張雅君，張 浩，楊 選，韓永斌

花生主要致敏物質(zhì)及其脫敏方法研究進(jìn)展

張雅君，張 浩，楊 選，韓永斌*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)部農(nóng)畜產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210095）

花生作為影響部分人群生活質(zhì)量的主要過敏食物之一，其中含有的過敏原會(huì)引起人體強(qiáng)烈的過敏反應(yīng)，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)?dǎo)致人的死亡?；ㄉ^敏反應(yīng)因其潛在的危險(xiǎn)性、長(zhǎng)期性以及不斷增加的發(fā)病率而日益受到各國(guó)的廣泛關(guān)注。研究花生致敏機(jī)理及脫敏方法已成為熱點(diǎn)，探索有效脫敏方法，對(duì)保證花生食品的安全性具有重要 的現(xiàn)實(shí)意義。本文對(duì)花生致敏機(jī)制，過敏原致敏組分分析和脫敏方法進(jìn)行闡述。

花生；過敏原；致敏機(jī)制；脫敏

食物中能使機(jī)體產(chǎn)生過敏反應(yīng)的抗原分子稱為食物過敏原，它們大多數(shù)為蛋白質(zhì)[1]。聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations，F(xiàn)AO）（1995年）報(bào)告了大豆、花生、牛奶、雞蛋、魚等8 類過敏食物，約占所有食物過敏原的90%以上[2-3]。花生是目前人類重要的植物蛋白質(zhì)來源之一，并可以作為多種食品的原輔料。隨著食品消費(fèi)和流通的全球化，花生的致敏已成為重要的食品安全問題而受到各國(guó)的廣泛關(guān)注。人類食用含有雞蛋和牛奶的食物引起的過敏表現(xiàn)在嬰兒期，通常在兒童學(xué)齡期消失?；ㄉ旅綦m然同其他食物致敏一樣屬于即時(shí)性過敏，但其致敏具有長(zhǎng)期性、普遍性，甚至威脅生命?；ㄉ^敏患者的這種疾患是終身的，患者對(duì)花生的過敏不會(huì)隨著年齡的增長(zhǎng)而消失[4-5]。調(diào)查發(fā)現(xiàn)有80%的患者對(duì)花生的過敏反應(yīng)持續(xù)到成年，這極大地影響了他們的生活質(zhì)量[6]。

花生過敏患者的臨床癥狀主要表現(xiàn)為輕微咽部刺痛、嘔吐，嚴(yán)重時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)危及生命的全身性過敏反應(yīng)。據(jù)報(bào)道[7]，攝入少量（約200 μg）或通過接吻傳遞極少量的花生過敏原都可能引起明顯的過敏反應(yīng)，甚至導(dǎo)致過敏性休克和死亡。美國(guó)報(bào)道的由食物過敏引起的死亡病例中有59%是由花生過敏引起的，列各類過敏致死之首[8]。在過去的幾十年里，花生過敏發(fā)病率在西方國(guó)家不斷增加。美國(guó)兒童花生過敏的患病率，1997年只有0.4%，2002年則增加了1 倍達(dá)到0.8%，2008年 為1.4%[9]。花生過敏發(fā)病率在中國(guó)亦逐漸凸顯，葉世泰等[10]在我國(guó)常用食品致喘40 例分析中指出花生等油料作物位居食物過敏原的前列，常用食物組抗原皮膚實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示豆類食物皮膚實(shí)驗(yàn)陽性例數(shù)大大增加，這可能是豆類與其他食物、特別是同科植物的交叉抗原性有關(guān)。根據(jù)對(duì)中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)北京協(xié)和醫(yī)院變態(tài)反應(yīng)科就診病人的調(diào)查，約有4%的病人對(duì)花生過敏，有的病人對(duì)7 種花生致敏組分過敏，大多數(shù)病人對(duì)花生中的2 種或2 種以上致敏組分過敏，而少數(shù)病人對(duì)其中的1 種致敏組分有反應(yīng)[11]。隨著食品的生產(chǎn)、流通和消費(fèi)的國(guó)際化，花生過敏將成為各國(guó)共同關(guān)注的問題。因此研究花生蛋白致敏的機(jī)理，探索有效的脫敏方法，對(duì)保證花生食品的安全性具有重要意義。本文對(duì)花生致敏機(jī)制，過敏原致敏組分分析及其脫敏方法進(jìn)行了闡述。

1 花生過敏反應(yīng)機(jī)理及其臨床癥狀

食品過敏反應(yīng)（food allergy）又稱食物變態(tài)反應(yīng)，是指食物進(jìn)入人體后，機(jī)體對(duì)其產(chǎn)生異常免疫應(yīng)答，導(dǎo)致機(jī)體生理功能紊亂或組織損傷，進(jìn)而引發(fā)一系列臨床癥狀，如皮炎、哮喘等的過程[12]。大多數(shù)食物的致敏是由食物過敏原與人體內(nèi)的免疫球蛋白E（IgE）相互識(shí)別引發(fā)的[13]。在過敏反應(yīng)中，來源于骨髓、臍帶血干細(xì)胞中的肥大細(xì)胞是核心細(xì)胞，是Ⅰ型過敏反應(yīng)中最重要的效應(yīng)細(xì)胞。對(duì)于哺乳類動(dòng)物而言，肥大細(xì)胞主要分布于機(jī)體與外界環(huán)境相通的地方，如皮膚、氣道和消化道，這些部位經(jīng)?？梢越佑|到病原體、過敏原以及環(huán)境中的其他物質(zhì)。它的胞質(zhì)內(nèi)富含嗜堿性顆粒，顆粒中含有5-羥色胺、組胺、白三烯和各種酶類[14-15]。

