低溫花生粕蛋白制備及其飲料穩(wěn)定性分析

王 瑩，王瑛瑤，劉建學(xué)，方 冰，李菊芳

（1.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471023；2.國家糧食局科學(xué)研究院，北京 100037）

低溫花生粕蛋白制備及其飲料穩(wěn)定性分析

王 瑩1,2，王瑛瑤2,*，劉建學(xué)1，方 冰2，李菊芳2

（1.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471023；2.國家糧食局科學(xué)研究院，北京 100037）

以低溫花生粕為原料，利用堿溶酸沉法提取花生分離蛋白，繼而制備花生蛋白飲料，考察自制花生蛋白飲料的穩(wěn)定性，并研究其氮溶指數(shù)、乳化活性及乳化穩(wěn)定性等功能特性。結(jié)果表明，最佳工藝條件為pH 9.5、堿提溫度55 ℃、料液比1∶11（g/mL）、提取時(shí)間2.5 h，此條件下花生分離蛋白提取率可達(dá)90.25%。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析顯示，其中包含花生蛋白所有特征條帶?；ㄉ鞍罪嬃系钠骄剑―[4,3]）為4.31 μm，穩(wěn)定性分析儀測出粒子動(dòng)態(tài)變化斜率（Slope）值為26.66%/h。低溫花生粕制備的花生蛋白飲料具有良好的穩(wěn)定性，這為花生粕高值化利用提供了新方向。

低溫花生粕；花生分離蛋白；花生蛋白飲料；粒徑；穩(wěn)定性

花生蛋白被公認(rèn)為是繼大豆蛋白之后，又一優(yōu)質(zhì)的食用蛋白資源。低溫花生粕是花生冷榨提油后的副產(chǎn)物，蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)48%以上[1]。與傳統(tǒng)熱榨工藝不同，冷榨工藝制備的花生餅粕中蛋白質(zhì)變性程度小，產(chǎn)品后續(xù)應(yīng)用空間更大[2-4]。尤其是經(jīng)過適度改性后的花生蛋白，其溶解性、持水性、乳化性及乳化穩(wěn)定性等功能特性表現(xiàn)良好，具有非常優(yōu)良的食品加工特性[5-8]。

食品應(yīng)用體系中，加強(qiáng)花生蛋白在飲料中的應(yīng)用研究，一方面可以發(fā)揮花生蛋白獨(dú)特風(fēng)味、抗?fàn)I養(yǎng)因子含量低等特點(diǎn)。另一方面可以增加飲料體系的蛋白質(zhì)含量提高飲料附加值。但傳統(tǒng)的花生蛋白飲料大多采用花生仁直接打漿、調(diào)配添加劑等工藝制成，生產(chǎn)成本較高，且飲品中脂肪含量高影響產(chǎn)品的營養(yǎng)價(jià)值和口感[9-12]。順應(yīng)發(fā)展的需要與迫切性，一些以花生蛋白為原料制備富含蛋白質(zhì)的飲料的相關(guān)研究已經(jīng)出現(xiàn)，但是數(shù)量和研究深度有限，且存在制備的花生蛋白加工特性不理想、飲料體系穩(wěn)定性有待提高等問題。

本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了從低溫花生粕中提取花生分離蛋白的工藝參數(shù)，并通過比較考察了自制花生蛋白的功能特性，研究了以提取到的分離蛋白為原料制備的花生蛋白飲料的顆粒粒徑分布變化和穩(wěn)定性變化，探討以低溫花生粕為原料制備的花生分離蛋白在飲料體系中應(yīng)用的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

電泳試劑 美國Sigma和美國Amresco公司；其他試劑均為分析純 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Rapid N CUBE型全自動(dòng)快速定氮儀 德國元素分析系統(tǒng)公司；PowerPac HC型電泳儀 美國Bio-Bad公司；JM-LB60型膠體磨 溫州市七星乳品設(shè)備廠；SRH60-70型均質(zhì)機(jī) 上海申鹿均質(zhì)機(jī)有限公司；2000MU型激光粒度儀 英國Malvern公司；LUMiSizer型全功能穩(wěn)定性分析儀 德國LUM公司。

