核桃凝集素的提取及其性質(zhì)

冀愛(ài)青，韓紅艷，楊紅雁，吳國(guó)良

（1.晉中學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，山西 晉中 030600；2.晉中市氣象局，山西 晉中 030600；3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，河南 鄭州 450002）

核桃凝集素的提取及其性質(zhì)

冀愛(ài)青1，韓紅艷1，楊紅雁2，吳國(guó)良3

（1.晉中學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，山西 晉中 030600；2.晉中市氣象局，山西 晉中 030600；3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，河南 鄭州 450002）

以核桃仁為材料，對(duì)核桃凝集素的分離條件及其部分性質(zhì)進(jìn)行研究。結(jié)果表明：凝集活性值能準(zhǔn)確反映凝集素的血凝效果；核仁經(jīng)PBS緩沖液（pH 7.4）浸提24 h及質(zhì)量分?jǐn)?shù)70%硫酸銨分級(jí)沉淀，得到的核桃凝集素粗品能凝集人A、B、O、AB型血紅細(xì)胞，且無(wú)血型專(zhuān)一性，其凝集活性不能被常見(jiàn)的單糖和寡糖抑制，但可被糖的衍生物所抑制；凝集活性在30～50 ℃基本不變，有較廣泛的pH值作用范圍（5.0～8.0）；供試的5 個(gè)核桃品種中，薄殼香粗提液的凝集活性最強(qiáng)，凝集活性值達(dá)到0.478。

核桃；凝集素；活性；性質(zhì)

核桃（Juglans regia）營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，由此被國(guó)外譽(yù)為“大力士食品”、“益智果”，而在國(guó)內(nèi)又享有“萬(wàn)歲子”、“長(zhǎng)壽果”的美稱(chēng)。據(jù)《本草綱目》、《神農(nóng)本草經(jīng)》記載，核桃的藥用價(jià)值很高，中醫(yī)應(yīng)用廣泛，而現(xiàn)代營(yíng)養(yǎng)分析表明核桃堅(jiān)果內(nèi)核仁的成分主要是脂肪和蛋白質(zhì)，目前，國(guó)內(nèi)對(duì)其營(yíng)養(yǎng)的研究偏重于油脂方面，對(duì)蛋白資源的研究報(bào)道只限于一些核桃蛋白飲料[1-2]。植物凝集素是一類(lèi)能凝集細(xì)胞和沉淀糖蛋白的非免疫源性的非酶蛋白質(zhì)，在植物界廣泛存在，在種子、根、莖、葉、皮、果實(shí)等各種組織器官中均有發(fā)現(xiàn)[3]。植物凝集素具有凝集血細(xì)胞、誘使細(xì)胞或機(jī)體代謝發(fā)生改變、抗病毒、防御等多種生物學(xué)活性，因此在細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)及基因工程方面呈現(xiàn)出較好的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用前景[4]。植物凝集素存在于多種食品中，可與血細(xì)胞表面的抗原結(jié)合引起細(xì)胞破壞，影響免疫系統(tǒng)功能。如研究顯示麩質(zhì)面包含麥胚凝集素，長(zhǎng)期食用可致麩質(zhì)過(guò)敏；大豆凝集素如果食用過(guò)量，可致生長(zhǎng)緩慢，甚至引起中毒[5]。核桃作為四大干果之一，受到人們的青睞，但國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)核桃化學(xué)成分的研究只限于與人體醫(yī)療保健作用有關(guān)的生理活性物質(zhì)方面[6-9]，而核桃凝集素作為其另一類(lèi)生理活性物質(zhì)[10]的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以5 個(gè)核桃品種堅(jiān)果為材料，提取核桃凝集素粗提液（Juglans regia Lectin，JRL），并對(duì)其部分性質(zhì)進(jìn)行了研究，為今后核桃凝集素的研究和毒性評(píng)價(jià)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

薄殼香、綠波、遼核、晉香一號(hào)和清香5 個(gè)核桃品種均采自河南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院核桃園；人的A、B、O、AB型血樣采集于晉中市四處醫(yī)院化驗(yàn)科（采血管為淺藍(lán)色頭蓋的枸櫞酸鈉凝血試驗(yàn)管）；NaCl、KCl、(NH4)2SO4、NaOH均為分析純 西安維利化工公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DS-1型組織搗碎機(jī)、DZKW-4數(shù)顯恒溫循環(huán)水浴鍋上海喬躍電子有限公司；DL-6000B離心機(jī) 江蘇捷達(dá)離心機(jī)制造有限公司；FA1004型電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 核桃堅(jiān)果凝集素粗提液的制備