在過敏反應(yīng)中，攝入的過敏原首次進(jìn)入機(jī)體后，抗原會(huì)誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異性的抗體IgE、sIgE與肥大細(xì)胞表面的特異性受體FcεR相結(jié)合，從而使肥大細(xì)胞處于致敏狀態(tài)。當(dāng)機(jī)體再次接觸到抗原時(shí)，抗原與結(jié)合了IgE的肥大細(xì)胞再次相遇，肥大細(xì)胞表面的FcεR受體發(fā)生凝集反應(yīng)，激活肥大細(xì)胞內(nèi)部信號(hào)傳導(dǎo)，在短時(shí)間內(nèi)導(dǎo)致肥大細(xì)胞“脫顆?！?，釋放組胺、白三烯和肝素等介質(zhì)到組織液中，刺激附近的血管或神經(jīng)，引起平滑肌收縮、毛細(xì)血管擴(kuò)張等一些過敏反應(yīng)癥狀，造成皮膚、消化道和呼吸道，甚至全身性的過敏反應(yīng)[16]。其中肥大細(xì)胞的脫顆粒和活性的改變受細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度調(diào)節(jié)[17]。

花生過敏最常涉及的靶器官是消化道，幾乎100%的過敏病人都表現(xiàn)有口周皮膚和口咽黏膜的過敏反應(yīng)；另外其他主要的過敏靶器官是皮膚和呼吸系統(tǒng)。當(dāng)然，嚴(yán)重的花生過敏反應(yīng)是全身性的，可引起過敏性休克、甚至危及生命[18]。

2 花生中主要過敏蛋白組分

食物致敏原一般是具有酸性等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)或糖蛋白，分子質(zhì)量在10～70 kD[19]。自Lehere等[20]在1981年首次發(fā)現(xiàn)花生中第一個(gè)致敏蛋白至今，共有11 種能夠特異性與IgE結(jié)合的花生蛋白被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，分別命名為Ara h 1～Ara h 11（表1）?；ㄉ旅舻鞍讓儆诜N子貯藏蛋白，是含有多種高度糖基化的蛋白質(zhì)組分，它們主要屬于兩個(gè)球蛋白家族，即花生球蛋白和伴球蛋白。Meier等[21]利用免疫印跡法測(cè)定，分離鑒定出花生中3 個(gè)主要的致敏原，分子質(zhì)量分別為15、20、66 kD。北京協(xié)和醫(yī)院的李宏共檢測(cè)出8 條花生蛋白帶能特異性與IgE結(jié)合，其分子質(zhì)量分別為63、53、48.5、41.7、39、34.8、23.5、17.9 kD，并認(rèn)為分子質(zhì)量為48.5、41.17、23.5 kD的蛋白是引起我國(guó)易感人群對(duì)花生過敏的主要過敏蛋白[11]。

表1 11 種花生過敏原基本性質(zhì)Table 1 General properties of eleven peanut allergens

2.1 Ara h 1

Arah 1是分子質(zhì)量為63～63.5 kD的糖蛋白，為最重要的花生過敏原，占花生總蛋白含量的12%～16%，其蛋白和糖基部分均有與IgE結(jié)合位點(diǎn)[22]，是目前研究最多的花生過敏原之一。Ara h 1表現(xiàn)為高度結(jié)構(gòu)化二級(jí)結(jié)構(gòu)和一個(gè)復(fù)雜的同源三聚體并具有明確三級(jí)折疊結(jié)構(gòu)[23]，其不同亞基的等電點(diǎn)和分子質(zhì)量略有不同，可被超過90%的花生過敏患者的血清所識(shí)別[24]。叢艷君等[25]采用固相合成肽技術(shù)合成了Ara h l的23 條多肽，以花生過敏患者血清為抗體，鑒別和定位Ara h l的抗原決定簇。結(jié)果表明：Ara h l第21～34位、第89～98位、第393～403位、第498～507位、第594～605位氨基酸序列識(shí)別率均在60%以上，為Ara h l的抗原決定簇，其中第498～507位的多肽識(shí)別率為100%。是顯性抗原決定簇。用丙氨酸依次取代顯性抗原決定簇的每個(gè)氨基酸，發(fā)現(xiàn)抗原決定簇的致敏性增強(qiáng)或喪失，說明Ara h 1第499位和第503位的精氨酸和第502位的丙氨酸是Ara h 1致敏性的關(guān)鍵氨基酸。

Ara h 1具有熱穩(wěn)定性強(qiáng)、耐酶解和不易消化等特點(diǎn)[26]，與其他豆科植物貯藏蛋白中豌豆球蛋白具有高度同源性[27]。Ara h 1在蛋白質(zhì)水平上與大豆和豌豆中的具有40%的相似性，在DNA水平上與蠶豆和豌豆的豌豆球蛋白有64%的相似性[24]。Ara h 1的IgE結(jié)合位點(diǎn)已確定，包含23 個(gè)獨(dú)立結(jié)合位點(diǎn)，沿分子的線性序列均勻分布[23]。Ara h 1因具有這些特性已被作為花生過敏原檢測(cè)的一種理想的生物標(biāo)記，其分離得到的純品被用作生產(chǎn)單克隆抗體和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)物。