1.3 方法

1.3.1 花生分離蛋白的制備

低溫花生粕經(jīng)粉碎、過篩備用。利用堿溶酸沉法[13]提取花生分離蛋白。經(jīng)2次堿提和1次酸沉步驟獲得花生分離蛋白。蛋白提取工藝流程：

相對(duì)于蛋白提取全過程來說，第1次堿提步驟對(duì)蛋白提取率的貢獻(xiàn)最大，所以針對(duì)這一步驟進(jìn)行工藝優(yōu)化，以花生分離蛋白的提取率為考察指標(biāo)。影響提取率的因素主要有堿提溫度、pH值、料液比、提取時(shí)間，在每個(gè)因素下分別取5 個(gè)梯度進(jìn)行測定（表1）。在單因素試驗(yàn)確定的范圍內(nèi)，用L9（34）正交試驗(yàn)表對(duì)第1次堿提工藝進(jìn)行優(yōu)化，考察各因素對(duì)蛋白提取率的影響。花生粕、渣及分離蛋白干燥后稱質(zhì)量，并用全自動(dòng)快速定氮儀測定蛋白質(zhì)量。蛋白提取率計(jì)算如式（1）所示：

表1 低溫花生粕提取分離蛋白的因素水平Table1 Coded levels for variables affecting extraction of peanut meal protein

1.3.2 蛋白功能特性的測定

氮溶指數(shù)（nitrogen solubility index，NSI）的測定參考Govindaraju等[14]的方法。

乳化活性（emulsifying activity index，EAI）與乳化穩(wěn)定性（emulsion stability index，ESI）的測定參考Wu等[15]的方法。

式中：T=2.303（公式常數(shù)）；C為單位體積中蛋白質(zhì)量濃度/（g/mL）；φ為乳狀液中油的體積分?jǐn)?shù)/%；L為比色皿光徑（1 cm）；Δt=10 min；Δ A=A0－A10。

1.3.3 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）

配制濃縮膠和分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為5%和12%。樣品配制成適當(dāng)質(zhì)量濃度并經(jīng)SDS處理，100 ℃煮沸5 min后，取20 μL點(diǎn)樣。電壓設(shè)定前30 min為80 V，后改為120 V至結(jié)束[16]。

1.3.4 功能性植物蛋白飲料的制備

將自制花生蛋白粉配制成一定質(zhì)量濃度蛋白溶液。按一定量加入其他設(shè)定的組分（包括乳化劑、穩(wěn)定劑、抗氧化劑等），并依據(jù)植物蛋白飲料功能和消費(fèi)人群定位，添加功能性組分。經(jīng)過高速剪切、膠體磨、高壓均質(zhì)（35 MPa、90 s）、高溫滅菌（121 ℃、15 min）、無菌灌裝后得到花生蛋白飲料。

1.3.5 粒徑分析

用激光粒度分析儀測定蛋白飲料粒徑分布。室溫條件下，以水為分散介質(zhì)，將被測樣品（懸浮狀溶液）加入到分散介質(zhì)中進(jìn)行測定。粒徑大小用體積平均粒徑D[4,3]表示[17-18]。

1.3.6 穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

利用全功能穩(wěn)定性分析儀LUmisizer對(duì)花生蛋白飲料的穩(wěn)定性進(jìn)行分析[19]。儀器采用Stocks理論及離心原理來分析飲料的沉淀及懸浮狀態(tài)。將裝有樣品的專用測試杯放入檢測槽，設(shè)定運(yùn)行條件：溫度25 ℃、離心轉(zhuǎn)速3 500 r/min、光散射系數(shù)1.00、掃描頻率10 s/次、掃描次數(shù)200 次。通過SEPView 5.1軟件對(duì)每個(gè)樣品產(chǎn)生的光信號(hào)進(jìn)行分析，計(jì)算得到斜率（Slope）值，用此值表征體系的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 花生分離蛋白制備工藝的優(yōu)化及性質(zhì)分析

由單因素試驗(yàn)得出的各因素較優(yōu)結(jié)果如圖1所示，在此基礎(chǔ)上為了獲得最佳工藝參數(shù)，以分離蛋白的提取率為指標(biāo)，對(duì)影響花生分離蛋白提取率最重要的4 個(gè)因素設(shè)計(jì)四因素三水平正交試驗(yàn)。

圖1 單因素試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Experimental results from the single factor design

表2 低溫花生粕提取分離蛋白正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table2 Orthogonal array design and results for extraction of peanut meal protein

