谷氨酰胺促泥鰍生長機理的初步研究

■李 源 溫安祥 駱美琳

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，四川雅安625014；2.新鄉(xiāng)市林業(yè)局，河南新鄉(xiāng) 453000）

泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）隸屬于鯉形目，鰍科，泥鰍屬[1]，全國各地都有分布。泥鰍作為一種小型經(jīng)濟魚類，由于生活環(huán)境的特殊性，使之成為重要的科學(xué)研究對象。

谷氨酰胺（Glutamine，Gln）是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本氨基酸之一，對機體免疫及營養(yǎng)作用的研究主要集中在人畜禽方面，關(guān)于水生動物方面的研究只有零星報道，尤其是在泥鰍方面還未見報道。泥鰍是我國淡水特種經(jīng)濟動物之一，具有抗病力強、營養(yǎng)價值高、肉質(zhì)鮮美，并含有多種維生素是人們喜愛的水產(chǎn)佳品，遠(yuǎn)銷日本、韓國等地，是我國重要的出口水產(chǎn)品。泥鰍食性雜，各地均有分布，對水質(zhì)環(huán)境的好壞具有很好的標(biāo)志作用。目前由于泥鰍養(yǎng)殖的規(guī)?；?、集約化，養(yǎng)殖環(huán)境逐漸惡化，疾病發(fā)病率逐年增高。因此，泥鰍配合飼料中免疫增強劑的研發(fā)顯得極其重要。本試驗探討了飼料中添加不同水平的谷氨酰胺對泥鰍生長、非特異性免疫的影響，以期為進(jìn)一步開發(fā)泥鰍配合飼料提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與日糧組成

試驗魚為雅安魚種站2012年孵化的同一批健壯泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）魚種，用3%的NaCl消毒10 min，飼養(yǎng)于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與理學(xué)院動物學(xué)實驗室。用基礎(chǔ)飼料馴養(yǎng)10 d，備用?；A(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)成分見表1[2]。

1.2 試驗設(shè)計

選取360尾平均體重為（3.31±0.11）g的泥鰍隨機分為6組（A～F組），每組設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)20尾。飼養(yǎng)于規(guī)格為60 cm×45 cm×45 cm的魚缸中。在基礎(chǔ)日糧中添加濃度為0（A組)、0.2%(B組)、0.4%（C組）、0.8%（D組）、1.6%（E組）和3.2%（F組）的谷氨酰胺進(jìn)行飼喂。其中對照組為A組，添加組為B～F組。

1.3 飼養(yǎng)管理

每天按魚體重的3%投喂餌料，早8點、晚6點定時定量投喂；試驗期間水溫為23～27℃，pH值為7.2～7.4。每次投喂前觀察魚的活動，投喂1 h后觀察殘餌情況，試驗期間每天采用虹吸法換水一次并根據(jù)殘餌情況調(diào)節(jié)飼喂量，并記錄水溫、投喂量等；每周用2～3 g∕m3的五倍子[3]進(jìn)行疾病預(yù)防。飼養(yǎng)試驗80 d。

1.4 試驗樣品的采集

飼養(yǎng)試驗結(jié)束后，在最后一次采食12 h后，從每個重復(fù)中隨機撈取10尾作為測定樣本。稱取體重和測定體長后，在體表用酒精消毒后于無菌操作臺中解剖并迅速取出內(nèi)臟，分離脾臟、肝胰臟、腸道，稱重并測量腸長；腸道一部分保存于10%的甲醛溶液中，用于組織切片觀測；另一部分進(jìn)行組織勻漿的制備：濾紙吸干肝胰臟與腸道表面多余水分，并剪開泥鰍腸道去除內(nèi)容物，與預(yù)冷的0.85%NaCl按1∶9體積比于4℃條件下勻漿成10%組織勻漿液，3 000 r∕min冷凍離心10 min[4]，上清液即為酶液，用于消化酶的測定。體表黏液的制備采用自然分泌法：每個重復(fù)隨機取2尾魚，用蒸餾水沖洗泥鰍體表后，并用濾紙輕輕吸干殘余水分，用1 ml的注射器吸取1 ml的生理鹽水，緩慢均勻地滴在放置于培養(yǎng)皿內(nèi)蠕動的泥鰍體表，泥鰍受生理鹽水刺激，蠕動激烈并分泌黏液，計時1 min后收集培養(yǎng)皿內(nèi)黏液與生理鹽水的混合液。

1.5 測定指標(biāo)