2.2 Ara h 2

Ara h 2是花生中另一種主要的過敏原，也是一種糖蛋白，約占花生總蛋白量的5.9%～9.3%，可被絕大部分花生過敏患者血清中的IgE識(shí)別[34]，與過敏原Ara h 6的氨基酸序列有59%的同源性[35]。肽段分析已經(jīng)確定的Ara h 2一共含有10 個(gè)IgE結(jié)合表位，其中的3 個(gè)抗原決定簇被認(rèn)為是優(yōu)勢(shì)表位，并且在這3 個(gè)抗原決定簇中的2 個(gè)區(qū)域內(nèi)都有專一的氨基酸序列DPYSPS，該序列被認(rèn)為是IgE結(jié)合所必需的[36]。Stanley等[37]研究發(fā)現(xiàn)，10 個(gè)IgE結(jié)合表位貫穿于Ara h 2蛋白，位于氨基酸殘基17～39位置上有3 個(gè)表位（aa 15～24，aa 21～30和aa 27～36），其中有些部分相互重疊。在41～80位上含有4 個(gè)表位（aa 39～48，aa 49～58，aa 57～66和aa 65～74）。另外3 個(gè)表位分布在氨基酸殘基114～157位置上（aa 115～124，aa 127～136和aa 143～152）。其中位于aa 27～36，aa 57～66和aa 65～74位置的3 個(gè)表位與IgE的結(jié)合能力比其他表位都強(qiáng)，被認(rèn)為是Ara h 2蛋白的優(yōu)勢(shì)表位。Ara h 2包含有2 個(gè)亞型，分別為Ara h 2.01和Ara h 2.02，與過敏原Ara h 2.01相比，Ara h 2.02多1 個(gè)IgE結(jié)合表位。這個(gè)結(jié)合表位由12 個(gè)氨基酸組成，剛好形成第3 個(gè)重復(fù)序列DPYSPS[38]。因此，Ara h 2.02相對(duì)分子質(zhì)量大于Ara h 2.01并且其致敏性更強(qiáng)。

2.3 Ara h 3

Ara h 3有很多分子質(zhì)量在14～45 kD之間的同源蛋白，能被45%～54%的患者血清IgE識(shí)別[29]。Ara h 3熱穩(wěn)定性強(qiáng)，不易被蛋白酶徹底水解。Anboxtel等[39]在研究加熱和消化對(duì)Ara h 3和大豆球蛋白與IgE結(jié)合能力的影響中發(fā)現(xiàn)兩者在變性過程中表現(xiàn)相對(duì)穩(wěn)定，根據(jù)蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)和所處溶液離子強(qiáng)度的不同，其變性溫度范圍在70～92 ℃之間。它存在4 個(gè)與IgE結(jié)合的表位，分別位于氨基酸殘基的21～55、134～154、231～269和271～328位置上。Rabjohn等[29]通過對(duì)8 個(gè)花生過敏患者的血清IgE免疫實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，第3個(gè)表位（231～269位）為最優(yōu)勢(shì)表位，8 個(gè)過敏患者的血清IgE均能與之結(jié)合。組成Ara h 3表位的氨基酸中有68%為極性不帶電或非極性氨基酸。iso-Ara h 3是近年發(fā)現(xiàn)的Ara h 3的一個(gè)亞型，與Ara h 3在核苷酸水平上約有73%的序列具有同源性，而在氨基酸水平上的同源性約為67%。然而Ara h 3比iso-Ara h 3有更強(qiáng)的致敏性[40]。

2.4 Ara h 5

Ara h 5是一種幾乎存在于所有真核細(xì)胞的一種蛋白，1977年首次作為肌動(dòng)蛋白的結(jié)合蛋白被報(bào)道，在基因庫(kù)中的登錄號(hào)為AAU81921[30]，目前在國(guó)際免疫學(xué)會(huì)已經(jīng)公布的11 種花生過敏原蛋白中Ara h 5作為泛過敏原。Ara h 5 共有128 個(gè)氨基酸殘基，花生中Ara h 5的含量非常低，其純品很難大量獲得。

2.5 Ara h 6

Ara h 6約占花生蛋白總量的4.5%[31]。迄今為止，Marsh[41]和Koppelman[42]等用陰離子交換層析結(jié)合凝膠層析和高效液相色譜等技術(shù)分離獲得了Ara h 6，通過脫脂、蛋白浸提、陰離子交換層析分離得到目的蛋白，并用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF/MS）及免疫印跡技術(shù)（Western blotting）對(duì)其進(jìn)行鑒定[43]。Koppelman等[42]還發(fā)現(xiàn)其與Ara h 2的氨基酸序列具有高度的同源性，N端測(cè)序結(jié)果顯示Ara h 6的抗原決定簇與Ara h 2 抗原決定簇當(dāng)中的7 個(gè)相同。

2.6 Ara h 8

Mittag等[32]認(rèn)為花生蛋白Ara h 8是一種非常重要的過敏原，會(huì)使樺樹花粉過敏患者過敏，Ara h 8與樺樹花粉過敏病人血清中IgE反應(yīng)強(qiáng)烈，而傳統(tǒng)經(jīng)典的花生過敏原如：Ara h 1、Ara h 2 和Ara h 3，只有很微弱甚至不與樺樹花粉過敏病人血清中IgE反應(yīng)。說明花生蛋白Ara h 8與樺樹花粉具有交叉致敏性。研究還發(fā)現(xiàn)Ara h 8經(jīng)胃液消化后其致敏性明顯降低，所以有可能是其尚未進(jìn)入胃部在口腔消化過程中就已引起了過敏反應(yīng)[44-45]。

3 花生脫敏方法

花生中的過敏原雖然比較穩(wěn)定，但許多研究表明，一些加工方法可對(duì)花生的過敏原產(chǎn)生影響?；ㄉ械闹旅舻鞍卓赡茉诩庸み^程中發(fā)生變性、降解、聚集和化學(xué)修飾，其與IgE的結(jié)合反應(yīng)發(fā)生改變而使其致敏性發(fā)生變化[46]。因此，了解加工過程對(duì)花生過敏原的影響是極其重要的。

3.1 物理方法

3.1.1 熱加工

熱加工因其成本低、操作簡(jiǎn)單、易實(shí)現(xiàn)，是目前改變致敏蛋白質(zhì)性能最常用的方法之一。

3.1.1.1 水煮

Beyer等[47]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)水煮后，花生中致敏蛋白質(zhì)與IgE的結(jié)合能力降低了50%，這主要是由于部分過敏原如Ara h 1和Ara h 2等溶解進(jìn)入了水中，尤其是一些分子質(zhì)量為10～16 kD的蛋白質(zhì)或肽片段溶解到水中。另外加熱還能改變致敏蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)，當(dāng)純化后的Ara h 1加熱到80～90 ℃時(shí)，二級(jí)結(jié)構(gòu)折疊加劇，使得溶解度降低，從而降低了花生的過敏性[48]。Hu Chunqiu等[49]發(fā)現(xiàn)熱處理也可降低Ara h 2的抗原性，當(dāng)熱處理溫度高于85 ℃時(shí)，過敏原Ara h 2的抗原性明顯降低；當(dāng)處理溫度為115 ℃時(shí)，加熱1 h后其抗原性降低85%。因此通過水煮可以降低花生部分過敏原的抗原性，該法可能是獲得低致敏性花生制品的一個(gè)很好途徑。