去除核桃的外殼，取出核仁用體積分?jǐn)?shù)75%酒精漂洗，蒸餾水沖洗3 次，搗碎、研磨并稱(chēng)質(zhì)量后放入錐形瓶，以1∶30（g/mL）的比例加入石油醚，在30 ℃條件下，用水浴振蕩器搖床脫脂5 h。將脫脂后的溶液抽濾，將濾渣放在培養(yǎng)皿中，在通風(fēng)櫥中晾干。晾干后，稱(chēng)取樣品1 g加入30 mL浸提溶液，攪拌后放入4 ℃冰箱浸提。浸提后，4 800 r/min轉(zhuǎn)速離心35 min，棄去沉淀。上清液中加入硫酸銨進(jìn)行梯度分級(jí)沉淀，4 ℃過(guò)夜，4 800 r/min轉(zhuǎn)速離心35 min，棄上清。沉淀溶于PBS溶液，4 000 r/min轉(zhuǎn)速離心20 min，取上清液在PBS溶液透析過(guò)夜，然后換成蒸餾水透析除鹽5～6 h，用0.1 mol/L的BaCl2溶液檢測(cè)直至無(wú)白色沉淀為止，離心去除不溶物，得到JRL。

1.3.2 體積分?jǐn)?shù)2%人血紅細(xì)胞懸浮液的制備

血樣帶回實(shí)驗(yàn)室用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9%生理鹽水反復(fù)洗滌4～6 次，每次1 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，棄上清，沉淀紅細(xì)胞用PBS溶液配成體積分?jǐn)?shù)2%的紅細(xì)胞懸浮液。

1.3.3 凝集實(shí)驗(yàn)

凝膠實(shí)驗(yàn)采用96 孔V型血凝板，先在每一孔中加入50 μL的浸提液，后在每排的第1孔加入凝集素粗提液50 μL，混勻后，取出50 μL加入第2孔，以此類(lèi)推，作自1∶2起至1∶2n為止的倍比稀釋。同時(shí)設(shè)浸提液PBS溶液為對(duì)照，每種樣品設(shè)一個(gè)重復(fù)。輕輕混勻，加入50 μL體積分?jǐn)?shù)2%的人血紅細(xì)胞懸浮液，靜置30 min，觀察記錄凝集結(jié)果。如無(wú)凝集時(shí)，紅細(xì)胞沉于底形成一個(gè)光滑的小圓點(diǎn)；如發(fā)生凝集時(shí)，紅細(xì)胞呈網(wǎng)絡(luò)狀擴(kuò)散。凝集效價(jià)以2n（n為使血紅細(xì)胞凝集的最末孔數(shù)，也就是血紅細(xì)胞產(chǎn)生凝集現(xiàn)象的最大稀釋倍數(shù)）表示。本實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)時(shí)為計(jì)算方便，對(duì)凝集效價(jià)進(jìn)行量化，其加權(quán)平均數(shù)作為量化的凝集活性（agglutinating activity，Aa）[11]。

式中：A為待測(cè)液凝集反應(yīng)賦值；Wi為凝集活性權(quán)重，Wi= 2－i；n為倍比稀釋次數(shù)。

凝集效價(jià)賦值見(jiàn)表1。

表1 凝集效價(jià)賦值Table1 Value assignment for agglutinating titers

1.3.4 JRL提取最佳條件的優(yōu)化

參照其他植物果實(shí)凝集素的提取方案[12-15]，確定了影響JRL提取的3 個(gè)主要因素：浸提時(shí)間、浸提溶液種類(lèi)和硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)。以薄殼香品種粗提液對(duì)人血紅細(xì)胞A型的凝集活性為指標(biāo)，設(shè)計(jì)三因素三水平的L9（34）正交試驗(yàn)，篩選出JRL提取的最優(yōu)條件，因素水平見(jiàn)表2。

表2 正交試驗(yàn)因素水平表Table2 Coded levels for independent variables used in orthogonal array design factors and levels of orthogonal tests

1.3.5 JRL性質(zhì)的測(cè)定

1.3.5.1 熱穩(wěn)定性

在小型離心管中加50 μL JRL與等量PBS緩沖液（pH 7.4）后，分別在30～90 ℃（梯度為10 ℃）恒溫水浴中保溫10 min，取出冷卻至室溫，在V型血凝板上進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)皿w積分?jǐn)?shù)2%的B型人血紅細(xì)胞檢測(cè)其血凝活性。

1.3.5.2 pH值穩(wěn)定性

在小型離心管中加50 μL JRL，分別用緩沖液將其pH值調(diào)到3.5、5.0、6.5、7.8、8.0、9.2和10.5，放置2 h，加入等量體積分?jǐn)?shù)2%的B型血細(xì)胞懸浮液，測(cè)定血凝活性。