1.5.1 生產(chǎn)性能和器官指標(biāo)測定

式中：Wt——終末體重(g)；

W0——初始體重(g)；

t——試驗持續(xù)天數(shù)(d)。

1.5.2 腸道酶活性

取腸道組織勻漿液分別測定蛋白質(zhì)含量，蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活力。蛋白酶活力測定采用福林-酚法，淀粉酶活力測定采用碘-淀粉比色法，脂肪酶活力測定采用聚乙烯醇橄欖油法。

1.5.3 腸道組織切片

將泥鰍腸道分為前、中、后腸，采用常規(guī)組織學(xué)切片方法分別對其切片觀測，計算絨毛高度及密度。絨毛密度為單位腸壁橫切面內(nèi)，絨毛中間部位寬度所占的橫截面的比例。

1.5.4 非特異性免疫指標(biāo)的測定

1.5.4.1 SOD活力

通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)，系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基（），后者氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈現(xiàn)為紫紅色，用可見光分光光度計測其吸光度。當(dāng)被測樣品中含SOD時，則對超氧陰離子自由基有專一性的抑制作用，從而使形成的亞硝酸鹽減少，比色時測定管的吸光度值低于對照管的吸光度值，通過公式計算可求出被測樣品中的SOD活力。具體參照南京建成SOD測試盒說明書。

1.5.4.2 溶菌酶活力

溶菌酶活力采用南京建成生物研究所溶菌酶測試盒進(jìn)行測定：在一定濃度的渾濁菌液中，溶菌酶能水解細(xì)菌胞壁上的肽聚糖，使細(xì)菌裂解造成菌液濃度降低，透光性增強，根據(jù)透光度的變化來推測溶菌酶的活力。具體方法參照測試盒說明進(jìn)行。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗結(jié)果用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，用SPSS20先對數(shù)據(jù)作方差齊性檢驗(ANOVA)，若處理間差異顯著，再進(jìn)行Duncan's法多重比較，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著，P＞0.05表示無顯著性差異。

2 試驗結(jié)果

2.1 谷氨酰胺對泥鰍生長性能的影響（見表2）

由表2可知，飼料中添加不同水平的谷氨酰胺，對于泥鰍的增重率、特定生長率和餌料系數(shù)均有影響；添加組（B～F組）增重率較對照組均有所升高，C～E組顯著高于對照組（P＜0.05），其中，E組最高，而C～E組之間差異不顯著（P＞0.05）；特定生長率C～E組較對照組顯著升高（P＜0.05），其中C～E組之間差異不顯著（P＞0.05），其他各組較對照組雖有所升高，但差異不顯著（P＞0.05）；添加組（B～F組）餌料系數(shù)較對照組均有所降低，C～E組顯著低于對照組（P＜0.05）。

表2 谷氨酰胺對泥鰍生長性能的影響

谷氨酰胺對泥鰍器官發(fā)育指數(shù)的影響見表3。谷氨酰胺對泥鰍腸體指數(shù)有影響，隨著添加量的增加，E、F組顯著低于D組(P＜0.05)，其余各組之間差異不顯著（P＞0.05），但B、C組較對照組有所增高，而E、F組較對照組略低；谷氨酰胺對肝胰臟有影響，C組顯著高于D組（P＜0.05），D組極顯著高于對照組(P＜0.01)；谷氨酰胺對腸長指數(shù)及脾臟指數(shù)影響不顯著(P＞0.05)。

表3 谷氨酰胺對泥鰍器官發(fā)育的影響(%)

2.2 谷氨酰胺對泥鰍消化道結(jié)構(gòu)的影響（見表4、表5及圖1）

由表4可知，谷氨酰胺對泥鰍前腸絨毛高度和絨毛密度均有影響。其中C～F組的前腸絨毛高度極顯著高于對照組(P＜0.01)，B組顯著高于對照組(P＜0.05)；前腸絨毛密度D～F組極顯著高于對照組(P＜0.01)，C組顯著高于對照組(P＜0.05)。

表4 谷氨酰胺對泥鰍前腸絨毛高度及密度的影響

表5 谷氨酰胺對泥鰍中腸絨毛高度及密度的影響

據(jù)表5，谷氨酰胺對泥鰍中腸絨毛高度也有影響，其中D～F組的中腸絨毛高度極顯著高于對照組(P＜0.01)，C組顯著高于對照組(P＜0.05)，B組與對照組之間差異不顯著(P＞0.05)；對中腸絨毛密度影響不顯著(P＞0.05)。