3.1.1.2 煎炸和烘焙干燥

煎炸同樣會(huì)影響花生的過敏原性，花生經(jīng)過煎炸之后所含的Ara h 1單體和三聚體數(shù)量就會(huì)減少，從而降低了Ara h 1與IgE的結(jié)合能力[47]。Stark等[50]研究顯示，烘焙處理明顯增強(qiáng)了Ara h 2與人體腸道上皮細(xì)胞的結(jié)合力，加速低聚體形成，提高了與IgE、IgG的結(jié)合能力。這主要是由于在焙烤過程中花生中蛋白質(zhì)與還原糖在美拉德反應(yīng)中形成Amadori產(chǎn)物，這種產(chǎn)物經(jīng)過一系列作用最終生成結(jié)構(gòu)多樣的復(fù)合物，而這種最終產(chǎn)物含量的增加會(huì)導(dǎo)致IgE結(jié)合能力的增強(qiáng)。研究還發(fā)現(xiàn)，焙烤過程中Ara h 2分子發(fā)生了交叉連接，并形成結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定的三聚體或六聚體等復(fù)合物，增強(qiáng)了其與IgE的結(jié)合能力[51]。Maleki[51]和Beatriz[52]等的研究證實(shí)，焙烤花生的致敏性比水煮花生和生花生都要強(qiáng)，與IgE的結(jié)合能力比生花生高90 倍。在花生焙烤過程中一些中間產(chǎn)物的生成可能導(dǎo)致其與IgE結(jié)合能力的增強(qiáng)的主要原因，如脂的氧化物等。對(duì)花生進(jìn)行熱風(fēng)干燥時(shí)，不同的溫度對(duì)花生致敏性的影響也不同。Chung等[53]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)熱空氣的溫度在35～60 ℃時(shí)不會(huì)改變花生的致敏性，而溫度在77 ℃以上時(shí)則會(huì)提高花生的致敏性。因此經(jīng)過烘焙處理來降低花生的致敏性是否有效還有待進(jìn)一步研究，降低烘烤花生致敏性可以結(jié)合高壓等其他處理，進(jìn)一步研究來確定具體有效的處理方法。

3.1.1.3 花生油脂精煉過程

Teuber等[54]通過對(duì)17 個(gè)花生過敏患者的血清池進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證明不同精煉等級(jí)的花生油與IgE的結(jié)合能力不同。與IgE結(jié)合能力由強(qiáng)到弱的次序?yàn)椋悍蔷珶捇ㄉ停庸さ淖罡邷囟葹?4 ℃）＞非精煉花生油（加工溫度為63～93 ℃）＞精煉的、脫色的、除味的花生油（加工溫度為230～260 ℃）?？赡芤?yàn)楦邷馗淖兞嘶ㄉ鞍捉Y(jié)構(gòu)，也可能是精煉后花生蛋白含量減少甚至消失，使其精煉制品致敏性降低。

3.1.2 機(jī)械研磨

Hourihane等[55]從研磨花生中提取花生蛋白，并對(duì)14 個(gè)花生過敏患者進(jìn)行雙盲實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中有患者僅食用100 μg的花生蛋白即可出現(xiàn)短期的過敏癥狀。由此可見，對(duì)花生進(jìn)行研磨加工并未能降低其致敏性。因簡(jiǎn)單的機(jī)械加工不能改變致敏蛋白的分子結(jié)構(gòu)，故很難改變其致敏性。

3.1.3 高溫加壓處理

Guillamon等[56]先前的研究已經(jīng)表明，高壓滅菌法在138 ℃，2.56 atm條件下處理30 min和在5.9 atm 條件下經(jīng)過3 min的“瞬時(shí)控制降壓”可以減少羽扇豆過敏原的IgE結(jié)合能力。同樣的研究結(jié)果在其他豆類研究中得到證實(shí)：Malley等[57]研究發(fā)現(xiàn)120 ℃高壓處理青豌豆15 min可以減少其過敏原。Beatriz等[52]在壓力2.56 atm條件下將花生處理15 min后，分子質(zhì)量在26 kD和33 kD的蛋白的免疫反應(yīng)依然存在，但是在同樣壓力下處理30 min后，其免疫反應(yīng)消失。烘烤過的花生樣品在高壓處理過程中，隨壓力增大和時(shí)間延長(zhǎng)，Ara h 1、Ara h 2和Ara h 3含量有所降低，說明了降低烘烤花生致敏性可以結(jié)合高壓等其他處理來實(shí)現(xiàn)。

當(dāng)然，每一種方法都有各自不同的優(yōu)缺點(diǎn)。Hu Chunqiu等[49]分別用輻照、熱加工和超高壓微射流3 種不同加工方法處理Ara h 2，發(fā)現(xiàn)輻照處理對(duì)Ara h 2的抗原性降低最為明顯，20 kGy的輻照劑量即可使Ara h 2的抗原性降低93%。其次為熱加工處理，超高壓微射流對(duì)于改變Ara h 2的抗原性影響最小，當(dāng)Ara h 2經(jīng)180 MPa處理3 次時(shí)，其抗原性降低了51%。

