jié)其成熟形式的釋放導(dǎo)致脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，F(xiàn)AS）mRNA水平的下降。Hara等[10]報(bào)道稱飼喂膳食纖維血清膽固醇降低，可能是由于盲腸內(nèi)容物產(chǎn)生的有機(jī)酸對(duì)其肝臟中膽固醇合成抑制造成的。但RS4型抗性淀粉在魚類上的運(yùn)用和作用機(jī)理還未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用在齊口裂腹魚餌料中添加不同劑量的RS4型抗性淀粉的方法，探討其對(duì)齊口裂腹魚脂肪代謝相關(guān)酶的影響，并通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real time-polymerase chain reaction，RT-PCR）技術(shù)檢測(cè)齊口裂腹魚脂質(zhì)代謝相關(guān)基因氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferators activated receptor γ，PPARγ）、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助活化因子（peroxisome proliferators activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α）mRNA表達(dá)水平，以期為RS4型抗性淀粉調(diào)節(jié)魚類脂肪代謝提供相應(yīng)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

RS4型抗性淀粉為實(shí)驗(yàn)室自制[11]。

脂蛋白脂酶（lipoprotein lipase，LPL）、肝脂酶（hepatic lipase，HL）、總脂酶（total lipozyme，TL）、游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）組織蛋白試劑盒南京建成生物工程研究所；TRNzol Tiangen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTM日本TaKaRa公司；熒光定量八連板 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PCR儀器、熒光定量PCR儀器、凝膠成像系統(tǒng)、水平電泳槽、電泳儀 美國(guó)Bio-Rad公司；微量移液器、Centrifuge 5810R高速低溫離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司。

1.3 動(dòng)物及處理

1.3.1 實(shí)驗(yàn)用魚

齊口裂腹魚（Schizothorax prenanti Tchang）為雅安天全縣齊口裂腹魚場(chǎng)2012年孵化的同一批魚種。體質(zhì)量（75.47±5.12）g/尾，體長(zhǎng)（16.09±0.73）cm。選擇體質(zhì)健壯的魚種240尾，用20 mg/L的KMnO4消毒15 min。

1.3.2 飼料及分組

飼料配方參照 NRC（1993）[12]魚類營(yíng)養(yǎng)需要和段彪等[13]的齊口裂腹魚飼料配方設(shè)計(jì)基礎(chǔ)飼料配方，見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)飼料的組成及營(yíng)養(yǎng)水平Table1 Ingredients and nutrient levels of the experimental diets

在基礎(chǔ)飼料中分別添加0%（對(duì)照組）、3.5%、7%、14%、28% RS4型抗性淀粉（等量減少小麥淀粉用量），共5 個(gè)劑量組，每個(gè)劑量組4 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)12尾魚。各種飼料原料均過(guò)40 目篩，充分混合后加工成1mm的硬顆粒飼料，烘干并保存于冰箱中，破碎后投喂。

1.3.3 飼養(yǎng)管理

實(shí)驗(yàn)魚飼養(yǎng)于20 個(gè)玻璃缸中（2.0 m×1.5 m× 1.2 m），水深0.6 m。用基礎(chǔ)飼料馴化14d，待魚攝食正常后開始實(shí)驗(yàn)，日投喂3 次，投餌率為體質(zhì)量2%～2.5%，并根據(jù)水溫、攝食情況進(jìn)行調(diào)整，各組保持一致的投飼量。養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)期間水溫16～20 ℃，溶解氧＞5.0 mg/L、NH3-N＜0.3 mg/L，晝夜充氣。

1.4 方法

1.4.1 樣品采集

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，對(duì)實(shí)驗(yàn)魚饑餓24 h，尾靜脈采血，每尾魚的血樣分別放置在4 ℃靜置12 h后，4 ℃、3 000 r/min離心15 min，取其上清液（即血清），－80 ℃保存?zhèn)溆?。解剖后迅速取出肝臟及肌肉，放入液氮中，－80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

取齊口裂腹魚肝臟100 mg置于冰浴中，加入9 倍體積預(yù)冷的生理鹽水進(jìn)行組織勻漿。勻漿液在冰凍離心機(jī)于4 ℃、2 500 r/min離心10 min，取上清置于1.5 mL的離心管，－20 ℃存用于游離脂肪酸、肝脂酶和脂蛋白脂酶的測(cè)定。

1.4.2 指標(biāo)測(cè)定

LPL和HL活性測(cè)定采用銅試劑法。組織酶活性定 義：每毫克組織蛋白每小時(shí)在反應(yīng)系統(tǒng)中所產(chǎn)生的1 μmol FFA為1 個(gè)酶活性單位。酶活力單位用U/mg pro表示。