泥鰍后腸如圖1所示，由圖可見，泥鰍后腸腸壁較前腸與中腸薄，后腸絨毛極短且稀疏，緊貼腸壁，絨毛及腸壁周圍分布有大量紅細(xì)胞。

2.3 谷氨酰胺對泥鰍消化酶的影響（見表6）

圖1 泥鰍腸道切片圖

表6 谷氨酰胺對泥鰍腸道消化酶活力的影響

由表6可知，谷氨酰胺對泥鰍腸道消化酶有極顯著(P＜0.01)或顯著影響（P＜0.05）。B～E組脂肪酶活力較對照組都有所升高，其中B～D組極顯著高于對照組(P＜0.01)，E組顯著高于對照組（P＜0.05），F(xiàn)組活力較對照組有所下降；添加組（B～F組）的淀粉酶活力較對照組均極顯著升高(P＜0.01)，整體趨勢呈先升高后降低，其中D組數(shù)值最高，極顯著高于對照組(P＜0.01)；添加組（B～F組）蛋白酶活力較對照組均有所升高，其中E組最高，極顯著高于對照組(P＜0.01)，D組、F組顯著高于對照組(P＜0.05)；在腸道中，γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶隨添加量的增加而升高，F(xiàn)組極顯著高于對照組(P＜0.01)，并顯著高于其他添加組(P＜0.05），B～E組較對照組顯著升高(P＜0.05)。

2.4 谷氨酰胺對泥鰍體表SOD、體表溶菌酶活力的影響（見表7）

表7 谷氨酰胺對泥鰍體表黏液SOD和溶菌酶活力的影響

從總體上看，添加組體表黏液SOD隨添加量的增加而增加，C～F組顯著高于對照組，其中E～F組極顯著高于對照組（P＜0.01）；體表黏液溶菌酶活力C～E組極顯著高于對照組（P＜0.01），B、F組較對照組之間差異不顯著（P＞0.05），整體趨勢呈先升高后降低。

3 討論

3.1 不同谷氨酰胺水平與泥鰍的生長性能

本試驗結(jié)果表明，當(dāng)飼料中谷氨酰胺添加量從0.4%上升到1.6%時，泥鰍的增重率和特定生長率呈上升趨勢，且顯著高于對照組(P＜0.05)，餌料系數(shù)C～E組顯著低于對照組(P＜0.05)。說明泥鰍飼料中添加谷氨酰胺有明顯的促生長的作用。目前飼料中添加谷氨酰胺的研究主要集中在陸生動物及少數(shù)水生動物上，對泥鰍的影響還未見報道。戴四發(fā)等[5]在1～4周齡肉雞日糧中添加0.4%的谷氨酰胺，能夠提高肉雞的生產(chǎn)性能；蔣宗勇等[6]在4日齡新生仔豬中添加1.0%的谷氨酰胺，18 d后顯著提高仔豬日增重率；楊奇慧等[7]在1～4周齡雜交羅非魚中的試驗表明，谷氨酰胺添加量從0.2%上升到0.8%時，雜交羅非魚的增重率和SGR呈上升趨勢；林燕[8]在鯉魚飼料中添加谷氨酰胺，含量從0.0%提高到1.2%時，極顯著提高了幼健鯉的增重率。這些都說明在日糧中添加谷氨酰胺對動物生長性能有較好的提高，谷氨酰胺促進(jìn)動物生長的可能原因有以下幾方面：谷氨酰胺為細(xì)胞內(nèi)核苷酸的合成提供氮源[9]，促進(jìn)體內(nèi)DNA的合成；在組織細(xì)胞培養(yǎng)中，谷氨酰胺是必需添加的氨基酸[10]，谷氨酰胺的添加量與細(xì)胞增殖量在一定程度內(nèi)正相關(guān)；谷氨酰胺通過轉(zhuǎn)氨基作用調(diào)節(jié)體內(nèi)氨基酸的代謝，促進(jìn)肌肉蛋白質(zhì)的合成和轉(zhuǎn)運；Xin等[11]報道，谷氨酰胺可以明顯增加大鼠血漿胰島素生長因子Ⅰ水平，刺激動物生長，而胰島素生長因子Ⅰ是一類多功能細(xì)胞增殖調(diào)控因子，在細(xì)胞分化、增殖及個體發(fā)育中具有關(guān)鍵的促進(jìn)作用。