3.2 酶處理

酶處理是減少或消除一些食物致敏性的另一個(gè)重要方法。近年來，一些研究表明使用酶處理可以減少花生致敏原性。

3.2.1 胃蛋白酶和胰蛋白酶處理

Koppelman等[58]在花生消化性實(shí)驗(yàn)評(píng)估中，用胃蛋白酶消化花生過敏原，發(fā)現(xiàn)Ara h 1、Ara h 3能迅速被消化，而Ara h 2和Ara h 6，即使在很高的胃蛋白酶濃度下也很難被消化。這可能是因?yàn)樵贏ra h 2和Ara h 6分子結(jié)構(gòu)中有二硫鍵的存在，它們對(duì)于過敏原的穩(wěn)定性起重要作用。同時(shí)也說明了胃蛋白酶僅對(duì)于二硫鍵含量少的過敏蛋白有較好的消化效果。進(jìn)一步將很難被胃蛋白酶分解的Ara h 2和Ara h 6用胰蛋白酶消化，發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶確實(shí)能消化Ara h 2和Ara h 6，但是Ara h 2在消化后仍保留有大量的肽段。Astwood等[59]將花生的過敏蛋白用胰蛋白酶處理45 min后，發(fā)現(xiàn)其過敏性顯著降低。Yu等[60]的研究表明，胰蛋白酶和糜蛋白酶水解能有效降低花生過敏原Ara h 1和Ara h 2的含量，還增加了可溶性蛋白的含量，并且煮沸能提高酶水解烘烤花生的效率，但這對(duì)生花生的影響不大。

3.2.2 其他酶類

除了消化酶外，其他水解酶也能改變其過敏原性，有研究表明，堿性內(nèi)切蛋白酶比風(fēng)味蛋白酶能更好地水解烘烤過的花生可溶性蛋白，進(jìn)而減少了其與IgE反應(yīng)性[61]。而經(jīng)多酚氧化酶交聯(lián)后，無論是生花生，還是烘烤過的花生，粗蛋白中Ara h 1和Ara h 2明顯減少，并形成了高聚物，雖然交聯(lián)產(chǎn)物也會(huì)與IgE結(jié)合，但是總的結(jié)合水平是降低的[62]。Chung等[63]研究表明，在37 ℃分別用過氧化物酶處理焙烤花生和生花生60 min后，焙烤花生的過敏性顯著降低，甚至低于生花生的過敏性，而對(duì)生花生的過敏性并無影響。Ara h 1被轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶交聯(lián)修飾后，其致敏性變化不大，這是由于疏水氨基酸主要位于Ara h 1單體相互作用的區(qū)域，Ara h 1單體可以聚合成高度穩(wěn)定的同源三聚體，大部分IgE結(jié)合位點(diǎn)也位于單體的結(jié)合區(qū)域，這有利于保護(hù)IgE結(jié)合位點(diǎn)，使其不易被蛋白酶識(shí)別[64]。

由此看來，由于各種酶的催化位點(diǎn)不同對(duì)不同的致敏蛋白表現(xiàn)出了各異的脫敏效果，仍需進(jìn)一步探索研究以應(yīng)對(duì)不同致敏蛋白合適的酶交聯(lián)反應(yīng)，同時(shí)也表明僅憑一種酶是很難消除花生的致敏性的，酶交聯(lián)反應(yīng)脫敏與其他方法結(jié)合使用可能會(huì)收到更好的脫敏效果。

3.3 分子生物學(xué)方法

截止到目前，國(guó)際上公認(rèn)的幾種主要花生過敏原的cDNA已經(jīng)被分離、測(cè)序和克隆重組，研究人員正在探索通過基因“沉默”的方式來抑制主要過敏原的表達(dá)，從而降低花生的致敏性。相關(guān)研究表明：重組表達(dá)Ara h 1（rAra h 1）比天然Ara h 1（nAra h 1）在胃腸消化中穩(wěn)定低，而且它們與IgE的結(jié)合形式也不同[65]，因此其致敏性在消化后可能會(huì)降低。

易海濤等[66]通過已鑒定出的Ara h 2主要的3 個(gè)IgE表位（ 27～36、59～64、65～72）進(jìn)行設(shè)計(jì)新型低致敏原衍生物，同時(shí)保留其主要的T細(xì)胞表位。將以上這3 個(gè)主要的IgE抗原表位斷開，并重新組合，按69～157、62～68、32～61、1～31的氨基酸順序重新排列，并表達(dá)出這種新型的低致敏原衍生物。Western blotting和酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）分析結(jié)果均表明經(jīng)基因工程改造的F-Ara h 2蛋白同樣能夠與花生過敏患者血清中的IgE抗體進(jìn)行特異性識(shí)別，但與未突變的R-Ara h 2相比，其免疫原應(yīng)性有明顯降低。Ramos等[67]對(duì)Ara h 2.01上5 個(gè)不同位點(diǎn)進(jìn)行錯(cuò)義突變得到的Ara h 2.01，IgE結(jié)合能力降低了56%～99%。

3.4 發(fā)芽處理

在Kang等[38]的研究中，將浸泡2 h后的花生在25 ℃避光發(fā)芽，在花生萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的任何階段都沒有檢測(cè)到轉(zhuǎn)錄的過敏原，并且SDS-PAGE顯示其蛋白質(zhì)成分有較大變化。將不同發(fā)芽時(shí)間的花生提取的過敏原粗提液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，顯示花生在萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)過程中Ara h 1和Ara h 2含量顯著減少。發(fā)芽48 h后很容易觀察到Ara h 1蛋白質(zhì)的降解，其降解產(chǎn)物在發(fā)芽96 h和144 h時(shí)可被明顯檢測(cè)到。另外，Ara h 2在發(fā)芽48 h后開始減少并在144 h時(shí)檢測(cè)不到。但是，棉花種子的主要過敏原在發(fā)芽過程中表現(xiàn)穩(wěn)定[68]。通過發(fā)芽處理降低種子中過敏原含量與種子種類及種子中蛋白等成分的含量都有關(guān)系，相應(yīng)的研究還需進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)芽處理是否可以有效降低花生種子的致敏性。