1.3.5.3 糖專(zhuān)一性

在小型離心管中加50 μL JRL和50 μL PBS（pH 7.4）混勻，倍比稀釋后，分別加入0.05 mol/L D-甘露糖、D-（＋）巖藻糖、N-乙酰-D-葡萄糖胺、N-乙酰-D-半乳糖胺、唾液酸、麥芽糖6 種糖溶液，放置10 min，再加入等量體積分?jǐn)?shù)2%的B型血細(xì)胞懸液，測(cè)定核桃凝集素粗提液的糖結(jié)合專(zhuān)一性。

1.3.6 不同品種JRL活性測(cè)定

將綠波、薄殼香、遼核、晉香一號(hào)和清香5個(gè)核桃品種堅(jiān)果按照優(yōu)化的凝集素提取方法得到JRL，分別對(duì)人的A、B、O、AB型抗凝血進(jìn)行凝血效果檢測(cè)。

表3 JRL提取的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table3 Orthogonal array design with results for extraction of walnut kernel lectin tests for the optimization of extraction of JRL

2 結(jié)果與分析

2.1 JRL提取正交試驗(yàn)優(yōu)化

薄殼香凝集素粗提液對(duì)人A型抗凝血的凝集效果見(jiàn)表3。浸提液對(duì)照組呈陰性，而正交試驗(yàn)的9 個(gè)處理凝集素粗提液的凝集效價(jià)均在24以上，其中處理2、4、5和9凝集效價(jià)達(dá)到29；處理5、7、8凝集效價(jià)分別達(dá)到24、27、28，而處理1和3凝集效價(jià)達(dá)到26。以Aa值為指標(biāo)，處理2最高（Aa=0.487），處理5最低（Aa=0.188）。比較二指標(biāo)得出，Aa值能準(zhǔn)確反映不同凝集素提取液的血凝效果。

正交試驗(yàn)結(jié)果顯示JRL提取的最優(yōu)水平組合為處理2（A2B2C2），即PBS緩沖液（pH 7.4）浸提24 h、質(zhì)量分?jǐn)?shù)70%硫酸銨分級(jí)沉淀提取的核桃凝集素Aa值最高，可達(dá)0.48 7；極差分析結(jié)果得知，浸提時(shí)間（A）、浸提溶液種類(lèi)（B）和硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)（C）對(duì)提取的凝集素的Aa值均有不同程度的影響，其順序?yàn)锽＞C＞A。表4方差分析可知，因素B、C對(duì)核桃凝集素的凝集活性影響達(dá)到顯著水平，因素A的影響不顯著。

表4 方差分析表Table4 Variance analysiis

2.2 JRL性質(zhì)

2.2.1 熱穩(wěn)定性

核桃凝集素粗提液在不同溫度條件下的凝集反應(yīng)實(shí)驗(yàn)表明，核桃凝集素具有一定的熱穩(wěn)定性（表5）， 血凝活性在50 ℃以下基本穩(wěn)定，50～90 ℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，凝 集效價(jià)逐漸下降，90 ℃時(shí)完全喪失活性。

表5 溫度對(duì)凝集活性的影響Table5 Effect of temperature on hemagglutination activity of walnut kernel lectin

2.2.2 pH值穩(wěn)定性

核桃凝集素粗提液的pH值穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6。核桃凝集素的凝集活性對(duì)pH值的變化不敏感，在pH 5.0～8.0的緩沖范圍內(nèi)，pH值的改變基本不影響JRL的凝集效價(jià)。因此JRL具有一定的酸堿穩(wěn)定性，凝集反應(yīng)對(duì)酸堿條件的要求不高。

表6 酸堿度對(duì)凝集活性的影響Table6 Effect of pH on hemagglutination activity of walnut kernel lectin

2.2.3 糖專(zhuān)一性

核桃凝集素粗提液對(duì)所供試的6 種糖中，可與N-乙酰-D-葡萄糖胺和N-乙酰-D-半乳糖胺專(zhuān)一性結(jié)合，結(jié)果如表7所示，表明JRL可以識(shí)別一些乙?；奶擎?，而對(duì)其他4種單糖和寡糖不敏感，即JRL對(duì)糖的衍生物有明顯的抑制作用，而其他單糖和寡糖對(duì)JRL的凝集活性影響不大。

表7 糖對(duì)凝集活性的抑制作用Table7 Inhibitory effect of saccharides on hemagglutinatiion activity of walnut kernel lectin