正交試驗(yàn)結(jié)果如表2所示，4 個(gè)因素的極差大小順序?yàn)椋篈＞C＞B＞D，其中pH值對(duì)提取率的影響最大，而提取時(shí)間影響最小。根據(jù)表2 的結(jié)果確定花生分離蛋白的提取最佳工藝條件為A3C3B3D3，即在pH 9.5、堿提溫度55 ℃、料液比1∶11、提取時(shí)間2.5 h條件下花生分離蛋白的提取率最高。對(duì)該工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證，得到的花生分離蛋白的提取率可達(dá)90.25%，與正交試驗(yàn)結(jié)果相當(dāng)，證明所得優(yōu)化結(jié)果是可靠的。

為了進(jìn)一步明確最佳工藝條件對(duì)制備出的花生分離蛋白組分的影響，將自制的花生分離蛋白（laboratory peanut protein isolate，LPPI）與市售花生分離蛋白（market peanut protein isolate，MPPI）進(jìn)行SDS-PAGE分析。由圖2可知，LPPI具有伴花生球蛋白Ⅰ（61 kD）、花生球蛋白（19.7～47.5 kD）、伴花生球蛋白Ⅱ（14.3～18 kD）等所有特征條帶，說明本研究工藝條件不會(huì)對(duì)花生分離蛋白的組分產(chǎn)生影響，花生分離蛋白在制備過程中各亞基組分未發(fā)生損失。在等質(zhì)量濃度上樣的條件下，與MPPI相比，LPPI的各條帶顏色較深，表明LPPI各條帶所對(duì)應(yīng)的亞基含量較MPPI高，這可能是由于實(shí)驗(yàn)室制備得到的LPPI純度較高。

圖2 花生分離蛋白SDS-PAGE圖譜Fig.2 SDS-PAGE of peanut protein isolate

在確定最佳提取工藝的基礎(chǔ)上，針對(duì)花生分離蛋白在飲料加工領(lǐng)域的實(shí)際應(yīng)用，對(duì)自制花生分離蛋白的部分功能特性進(jìn)行研究分析。選取LPPI、MPPI及市售大豆分離蛋白（market soy protein isolate，MSPI），比較分析了3 種分離蛋白的NSI、EAI、ESI。

表3 花生分離蛋白的功能特性Table3 Functional properties of peanut protein isolate

如表3所示，LPPI的NSI要高于MPPI和MSPI，說明LPPI在水中的溶解能力較好，更適合應(yīng)用于以水相為溶劑的蛋白飲料體系中。這可能因?yàn)榈蜏鼗ㄉ伤崛』ㄉ蛛x蛋白變性程度低且具有良好的溶解性。

本研究中制備的花生蛋白飲料是一個(gè)包括油水兩相的復(fù)雜體系，因此蛋白質(zhì)的乳化性能也是影響蛋白飲料穩(wěn)定性的一個(gè)重要因素。蛋白質(zhì)本身具有兩親性，其乳化活性及乳化穩(wěn)定性的大小直接影響到溶液的穩(wěn)定狀態(tài)。由表3可以看出，MSPI具有最高乳化活性，MPPI和LPPI略低。根據(jù)Wu等[15]的方法可知單位蛋白溶液可以乳化的油越多乳化活性越高，因此LPPI單位蛋白能乳化的油相對(duì)較少，適合低脂體系的應(yīng)用。但是，LPPI具有較高乳化穩(wěn)定性，根據(jù)這些功能特性指標(biāo)可以看出LPPI是合適的飲料制備原料。

2.2 自制花生蛋白飲料的穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

植物蛋白飲料是由多種成分組成的營養(yǎng)型飲料，是一個(gè)含脂肪和蛋白的熱力學(xué)不穩(wěn)定體系。在飲料的制作和貯藏過程中容易出現(xiàn)脂肪上浮、蛋白質(zhì)變性、沉淀分層等不穩(wěn)定現(xiàn)象。所以蛋白飲料的穩(wěn)定性是評(píng)價(jià)飲料品質(zhì)的關(guān)鍵指標(biāo)，評(píng)價(jià)穩(wěn)定性的方法有很多，例如，靜置觀察、黏度檢測、離心觀察、顯微鏡觀察、粒徑分布、電泳、Zeta電位、光譜分析等等。應(yīng)根據(jù)不穩(wěn)定現(xiàn)象產(chǎn)生的原因選擇準(zhǔn)確、快速、直觀的方法評(píng)價(jià)蛋白飲料穩(wěn)定性。