4 結(jié) 語

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)花生致敏原的組分、結(jié)構(gòu)特性和理化性質(zhì)都做了深入研究，也獲得一些與花生致敏反應(yīng)機(jī)制及主要致敏原抗原表位相關(guān)的信息，但是新過敏原的不斷發(fā)現(xiàn)也催促我們?nèi)リU明其相關(guān)的致敏機(jī)理。加工對(duì)過敏原的影響研究仍都處于起步階段，很多工作有待我們繼續(xù)深入研究。我們目前所知的這些信息還不足于徹底治愈和防范花生過敏反應(yīng)。預(yù)防過敏癥的最好辦法是不攝入含過敏原的食品，但這種方法是不現(xiàn)實(shí)的。為了降低花生的致敏性，各個(gè)領(lǐng)域的學(xué)者都在做著不懈的努力，目前的脫敏方法主要集中于兩個(gè)方面: 一是基因工程降低花生品種的致敏性；二是探索合適的加工方式降低花生的致敏性。今后研究方向：1）不同地區(qū)的不同花生品種其致敏性不盡相同，故而篩選野生低致敏性的花生品種將成為今后花生種質(zhì)資源研究的內(nèi)容；2）過敏原快速定性檢測(cè)方法的建立：目前常用的血清、SDS-PAGE

甚至質(zhì)譜檢測(cè)過敏原的方法花費(fèi)大、過程繁瑣，根據(jù)過敏原蛋白質(zhì)分子水平上的特征探索簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法將是今后花生乃至整個(gè)食品過敏原研究的重點(diǎn)工作之一；過敏原快速定量檢測(cè)方法的建立：將過敏原在蛋白水平甚至多肽水平上進(jìn)行定量檢測(cè)，將為花生制品提供準(zhǔn)確的過敏原含量檢測(cè)數(shù)據(jù)。這將有利于花生制品的生產(chǎn)和消費(fèi)，也為花生過敏消費(fèi)者們提供一定的保護(hù)。或許新的分析檢測(cè)技術(shù)的開發(fā)能幫助我們更好的發(fā)現(xiàn)過敏原和闡明過敏機(jī)理；而醫(yī)學(xué)工作者和食品科學(xué)工作者的聯(lián)合攻關(guān)，更能有效的解決花生過敏的這一世界性難題。

[1] 楊勇, 闞建全, 趙國(guó)華, 等. 食物過敏與食物過敏原[J]. 糧食與油脂, 2004(3): 43-45.

[2] PENNINKS A H, KNIPPELS L M. Determination of protein allergenicity: studiesinmice[J]. Toxicology Letters, 2001, 120(13): 181-186.

[3] FAO. Report of the FAO Technical Consultation on Food Allergies[C]// Rome: Food and Agriculture Organization, 1995.

[4] 劉建欣, 鄭昌學(xué). 現(xiàn)代免疫學(xué): 免疫的細(xì)胞和分子基礎(chǔ)[M]. 北京: 清華大學(xué)出版社, 2003: 78-94.

[5] SAMPSON H A, BURKS A W. Mechanisms of food allergy allergy[J]. Annual Review of Nutrition, 1996, 16(1): 161-177.

[6] KEMP A S, HU W. Food allergy and anaphylaxis-dealing with uncertainty[J]. Medical Journal of Australia, 2008, 188(9): 503-504.

[7] RICHARD C N, MARIA P L, JENNIFER M R, et al. What’s in akiss: peanut allergen trnsmission as a sensitizer[J]. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2007, 119(3): 755-755.

[8] ALLAN S, ANNE M F, HUGH A S. Further fatalities caused by anaphylactic reactions to food, 2001—2006[J]. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2007, 119(4): 1016-1018.

[9] SICHERER S H, GODBOLD J H, SAMPSON H A. US prevalence of self-reported peanut, tree nut, and sesame allergy: 11-year follow-up[J]. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2010, 125(6): 1322-1326.

[10] 葉世泰, 傅陽心. 我國(guó)常用食品致喘40例分析[J]. 臨床薈萃, 1986(12): 427-429.

[11] 李宏, 張宏譽(yù). 花生過敏原致敏組分分析[J]. 中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志, 2001, 21(4): 12-15.

[12] HOURIHANE J B, BEDWANI S J, DEAN T P, et al. Randomised, double-blind, crossover challenge study of allergenicity of peanut oils in subjects allergic to peanuts[J]. British Medical Journal, 1997, 314: 1084-1088.

[13] ASERO R, BALLMER-WEBER B K, BEYER K, et al. IgE mediated food allergy diagnosis: current status and new perspectives[J]. Molecular Nutrition and Food Research, 2007, 51(1): 135-147.

[14] BISCHOFF S, CROWE S S. Gastrointestinal food allergy: new insightsinto pathophysiology and clinal perspectives[J]. Gastroenterology, 2005, 128(4): 1089-1113.

[15] MOSMANN T R, COFFMAN R L. Th1 and Th2 cells different pattems of lymphokine secretion lead to different functional properties[J]. Annual Review of Immunology, 1989, 7(1): 145-173.

[16] SHO Y, TAKASHI S. Progress in allergy signal research on mast cells: signal regulation of multiple mast cell responses through FcεRI[J]. Journal of Pharmacological Science, 2008, 106(3): 336-340.

[17] YOSHIHIRO B, KEIGO N, YOKO F, et al. Essential function for the calcium sensor STIM1 in mast cell activation and anaphylacticresponses[J]. Nature Immunology, 2008, 9(1): 81-88.

[18] BOCKS A J. Natural history of severe reactions to foods in young children[J]. Journal of Pediatrics, 1985, 107: 676-680.

[19] YUNGINGER J W, SQUILLACE D L, JONES R T, et al. Fatal anaphylactic reactions induced by peanuts[J]. Allergy and Asthma Proceedings, 1989, 83: 764-770.

[20] LEHERE S B, HORNER W E, REESE G. Why are proteins allergic? Implications for biotechnology[J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 1996, 36(6): 553-564.