FFA含量采用銅試劑法測(cè)定，記錄440 nm波長(zhǎng)處的吸光度（A），與標(biāo)準(zhǔn)品相比計(jì)算FFA的含量，血清中單位用μmol/L表示，肝臟中單位用μmol/g pro表示。

組織蛋白濃度采用考馬斯亮藍(lán)法，單位用g pro/L表示。

1.4.3 引物設(shè)計(jì)與合成

用Primer Premier 5.0 軟件根據(jù)GenBank中齊口裂腹魚β-actin基因序列（JQ013000）、草魚PPARγ基因序列（Eu847421.1）、草魚PGC-1α基因序列（JN195739）設(shè)計(jì)特異性引物，引物序列見表2。

表2 引物序列及退火溫度Table2 Primer sequences and anneal temperatures

1.4.4 總RNA提取和cDNA制備

參照TRNzol總RNA提取試劑盒說(shuō)明書方法提取RNA，用10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳鑒定提取RNA的完整性，通過(guò)OD260nm/OD280nm檢測(cè)樣本純度。

cDNA由逆轉(zhuǎn)錄試劑盒法制備，放置于－20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.5 實(shí)時(shí)熒光定 量PCR基因檢測(cè)

使用熒光定量PCR儀器，采用SYBRGreen I熒光染料法，10 μL反應(yīng)體系，含5 μL SYBR?Premix Ex TaqTM（2×）、上下游引物各0.25 μL、1 μL cDNA、3.5 μL DEPC水。熒光定量PCR步驟：95 ℃、3 min；95 ℃、10 s，55.8 ℃（β-actin）、30 s，39 個(gè)循環(huán)；95℃、10 s；擴(kuò)增完畢后，迅速降溫到65 ℃進(jìn)行溶解曲線分析，然后以0.5 ℃/s的速率從65 ℃遞增到95 ℃，連續(xù)測(cè)定樣品熒光強(qiáng)度以獲取溶解曲線。

1.4.6 相對(duì)表達(dá)量的分析

以β-actin基因作為內(nèi)參基因，選擇一校 準(zhǔn)樣本，比較待測(cè)樣本相對(duì)校準(zhǔn)樣本的表達(dá)差異，利用2－△△Ct法進(jìn)行相對(duì)定量分析，其中Ct值也稱循環(huán)閾值，是指樣品管的熒光信號(hào)達(dá)到某一固定閾值的PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)。

結(jié)果是通過(guò)參照基因表達(dá)水平校正的待測(cè)樣本中的目標(biāo)基因相對(duì)于校準(zhǔn)樣本的相對(duì)表達(dá)量，用參照基因校準(zhǔn)目標(biāo)基因表達(dá)來(lái)彌補(bǔ)樣本組織量的差異。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用 SPSS16.0進(jìn)行分析，本實(shí)驗(yàn)圖表中所有數(shù)據(jù)均以±s表示，經(jīng)方差分析之后，采用Duncan’s多重比較法分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異顯著性，差異顯著水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 RS4型抗性淀粉對(duì)齊口裂腹魚肝臟中脂酶活性的影響

圖1 RS4型抗性淀粉對(duì)齊口裂腹魚肝臟中脂酶活性的影響±s，n=12）Fig.1 Effect of RS4 type resistant starch on the activities of LPL and HL in liver (x±s，n=12)

由圖1可知，餌料中添加RS4型抗性淀粉量為7%以上時(shí)能顯著提高齊口裂腹魚肝臟中脂蛋白脂酶和肝脂酶活性（P＜0.05），添加量為3.5%對(duì)肝臟中脂酶活性沒(méi)有顯著影響（P＞0.05）。

2.2 RS4型抗性淀粉對(duì)齊口裂腹魚肝臟及血清中游離脂肪酸含量的影響

由圖2可知，餌料中添加RS4型抗性淀粉劑量為3.5%時(shí)對(duì)齊口裂腹魚肝臟和血清中游離脂肪酸含量沒(méi)有顯著影響（P＞0.05）；添加劑量7%以上時(shí)與基礎(chǔ)對(duì)照組相比能夠顯著提高血清中游離脂肪酸含量（P＜0.05）；7% RS4、28% RS4組能夠顯著提高肝臟中游離脂肪酸含量（P＜0.05），但是14% RS4組對(duì)肝臟中游離脂肪酸沒(méi)有顯著影響（P＞0.05），有可能是實(shí)驗(yàn)時(shí)操作誤差造成的。

圖2 RS4型抗性淀粉對(duì)齊口裂腹魚肝臟及血清中游離脂肪酸含量的影響?，n=12）Fig.2 Effect of RS4 type resistant starch on free fatty acid content (?，n=12)

2.3 RNA質(zhì)量檢測(cè)及引物檢測(cè)

圖3 齊口裂腹魚肝臟RNA的電泳圖譜Fig.3 Electrophoresis profile of total RNA from liver of Schizothorax prenanti Tchang