谷氨酰胺可影響機體器官發(fā)育，在魚腸上皮組織體外培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，谷氨酰胺可顯著促進(jìn)魚腸上皮細(xì)胞的增殖和分化[12]；黃冠慶[13]在肉仔雞日糧中添加谷氨酰胺發(fā)現(xiàn)，0.8%的濃度可顯著提高21日齡時的脾臟、肝臟和胰腺的重量；林燕[8]在鯉魚日糧中添加谷氨酰胺，可顯著提高鯉魚肝胰臟、腸道和脾臟的重量。本試驗中通過對泥鰍日糧中添加外源性谷氨酰胺，當(dāng)添加量為0.8%時，可顯著（P＜0.05）或極顯著（P＜0.01）提高泥鰍腸體指數(shù)和肝胰臟指數(shù)，但對泥鰍腸長指數(shù)影響不顯著，腸道長度的增強可以延長食物在腸道內(nèi)停留的時間，但由于泥鰍腸道的特殊性，作為泥鰍的呼吸輔助器官，泥鰍腸道與其他動物（如建鯉）腸道結(jié)構(gòu)差異較大，泥鰍腸道將食道和肛門連在一起形成一直管，腸長主要根據(jù)體長變化，因此谷氨酰胺對泥鰍腸長指數(shù)影響不大。肝胰臟和腸道為泥鰍體內(nèi)重要的免疫消化器官，因此其發(fā)育程度直接影響了泥鰍整體的生長狀況。

3.2 谷氨酰胺促進(jìn)泥鰍對營養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收

3.2.1 不同谷氨酰胺水平對泥鰍腸道結(jié)構(gòu)的影響

動物腸道是利用谷氨酰胺最多的器官，且谷氨酰胺是腸道主要能源物質(zhì)[14]。谷氨酰胺能顯著增加腸道蛋白質(zhì)的合成代謝[15]，促進(jìn)動物腸上皮分化增殖[16]。研究表明，外源性的谷氨酰胺可顯著促進(jìn)肉仔雞小腸發(fā)育，維持腸黏膜的完整性，以及提高小腸的主動吸收功能[17]；可促進(jìn)鯉魚腸道生長，提高絨毛高度[18]；可使鼠腸絨毛密度顯著高于對照組，細(xì)胞及微絨毛緊密排列的程度大于對照組[19]。絨毛高度是反映水生動物腸道生長發(fā)育和吸收能力的重要標(biāo)識[20]，腸道絨毛是由腸上皮和固有層向腸腔突起形成，其高度的增加大大增加了腸道內(nèi)部的吸收面積，而絨毛密度是對高度的一個補充。本試驗中泥鰍前腸與中腸絨毛高度及前腸絨毛密度隨著添加量的增加而升高，但對中腸絨毛密度影響不顯著（P＞0.05）。結(jié)合泥鰍腸呼吸的特點及腸道組織切片分析，可能是因為：泥鰍腸道后腸絨毛不明顯，且腸壁極薄，泥鰍腸道消化吸收部位主要位于前中腸[21]；而后腸的結(jié)構(gòu)特點對腸呼吸的氣體交換有很大的作用，是泥鰍腸呼吸的主要部位；中腸與后腸無明顯分界，因此中腸至后腸絨毛密度逐步趨于穩(wěn)定，一定程度上保證了氣體交換面積；泥鰍腸道整體絨毛高度的降低也利于氣體及糞便的通過，便于腸呼吸的正常進(jìn)行，因此分析泥鰍腸道絨毛的生長發(fā)育可能在腸道消化吸收作用與腸呼吸作用之間存在一個平衡點。

3.2.2 不同谷氨酰胺水平對泥鰍消化酶活力的影響

魚體利用營養(yǎng)物質(zhì)的能力依賴于消化酶，魚體內(nèi)消化酶主要分為蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶，不同種類魚體內(nèi)三種酶的活力是不同的，主要取決于魚類的食性以及生活習(xí)慣[22]。魚體內(nèi)部或外部條件改變使其消化酶活力發(fā)生變化，會直接影響魚對飼料中營養(yǎng)物質(zhì)的利用率，消化酶的變化可能跟飼料中添加物有關(guān)，當(dāng)食物組分發(fā)生變化時，在一定程度內(nèi)也會影響消化酶活力[23]。由于泥鰍是無胃魚，因此腸道是其主要的消化場所，消化酶活力的高低可直接反映其對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用。

研究表明，谷氨酰胺可顯著提高畜禽類及鯉魚[4，8，24-26]消化道消化酶活力。本試驗結(jié)果表明，日糧中添加谷氨酰胺，可提高泥鰍腸道內(nèi)消化酶活力。蛋白酶活力的高低會影響水生動物體內(nèi)蛋白質(zhì)的消化程度，進(jìn)而影響水生動物體內(nèi)蛋白質(zhì)沉積效率。γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶是參與γ-谷氨酰循環(huán)和氨基酸跨膜轉(zhuǎn)運的關(guān)鍵酶，具有轉(zhuǎn)肽等重要功能[27]。張軍民等[28]通過對不同日齡仔豬的體內(nèi)γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶含量的測定發(fā)現(xiàn)，在動物體內(nèi)，當(dāng)自身氨基酸合成不足時，需要通過外源攝取來補充自身蛋白質(zhì)含量，因此γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶含量會發(fā)生變化，即逐步升高，當(dāng)仔豬體內(nèi)氨基酸合成逐漸滿足日常需要時，γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶含量逐漸降低，因此γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶對外源氨基酸的吸收起關(guān)鍵作用。本試驗中通過添加谷氨酰胺顯著提高了泥鰍腸道γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶含量，因此對泥鰍腸道氨基酸和蛋白質(zhì)的吸收、吸收和跨膜轉(zhuǎn)運有顯著的促進(jìn)作用。