2.3 不同核桃品種凝集素的血凝活性測(cè)定

如表8所示，綠波、薄殼香、遼核、晉香一號(hào)和清香5 個(gè)早實(shí)核桃品種均能凝集人血紅細(xì)胞，但其凝集 活性略顯差異。通過(guò) 比較可以看出，薄殼香對(duì)人血細(xì)胞的凝集活性最高（0.478），晉扁1號(hào)最低（0.312），其中綠波對(duì)AB型血的凝集活性達(dá)到0.543，而晉扁1號(hào)對(duì)A和B型血的凝集活性?xún)H為0.150。此外，不同類(lèi)型的人血紅細(xì)胞對(duì)核桃凝集素的敏感程度不同，其中AB型血紅細(xì)胞最敏感，5 個(gè)品種的凝集活性平均可達(dá)0.497，而A型血紅細(xì)胞的敏感程度最低，平均值為0.329。

表8 JRL對(duì)人血紅細(xì)胞的凝集活性Table8 Agglutination activity of walnut kernel lectin towards human red blood cells

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)在探究提取核桃凝集素粗提液工藝基礎(chǔ)上對(duì)其性質(zhì)進(jìn)行了研究，結(jié)果表明：核桃凝集素粗提液對(duì)人的A、B、O、AB型血細(xì)胞均有一定的凝集作用，說(shuō)明核桃堅(jiān)果中存在一定含量凝集素，而且品種間凝集活性存在差異，推測(cè)核桃凝集素對(duì)紅細(xì)胞的凝集作用具有品種專(zhuān)一性；JRL表現(xiàn)出較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，在30～50 ℃凝集活力基本不變，且具有廣泛的pH值作用范圍（5.0～8.0）；其凝集活性可被糖的衍生物如N-乙酰-D-葡萄糖胺和N-乙酰-D-半乳糖胺抑制，推測(cè)在JRL的亞基上有結(jié)合這類(lèi)糖衍生物的受體，以此來(lái)抑制依賴(lài)糖衍生物增殖的病原菌的生長(zhǎng)。

關(guān)于核桃堅(jiān)果中凝集素的分離及相關(guān)性質(zhì)的研究未見(jiàn)報(bào)道。JRL為抗?fàn)I養(yǎng)因子，可根據(jù)它的理化性質(zhì)使其滅活，如溫度超過(guò)50 ℃的熱處理或強(qiáng)酸（pH＜5.0）強(qiáng)堿（pH＞8.0）處理使其活力喪失，也可用糖的衍生物來(lái)抑制JRL的活力，從而保證核桃制品的食用安全性。此外，核桃具有消炎殺菌、防癌抗癌的作用，可能與其凝集素的抗增殖和抗腫瘤功能有關(guān)，這對(duì)抗腫瘤藥物的開(kāi)發(fā)可能有潛在的意義，這與已報(bào)道[16-20]的一些植物凝集素有相似之處。目前，關(guān)于JRL的純化與性質(zhì)的進(jìn)一步研究正在進(jìn)行之中。

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Extraction and Characterization of Walnut (Juglans regia) Kernel Lectin

JI Ai-qing1, HAN Hong-yan1, YANG Hong-yan2, WU Guo-liang3
(1. Department of Biology Science and Technology, Jinzhong College, Jinzhong 030600, China; 2. Jinzhong City Meteorology Bureau, Jinzhong 030600, China; 3. College of Horticultural Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China)

The aim of this study was to investigate the extraction conditions and some characteristics of lectin from walnut (Juglans regia) kernel. The results indicated that the agglutinating activity (Aa) could accurately reflect blood agglutination efficiency. Crude lectin with strong hemagglutination activity was obtained from walnut kernel by extraction with phosphate buffer solution (PBS) at pH 7.4 for 24 h followed by fractional precipitation with 70% (NH4)2SO4. The lectin could agglutinate A, B, O and AB types of red blood cells without blood type specificity. The hemagglutination activity could be inhibited by saccharide derivatives, but not by monose or oligose. The lectin from walnut kernel was temperature-insensitive, and showed a broad reaction pH range (5.0-8.0). The hemagglutination activity of walnut kernel lectin from Baokexiang cultivar was the strongest among five tested walnut cultivars, which showed an Aa of 0.478.

walnut (Juglans regia); lectin; activity; characterization

Q942.6

A

1002-6630（2014）20-0022-04

10.7506/spkx1002-6630-201420005

2014-02-17

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31171943）；山西省特色專(zhuān)業(yè)建設(shè)項(xiàng)目（晉教材（2012）151號(hào)）

冀愛(ài)青（1976—），女，講師，博士研究生，主要從事果樹(shù)種質(zhì)資源及栽培生理研究。E-mail：aiqingji2003@163.com