由圖3可知，RNAVzol提取齊口裂腹魚RNA并進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，遷移率從大到小依次是5S rRNA、18S rRNA、28S rRNA，其中28S條帶亮度大約為18S條帶的兩倍，5S條帶亮度較低、邊緣模糊，說(shuō)明總RNA樣品完整、降解較少、質(zhì)量良好。反轉(zhuǎn)錄后PCR方法對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，獲得一條單一且明亮的特異的擴(kuò)增條帶，與預(yù)期片段大小一致（圖4～6）。

圖4 齊口裂腹魚肝臟和肌肉β-aaccttiinn基因擴(kuò)增條帶圖譜Fig.4 RT-PCR results of β-actin gene from liver and muscle of Schizothorax prenanti Tchang

圖5 齊口裂腹魚肝臟和肌肉PPPPAARRγ基因擴(kuò)增條帶圖譜Fig.5 RT-PCR results of PPARγ gene from liver and muscle of Schizothorax prenanti Tchang

圖6 齊口裂腹魚肝臟和肌肉PGGCC--11α基因擴(kuò)增條帶圖譜Fig.6 RT-PCR results of PGC-1α gene from liver and muscle of Schizothorax prenanti Tchang

2.4 RS4型抗性淀粉對(duì)齊口裂腹魚肌肉和肝臟中PPARγ及PGC-1α mRNA表達(dá)水平的影響

圖7 肌肉中PPARγ mRNA 表達(dá)水平比較（x±s，n=12）Fig.7 PPARγ gene expression level in muscle (x±s，n=12)

由圖7可知，餌料中抗性淀粉添加量7%以上與對(duì)照組相比能顯著提高肌肉中PPARγ mRNA表達(dá)水平（P＜0.05）；添加量3.5%與對(duì)照組相比沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05）；添加量為14%與其他組相比均有顯著性差異（P＜0.05）。

圖8 肝臟中PPARγ mRNA 表達(dá)水平比較（x±s，n=12）Fig.8 PPARγ gene expression level in liver (x ±s，n=12)

由圖8可知，7% RS4、14% RS4與其他組相比能夠顯著提高肝臟中PPARγ mRNA表達(dá)水平（P＜0.05）；3.5% RS4、28% RS4組與對(duì)照組相比沒(méi)有顯著差異（P＞0.05）。

圖9 肌肉中PGC-1α mRNA 表達(dá)水平比較（x±s，n=12）Fig.9 PGC-1α gene expression level in muscle (x±s，n=12)

由圖9可知，7% RS4、14% RS4與基礎(chǔ)對(duì)照組相比能顯著提高肌肉中PGC-1α mRNA的表達(dá)量（P＜0.05）；3.5% RS4、28% RS4組與對(duì)照組相比沒(méi)有顯著差異（P＞0.05）；14% RS4與其他組比有顯著差異（P＜0.05）。

圖10 肝臟中PG C-1α mRNA 表達(dá)水平比較（x±s，n=12）Fig.10 PGC-1α gene expression level in liver (x±s，n=12)

由圖10可知，7% RS4、14% RS4組齊口裂腹魚肝臟中PGC-1α mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組相比沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05），但是數(shù)值上是升高的；3.5% RS4、28% RS4與對(duì)照組相比表達(dá)水平也沒(méi)有顯著差異（P＞0.05），但數(shù)值是降低的。

3 討 論

HL和LPL是魚類肝胰臟中參與脂肪降解的2種關(guān)鍵酶，合稱為TL。HL在肝細(xì)胞中合成，可作為配體促進(jìn)低密度脂蛋白和乳糜微粒殘粒進(jìn)入肝細(xì)胞，并直接參與高密度脂蛋白膽固醇的逆轉(zhuǎn)運(yùn)和高密度脂蛋白殘粒的分解[15]。LPL是一種糖蛋白，存在于多種細(xì)胞和組織中，能夠水解富含甘油三酯的脂蛋白，產(chǎn)生游離脂肪酸[16]。本研究結(jié)果表明齊口裂腹魚餌料中添加RS4型抗性淀粉劑量在7%以上時(shí)能夠顯著的增加魚肝臟的肝脂酶和脂蛋白脂酶活性，加速了甘油三酯的水解，因而血液中TG含量減少而血清和肝臟中游離脂肪酸含量增加。