[21] MEIER D S, TAYLOR S L, NORDLEE J, et al. Identification of peanut allergens by immunoblotting[J]. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 1987, 79: 218.

[22] BURKS A W, WILLIAMS L W, HELM R M, et al. Identification and characterization of a second major peanut allergen, Ara h II, with use of the sera of patients with atopic dermatitis and positive peanut challenge[J]. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 1992, 90(6): 962-969.

[23] BURKS A W, SHIN D, COCKRELL G, et al. Mapping and mutational analysis of the IgE-binding epitopes on Ara h 1, a legume vicilin protein and a major allergen in peanut hypersensitivity[J]. European Journal of Biochemistry, 1997, 245(2): 334-339.

[24] BURKS A W, COCKRELL J S, STANLEY R M, et al. Recombinantpeanut allergen Ara h 1 expression and IgE binding in patients withpeanut hypersensitivity[J]. Journal of Clinical Investigation, 1995, 96(4): 1715-1721.

[25] 叢艷君, 宋煥祿, 薛文通. 花生過敏原Ara h 1免疫顯性抗原決定簇的鑒別[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào), 2010, 10(10): 223-230.

[26] BEYRE K, MORROW E, LI Xiumin, et al. Effects of cooking methods on peanut allergenicity[J]. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2001, 107(6): 1077-1081.

[27] BURKS A W, COCKRELL G, CONNAUGHTON C, et al. Epitope specificity of the major peanut allergen, Ara h II[J]. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 1995, 95(2): 607-611.

[28] WEN H W, WYSOKI W B, DECORY T R, et al. Peanut allergy, peanut allergens, and methods for the detection of peanut contamination in food products[J]. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 2007, 6(2): 47-58.

[29] RABJOHN P, HELM E M, STANLEY J S, et al. Molecular cloning and epitope analysis of the peanut allergen Ara h 3[J]. Journal of Clinical Investigation, 1999, 103(4): 535-542.

[30] CABANOS C, TANDANG-SILVAS M R, ODIJK V, et al. Expression, purification, cross- reactivity and homology modeling of peanut profiling[J]. Protein Expression and Purification, 2010, 162(1): 36-45.

[31] van WIJK F, NIERKENS S, HASSING I. The effect of the food matrix on in vivo immune responses to purified peanut allergens[J]. Toxicological Sciences, 2005, 86(2): 333-341.

[32] MITTAG D, AKKERDAAS J, BALLMER-WEBER B K, et al. Ara h 8, a Bet v 1-homologous allergen from peanut is a major allergen in patients with combined birch pollen and peanut allergy[J]. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2004, 114(6): 1410-1417.

[33] KRAUSE S, REESE G, RANDOW S, et al. Lipid transfer protein (Ara h 9) as a new peanut allergen relevant for a mediterranean allergic population[J]. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2009, 124(4): 771-778.

[34] WIJK F V, HARTGRING S, KOPPELMAN S J. Mixed anti body and T cell responses to peanut and the peanut allergens Ara h1, Ara h2, Ara h3 and Ara h6 in an oral sensitization model[J]. Clinical and Experimental Allergy, 2004, 34(9): 1422-1428.

[35] KLEBER-JANKE T, CRAMERI R, APPENZELLER U, et al. Selective cloning of peanut allergens including profilin and 2S albumins by phage disply technology[J]. International Archives of Allergy and Immunolog, 1999, 119(4): 265-274.

[36] CHATEL J M, BERNARD H, ORSON F M. Isolation and characterization of two complete Ara h2 isoforms cDNA[J]. International Archives of Allergy and Immunolog, 2003, 131(1): 14-18.

[37] STANLEY J S, KING N, BURKS A W, et al. Identification and mutation alanalysis of the immunodomominant IgE binding epitopes of the major peanut allergen Ara h2[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics, 1997, 342(2): 244-253.

[38] KANG I H, SRIVASTAVA P, OZIAS-AKINS P, et al. Temporal and spatial expression of the major allergens in developing and germinating peanut seed[J]. Plant Physiology, 2007, 144(2): 836-845.

[39] ANBOXTEL E L, VANDENBROEK L A, KOPPELMAN S J, et al. Legumin allergens from peanuts and soybeans: effects of denaturation and aggregation on allergenicity[J]. Molecular Nutrition and Food Research, 2008, 52(6): 674-682.

[40] KANG I H, GALLO M. Cloning and characterization of a novel peanut allergen Ara h3 isoform displaying potentially decreased allergenicity[J]. Plant Science, 2007, 172(2): 345-353.

[41] MARSH J, RIGBY N, WELLNER K. Purification and characterisation of a panel of peanut allergens suitable for use in allergy diagnosis[J]. Molecular Nutrition and Food Research, 2008, 52(2): 272-285.

[42] KOPPELMAN S J, JONG G A H, LAAPER-ERTMANN M. Purification and immunoglobulin E-binding properties of peanut allergen Ara h 6: evidence for cross-reactivity with Ara h 2[J]. Clinical and Experimental Allergy, 2005, 35(4): 490-497.

[43] 羅春萍, 高金燕, 胡純秋, 等. 花生過敏原Ara h 6 的分離純化及鑒定[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(15): 76-80.

[44] VIETHS S, REINDL J. Digestibility of peanut and hazelnut allergens invest-I gated by a simple in vitro procedure[J]. European Food Research and Technology, 1999, 209(4): 379-388.

[45] JENSEN-JAROLIM E, WIEDERMANN U, GANGLBERGER E, et al. Allergen mimot opes in food enhance type I allergic reactions in mice[J]. FASEB Journal, 1999, 13(6): 1586-1592.

[46] MILLS E N, SANCHO A I, RIGBY N M, et al. Impact of food processing on the structural and allergenic properties of food allergens[J]. Molecular Nutrition and Food Research, 2009, 53(8): 963-969.

[47] BEYER K, MORROW E, LI X M, et al. Effects of cooking methods on peanuts allergenicity[J]. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2001, 107(6): 1077-1081.