2.2.1 SDS-PAGE凝膠電泳分析

對(duì)自制及市售的花生蛋白飲料進(jìn)行SDS-PAGE分析，測定各飲料的蛋白含量，以相同的蛋白質(zhì)量濃度上樣。如圖3所示，飲料中蛋白（c、d道）與自制花生分離蛋白（a道）相比，伴花生球蛋白Ⅰ條帶顏色變淺幾乎消失；花生球蛋白的不同亞基含量發(fā)生顯著變化，存在條帶變淺、模糊等現(xiàn)象；伴花生球蛋白Ⅱ條帶模糊。這些現(xiàn)象可能是因?yàn)樵陲嬃现谱鬟^程中，機(jī)械力作用與高溫高壓滅菌使部分蛋白亞基變性或降解，從而使各組分質(zhì)量濃度發(fā)生變化。也有研究顯示[20]，花生球蛋白的耐熱性優(yōu)于伴花生球蛋白Ⅰ而不及伴花生球蛋白Ⅱ，這一結(jié)論與花生蛋白飲料中各花生蛋白亞基條帶變化程度基本一致。另外，市售飲料蛋白電泳圖譜中花生球蛋白和伴花生球蛋白Ⅱ的條帶明顯含量較低，可能是由于其加工工藝中包括酶解等環(huán)節(jié)，使得蛋白分子降解成分子質(zhì)量較小的肽而在此電泳條件下無法顯現(xiàn)。

圖3 花生蛋白飲料SDS-PAGE圖譜Fig.3 SDS-PAGE of peanut protein beverages

2.2.2 粒徑分析

植物蛋白飲料體系復(fù)雜，包含蛋白質(zhì)、脂肪、糖類等多種成分，幾種物質(zhì)之間相互作用共同維持體系穩(wěn)定性。粒徑分析是檢測飲料體系穩(wěn)定性的有效手段之一。對(duì)于植物蛋白飲料而言，溶液中的蛋白粒子粒徑越大越容易產(chǎn)生聚集分層現(xiàn)象，破壞體系的穩(wěn)定性。同時(shí)從營養(yǎng)價(jià)值方面考慮，蛋白粒子粒徑越小其相應(yīng)的蛋白質(zhì)吸收率越高[21]。

為了考察本研究中飲料的穩(wěn)定性，將新鮮制備的花生蛋白飲料與存放一個(gè)月后飲料中蛋白粒子粒徑大小進(jìn)行比較（圖4）。由圖4可知，新鮮制備花生蛋白飲料粒徑主要分布在1.12～3.83 μm，平均粒徑D[4,3]為4.31 μm。放置1 個(gè)月后，部分蛋白粒子微弱積聚，在9.75 μm左右產(chǎn)生一個(gè)小峰，平均粒徑D[4,3]變?yōu)?.57 μm。一個(gè)月前后的粒徑分布曲線變化差異較小，可以說明體系的穩(wěn)定性保持良好。市售飲料產(chǎn)品分別在0.638 μm和6.417 μm有2 個(gè)粒徑峰，D[4,3]為16.771 μm。常溫放置一個(gè)月后，小粒徑峰面積減小，向大粒徑峰發(fā)生位移，D[4,3]為20.148 μm。由此看出，兩種蛋白飲料各自在一個(gè)月內(nèi)的粒徑分布曲線差異性不大，表明兩種飲料體系都比較穩(wěn)定。

圖4 自制花生蛋白飲料與市售產(chǎn)品粒徑分析Fig.4 Particle size analysis of LPPI and MPPI

將自制與市售蛋白飲料之間的粒徑分布曲線進(jìn)行比較分析，可明顯看出自制蛋白飲料的粒徑偏小，大多集中在1～3 μm。而市售產(chǎn)品粒徑較大，主要分布在10 μm附近。這種現(xiàn)象產(chǎn)生的原因可能是原料及生產(chǎn)工藝不同，市售蛋白飲料以花生仁為原料直接打漿調(diào)配而成，具有天然的不易被破壞的蛋白-脂肪復(fù)合大顆粒；自制蛋白飲料是由提取出來的花生分離蛋白粉和添加劑調(diào)制而成，經(jīng)過機(jī)械處理后體系中的顆粒普遍均一且粒徑偏小。