過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferators activated receptors，PPARs）有α、β、γ 3種類型，PPARγ是PPARs 3種異構(gòu)體之一，具有多種生物效應(yīng)，對(duì)脂肪細(xì)胞分化、能量代謝、糖代謝、脂代謝、動(dòng)脈粥樣硬化形成、炎性反應(yīng)等起重要作用。PPARγ調(diào)控多種基因及脂代謝相關(guān)因子的表達(dá)，如脂酰輔酶A脫氫酶、過(guò)氧化物酶體雙功能酶、LPL、微粒體CYP4A、細(xì)胞色素P450、脂肪酸羥化酶、UCP家族等基因的表達(dá)及瘦素、脂聯(lián)素、腫瘤壞死因子A的分泌。RS4型抗性淀粉添加劑量為7%和14%時(shí)能夠顯著增加肝臟和肌肉中PPARγ mRNA的表達(dá)量。PPARγ能夠誘導(dǎo)肝細(xì)胞表達(dá)載脂蛋白、脂肪酸氧化酶系與脂蛋白脂酶等，從而促進(jìn)脂質(zhì)的氧化代謝，降低血脂濃度，與Liu Xiong[17]、Kim[18]等研究結(jié)果一致。

PGC-1最初由Puigserver[19]于1998年作為核激素受體過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）的轉(zhuǎn)錄輔激活因子在小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)。PGC-1一方面在能量代謝和適應(yīng)生熱作用中有重要的調(diào)節(jié)作用，另一方面作為轉(zhuǎn)錄協(xié)同刺激因子發(fā)揮了更多重要的作用。PGC-1被認(rèn)為在適應(yīng)性產(chǎn)熱、線粒體生成、脂肪酸的β氧化及肝糖異生等過(guò)程中有著重要作用[20]，RS4型抗性淀粉添加劑量為7%和14%時(shí)能夠顯著增加齊口裂腹魚肌肉和肝臟的PGC-1α mRNA表達(dá)量。PGC-1作為轉(zhuǎn)錄協(xié)同刺激因子，其通過(guò)與PPARγ、雌激素受體、糖皮質(zhì)激素受體、核呼吸因子（nuclear respiratory factor，NRF-1）等各種轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合，調(diào)節(jié)各種轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮生理功能。PPARγ和PGC-1α mRNA表達(dá)量增加，能夠調(diào)節(jié)脂類代謝靶基因的表達(dá)，正向調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞的分化。

RS4型抗性淀粉作為一種可溶性膳食纖維，在餌料中添加為7%和14%時(shí)能提高肝臟和肌肉中PPARγ和PGC-1α mRNA表達(dá)量，從而誘導(dǎo)脂肪代謝相關(guān)酶的表達(dá)，提高了脂肪代謝相關(guān)酶活性，血清和肝臟中游離脂肪酸增加。

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Effect of RS4-Type Resistant Starch on Lipid Metabolism-Related Enzymes and Gene Expression in Schizothorax prenanti Tchang

XIANG Shi-qiong, WU Ying-long*, FENG Jiao
(College of Food Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China)

Objective: To explore the effect of RS4-type resistant starch on the lipid metabolism-related enzymes and mRNA expression in Schizothorax prenanti Tchang. Methods: Schizothorax prenanti Tchang of approximately 75 g body weight were randomly divided into five groups. After 60 days of feeding, the activities of lipoprotei n lipase (LPL) and hepatic lipase (HL) and free fatty acid (FFA) content were determined by copper reagent method. The mRNA expression levels of PPARγ and PGC-1α in muscle and liver were determined by RT-PCR. Results: RS4-type resistant starch at a dos age of 7% or more could significantly improve the activities of liver LPL and HL in Schizothorax prenanti Tchang, increase free fatty acid content in the serum and liver (P ＜ 0.05); while, RS4-type resistant starch at a dosage of 3.5% had no effect on the activities of LPL and HL or free fatty acid content (P ＞ 0.05). In addition, the mRNA expression levels of muscle and liver PPARγ and PGC-1α in the groups administered with RS4-typ e resistant starch at dosages of 7% and 14% were significantly higher than those in the control group (P ＜ 0.05). Conclusion: Dietary supplementation of RS4-type resistant starch at an appropriate amount could increase the expression of lipid metabolism-related genes in muscle and liver, improve the activities of lipid metabolismrelated enzymes, and promote the breakdown of triglycerides in Schizothorax prenanti Tchang.

RS4-type resistant starch; Schizothorax prenanti Tchang; real-time PCR (RT-PCR); peroxisome proliferators activated receptors-γ (PPARγ); peroxisome proliferators activated receptor γ coactivator-1α (PGC-1α)

TS254.2

A

1002-6630（2014）11-0229-06

10.7506/spkx1002-6630-201411046

2013-09-22

四川省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2009NZ0077-007）；四川農(nóng)業(yè)大學(xué)“211”工程雙支計(jì)劃項(xiàng)目（2010）

向世瓊（1989—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)楣δ苄允称贰-mail：xiangshiqiong@163.com

*通信作者：鄔應(yīng)龍（1963—），男，教授，博士，研究方向?yàn)楣δ苄允称?。E-mail：wuyinglong99@163.com