3.3 谷氨酰胺對泥鰍非特異性免疫的影響

溶菌酶（lysozyme，LYZ）是一類酶的總稱，又稱為胞壁質(zhì)酶、N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶、G蛋白，能水解細(xì)菌胞壁N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸之間的β-1，4糖苷酸位點的肽聚糖，引起細(xì)胞裂解。溶菌酶是體內(nèi)重要的非特異性免疫因子，具有與抗生素不同的抑菌機理，在殺死病原體時，不宜使其產(chǎn)生耐藥性，并且具有無毒、無殘留、活性穩(wěn)定、抗菌譜廣等優(yōu)點[29]。在水生動物體內(nèi)溶菌酶水平是非特異性免疫的重要指標(biāo)，廣泛存在于黏液、淋巴組織、血液等其他體液中。溶菌酶的活力與性別、年齡、季節(jié)、溫度、pH值、外源病毒感染程度等因素有關(guān)[30]。本試驗研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，泥鰍日糧中添加谷氨酰胺提高了泥鰍血漿和體表黏液溶菌酶活力，血漿溶菌酶B～D組活力呈上升趨勢，D組極顯著高于對照組（P＜0.01），從E組開始，溶菌酶活力逐漸降低，與對照組相比差異不顯著（P＞0.05）；黏液溶菌酶C～E組極顯著高于對照組（P＜0.01），但F組與對照組相比差異不顯著（P＞0.05）；陳昌福等[31]、劉勇等[32]發(fā)現(xiàn)，草魚、鯽魚等黏液溶菌酶活力較血漿中高，本試驗中也證明泥鰍黏液溶解酶活力比血漿溶菌酶活力高，這與前面學(xué)者研究結(jié)果一致，水生動物黏液可以說是第一道免疫防線。

魚類體表黏液中含有大量能夠抵抗外源病原體入侵的非特異性免疫因子，除溶菌酶外還含有可抑制病毒復(fù)制的干擾素、可作為調(diào)節(jié)細(xì)胞吞噬的C-反應(yīng)蛋白等[33]。黏液除具有免疫功能外，還可以防止異物和病原體的侵入；維持體內(nèi)滲透壓；減少運動摩擦力等功能[33]。梁明山等[34]在泥鰍黏液中發(fā)現(xiàn)SOD，本試驗進(jìn)一步證明泥鰍黏液中含有SOD，而且泥鰍黏液中SOD的含量與梁明山等[34]所測結(jié)果6.5 U∕ml具有一致性。本試驗表明，在泥鰍日糧中添加谷氨酰胺可以提高黏液SOD酶活力，并隨著添加量的增加，SOD活力逐步升高。

結(jié)合泥鰍生長性能、消化吸收能力以及非特異性免疫試驗結(jié)果及變化規(guī)律，本試驗表明，添加高劑量（1.6%～3.2%）谷氨酰胺對泥鰍生長出現(xiàn)一定程度抑制作用。水生動物對氨基酸需要量根據(jù)動物的種類、年齡、食性、發(fā)育階段、水溫、水質(zhì)、pH值以及飼料中蛋白含量的種類和飼喂方式不同而變化[35]；另外氨基酸在水生動物腸道內(nèi)的轉(zhuǎn)運機制較為復(fù)雜，一種氨基酸的轉(zhuǎn)運可能會兼有許多轉(zhuǎn)運機制，而魚體對游離氨基酸的吸收率相當(dāng)高，但是日糧中結(jié)合態(tài)的蛋白質(zhì)較游離氨基酸更能刺激魚體的生長[36]，因此推測谷氨酰胺添加量在一定范圍內(nèi)能顯著增加腸道蛋白質(zhì)[15]的合成代謝，促進(jìn)腸道發(fā)育，但隨著濃度的增高，添加的游離氨基酸先于飼料蛋白中分解氨基酸的吸收，同時還影響其他氨基酸吸收同步化，使氨基酸得不到平衡互補，進(jìn)而影響泥鰍生長發(fā)育。