2.2.3 穩(wěn)定性分析

圖5 花生蛋白飲料的穩(wěn)定性分析Fig.5 Stability analysis of peanut protein beverages

德國LUMi全功能穩(wěn)定性分析儀采用Stocks理論及朗伯-比爾定律來分析乳狀液的穩(wěn)定性。分層、沉降、絮凝、聚合或相分離等過程的信息數(shù)據(jù)都可以通過連續(xù)的剖面圖表征出來。儀器測量原理如圖5A所示，待測液體在離心的同時(shí)，儀器發(fā)射近紅外光對(duì)整個(gè)管體同步掃描，根據(jù)光的透過率得到被測液體在時(shí)間和空間上連續(xù)的分離透射（消光）輪廓圖（圖5B、C），可形象直觀地看出被測體系的穩(wěn)定性變化趨勢。另外還可以用傳輸總透過率對(duì)時(shí)間作圖得到的曲線Slope值（圖5D），表示一定時(shí)間內(nèi)光透過率的變化快慢，粒子動(dòng)態(tài)變化能快速反映體系穩(wěn)定性，Slope值越高，相轉(zhuǎn)變速率越快，穩(wěn)定性越差。反之，Slope值越低，穩(wěn)定性越好。

實(shí)驗(yàn)中采用相同檢測條件（同1.3.6節(jié)），以自制花生蛋白飲料和市售花生蛋白飲料為研究對(duì)象，進(jìn)行穩(wěn)定性的光學(xué)掃描分析，掃描圖譜見圖5B、C，圖中110～130 mm為離心管液面至底部掃描區(qū)域。從圖5不難看出，在設(shè)定掃描時(shí)間內(nèi)，自制花生蛋白飲料（圖5B）掃描全過程中標(biāo)準(zhǔn)透過率的變化幅度較低，而市售花生蛋白飲料（圖5C）掃描全過程中標(biāo)準(zhǔn)透過率的變化幅度較大。表明自制飲料在離心速率為3 500 r/min條件下穩(wěn)定性較好。另外，用飲料相轉(zhuǎn)變速率也可比較溶液體系的穩(wěn)定性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5D，Slope值大小為市售飲料（42.37%/h）＞自制飲料（26.66%/h）。綜上說明自制花生蛋白飲料具有良好的穩(wěn)定性。

3 結(jié) 論

在pH 9.5、堿提溫度55 ℃、料液比1∶11（g/mL）、提取時(shí)間2.5 h條件下花生分離蛋白的提取率最高達(dá)90.25%，其功能特性與市售蛋白相近。SDS-PAGE分析顯示，由低溫花生粕蛋白制備的飲料含有花生蛋白所有的特征條帶，并且蛋白亞基保留質(zhì)量濃度高于市售飲料產(chǎn)品。自制飲料粒徑偏小，同時(shí)穩(wěn)定性分析Slope值為26.66%/h，相對(duì)較低。因此，由低溫花生粕制備飲料產(chǎn)品具有良好穩(wěn)定性。

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Preparation of Peanut Protein Isolate from Low-Temperature Peanut Meal, a Byproduct from Cold-Pressed Peanut Oil Production and Its Stability in Beverage

WANG Ying1,2, WANG Ying-yao2,*, LIU Jian-xue1, FANG Bing2, LI Ju-fang2
(1. College of Food and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471023, China; 2. Academy of State Administration of Grain, Beijing 100037, China)

Alkaline extraction and subsequent acid precipitation were employed to produce peanut protein isolate from lowtemperature peanut meal as a byproduct from the production of cold-pressed peanut oil, and the preparation process was investigated. The results showed that when the extraction process was carried out at 55 ℃ for 2.5 h at an alkali pH of 9.5 with a solid-to-solvent ratio of 1:11 (g/mL), the maximum extraction yield of 90.25% was obtained. SDS-PAGE analysis indicated that electrophoretic bands of the peanut protein isolate were consistent with the typical bands of peanut proteins. Then, some functional properties including nitrogen solubility index (NSI), emulsifying activity and emulsion stability of this protein isolate were analyzed. Particle size analysis showed that the average particle size D[4,3] was 4.31 μm, and the slope for dynamic particle change, as ch ecked by a stability analyzer, was 26.66%/h. The beverage prepared from the peanut protein isolate had a significant stability. This study may provide a new direction for the value-added utilization of peanut meal protein.

cold-pressed peanut cake; peanut protein isolate; peanut protein drink; particle size; stability

TS201.1

A

1002-6630（2014）20-0026-05

10.7506/spkx1002-6630-201420006

2014-01-27

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）項(xiàng)目（2013AA102104）

王瑩（1987—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)橛土腺Y源綜合利用。E-mail：wangying0371@gmail.com

*通信作者：王瑛瑤（1978—），女，研究員，博士，研究方向?yàn)橛椭瘜W(xué)與增值加工技術(shù)。E-mail：wyy@chinagrain.org