[48] SHEFCHECK K J, MUSSER S M. Confirmation of the allergic peanut protein, Ara h l, in a model food matrix using liquid chromatography/ tandem mass spectrometry (LC/MS/MS)[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2004, 52(10): 2785-2790.

[49] HU Chunqiu, CHEN Hongbing, GAO Jinyan, et al. High-pressure microfluidisation-induced changes in the antigenicity and conformation of allergen Ara h 2 purified from Chinese peanut[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2011, 91(7): 1304-1309.

[50] STARK P, KRISHNAMURTHY D, SZALAI K, et al. Heating affects structure, nterocyte adsorption and signalling, as well as immunogenicity of the peanut allergen Ara h 2[J]. The Open Allergy Journal, 2011, 12(4): 24-34.

[51] MALEKI S J, CHUNG S Y, CHAMPAGNE E T, et al. The effects of roastingon the allergenic properties of peanut protein[J]. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2000, 106(4): 763-768.

[52] BEATRIZ C, SOHEILA J, RODRIGUEZ J, et al. Heat and pressure treatments effects on peanut allergenicity[J]. Food Chemistry, 2012, 132(1): 360-366.

[53] CHUNG S Y, BUTTS C L, MALEKI S J, et al. Linking peanut allergenicity to the processes of maturation, curing, and roasting[J]. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2003, 51(15): 4273-4277.

[54] TEUBER S S, BROWN R L, HAAPANEN L A, et al. Allergenicity of gourmet nut oils processed by different methods[J]. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 1997, 99(4): 502-507.

[55] HOURIHANE J B, KILBUM S A, NORDLEE J A, et al. An evaluation of the sensitivity of subjects with peanut allergy to very low doses of peanut protein: a randomized, double-blind, placebocontrolled food challenge study[J]. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 1997, 100(5): 596-600.

[56] GUILLAMON E, BURBANO C, CUADRADO C, et al. Effect of an instantaneous controlled pressure drop on in vitro allergenicity to lupins (Lupinus albus var. multolupa)[J]. International Archives of Allergy and Immunology, 2008, 145(1): 9-14.

[57] MALLEY A, BAECHER L, MACKLER B, et al. The isolation of allergens from the green pea[J]. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 1975, 56(4): 282-290.

[58] KOPPELMAN S J, HEFLE S L, TAYLOR S L, et al. Digestion of peanut allergens Ara h 1, Ara h 2, Ara h 3, and Ara h 6: a comparative in vitro study and partial characterization of digestion-resistant peptides[J]. Molecular Nutrition and Food Research, 2010, 54(12): 1711-1721.

[59] ASTWOOD J D, LEACH J N, FUCHS R L. Stability of food allergens to digestion in vitro[J]. Nature Biotechnology, 1996, 14(10): 1269-1273.

[60] YU J M, AHMEDNA M, GOKTEPE I, et al. Enzymatic treatment of peanut kernels to reduce allergen levels[J]. Food Chemistry, 2011, 127: 1014-1022.

[61] CABANILLAS B, PEDROSA M M, RODRIGUEZ J, et al. Influence of enzymatic hydrolysis on the allergenicity of roasted peanut protein extract[J]. International Archives of Allergy and Immunology, 2012, 157(1): 41-50.

[62] CHUNG S Y, MALEKI S J, CHAMPAGNE E T, et al. Polyphenol oxidase/caffeic acid may reduce the allergenic properties of peanut allergens[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2005, 85(15): 2631-2637.

[63] CHUNG S Y, MALEKI S J, CHAMPAGNE E T. Allergenic properties of roasted peanut allergens may be reduced by peroxidase[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2004, 52(14): 4541-4545.

[64] CLARE D A, GHARST G, SANDERS T H, et al. Transglutaminase polymerization of peanut proteins[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2007, 55(2): 432-438.

[65] CHRUSZCZ M, MALEKI S J, MAJOREK K A, et al. Structural and immunologic characterization of Ara h 1, a major peanut allergen[J]. The Journal of Biological Chemistry, 2011, 286(45): 39318-39327.

[66] 易海濤, 劉芳, 賈夢(mèng)陽, 等. 經(jīng)基因工程改造的花生主要過敏原Ara h 2制備及其低致敏原性鑒定[J]. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2011, 33(5): 993-998.

[67] RAMOS M L, HUNTEY J J, MALEKI S J, et al. Identification and characterization of a hypoallergenic ortholog of Ara h 2.01[J]. Plant Molecular Biology, 2009, 69(3): 325-335.

[68] DAUSSANT J, ORY R L, LAYTON L L. Characterization of proteins and allergens in germinating castor seeds by immunochemical techniques[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1976, 24(1): 103-107.

Recent Advances in Research on Main Peanut Allergens and Desensitization Methods

ZHANG Ya-jun, ZHANG Hao, YANG Xuan, HAN Yong-bin*
(Key Laboratory of Agricultural and Animal Products Processing and Quality Control, Ministry of Agriculture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

Peanuts are one of the most dangerous food allergens. Peanut allergens can cause severe and even lethal hypersensitivity reactions in humans. In recent years, peanut allergic reactions have attracted extensive attention worldwide due to their potential lethality and chronicity as well as increasing incidences of peanut allergy. The mechanism of peanut allergy and desensitization to peanut allergens have become hot research topics. Effective desensitization methods are of great practical significance for ensuring the safety of peanut-containing foods. This paper elucidates the mechanism of peanut allergy, main peanut allergens and existing desensitization methods.

peanut; allergen; mechanisms; desensitization

TS210.1

A

1002-6630（2014）17-0312-07

10.7506/spkx1002-6630-201417059

2013-07-10

江蘇省優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目（2012BAD28B01）

張雅君（1990—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：2012108024@njau.edu.cn

*通信作者：韓永斌（1963—），男，教授，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工與綜合利用。E-mail：hanyongbin@njau.edu.cn