邢 茜，陳思宇

（上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院腫瘤科，上海200092）

microRNA與肝癌研究進展

邢 茜，陳思宇

（上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院腫瘤科，上海200092）

microRNA；肝癌；表達上調(diào)；表達下調(diào)；臨床意義

隨著人類后基因組計劃的進一步開展，占人類基因組99%的非編碼序列日益引起科學家的關注，其中最引人注目的是microRNA（以下簡稱miRNA）的發(fā)現(xiàn)。miRNA是一類全長為18～25個核苷酸的單鏈小分子RNA，通過與靶標基因3'非翻譯區(qū)（3'UTR）結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后對靶標基因的表達水平進行調(diào)控［1］。

原發(fā)性肝癌的發(fā)病率居全球第5位，原發(fā)性肝癌中有80%～90%是肝細胞性肝癌（以下簡稱肝癌）［2］。肝癌侵襲力強、死亡率高。早期肝癌手術切除、肝移植治療后術后5 a生存率僅為70%。進展期肝癌治療手段更為有限，由于已發(fā)生血行轉(zhuǎn)移，多數(shù)患者喪失手術機會，而化療作用不大且有藥物毒性，因此早期診斷是肝癌有效治療的關鍵。

隨著分子技術的不斷進步，有研究［3］利用一些高通量檢測方法分析不同人類腫瘤的miRNA表達譜，已經(jīng)證實在乳腺癌、肝癌、肺癌、胃癌、卵巢癌等多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)特異性miRNA的差異表達，腫瘤特異性的miRNA表達譜揭示miRNA與腫瘤之間存在密切聯(lián)系。miRNA與肝癌的發(fā)生有關，miRNA的指標變化對早期發(fā)現(xiàn)、診斷肝癌和判斷肝癌預后有著重要意義，同時也為肝癌治療提供新的思路和研究方向。本文就近年關于miRNA與肝癌的相關研究進展作一綜述。

1 microRNA的發(fā)現(xiàn)

1993年，Lee等［4］在秀麗新小桿線蟲中意外地發(fā)現(xiàn)一種定時調(diào)控胚胎后期發(fā)育的基因Lin-4，其編碼一種小分子RNA，這種小分子RNA通過與靶基因Lin-4的mRNA的3'UTR特定區(qū)域結(jié)合以抑制Lin-4的翻譯。后來這種相似的小分子在線蟲、果蠅、小鼠和人類細胞中不斷被發(fā)現(xiàn)，并被命名為miRNA，至今已被鑒定出上千種之多。

2 miRNA的合成和生物學功能

研究［5-8］表明，miRNA基因由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄成初級轉(zhuǎn)錄物Pri-miRNA，此Pri-miRNA是包含Drosha酶（具有核糖核酸酶Ⅲ活性的酶）的多蛋白復合物，Pri-miRNA后經(jīng)Drosha酶剪切形成長度約為80 bp的發(fā)卡狀結(jié)構(gòu)的miRNA前體Pre-miRNA，并由Fxportin-5/Ran-GTP轉(zhuǎn)運至胞漿，最后在胞漿中Dicer內(nèi)切酶將其加工成長度約為22個堿基的雙鏈RNA，雙鏈中的一條則與一種RNA沉默復合物（RISC）結(jié)合成RISC-miRNA復合物，再互補結(jié)合至靶基因mRNA的3'UTR，從而誘導其靶點mRNA的降解或翻譯抑制，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達。

3 miRNA與肝癌

3.1 miRNA與腫瘤發(fā)生miRNA參與生命過程中一系列的重要進程，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、凋亡、轉(zhuǎn)移有密切的關系。乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肺癌中均有miRNA的異常表達。目前認為，miRNA在腫瘤發(fā)生中的作用主要在于3個方面：1）有些miRNA在正常組織表達下調(diào)，在腫瘤組織表達上調(diào)，可能起著癌性miRNA的作用；2）有些miRNA則在正常組織表達上調(diào)，在腫瘤組織表達下調(diào)，可能起著抑癌性miRNA的作用；3）一些致癌病毒編碼的miRNA也可能參與相關腫瘤的發(fā)生。

3.2 miRNA與肝癌的關系miRNA在肝癌發(fā)生過程中，既可通過調(diào)節(jié)細胞凋亡或細胞周期，也可經(jīng)調(diào)節(jié)癌基因或抑癌基因參與腫瘤發(fā)生途徑，其作用具有網(wǎng)絡化、雙向性及組織特異性的特點，從而調(diào)控肝癌細胞的增殖凋亡、血管生成、細胞轉(zhuǎn)移和耐藥性等。

3.2.1 在肝癌中表達上調(diào)的miRNA 1）miRNA-21：miRNA-21是目前研究最多的miRNA之一，參與多種腫瘤的發(fā)生和一系列病理生理改變，與肝臟再生、肝細胞代謝、肝臟免疫反應及肝癌發(fā)生和發(fā)展有著密切聯(lián)系。miRNA-21在肝癌組織中的表達約為正常肝組織中相對表達量的10倍，目前關于其調(diào)控肝癌細胞的機制有以下3種研究結(jié)論：基因PTFN是一種抑癌基因，其表達增加可減少腫瘤細胞的增生、遷移和侵襲。然而miRNA-21通過作用于PTFN激活RTKS、P13K，進而激活AKT路徑，促進腫瘤細胞生長增殖，增加其侵襲力［9］。RHOB基因已知具有腫瘤抑制作用，肝癌細胞中的miRNA-21，通過直接靶向RHOB的3'URT壓制RHOB表達從而促進腫瘤細胞增殖［10］。此外，在肝癌細胞中，miRNA-21主要通過影響一些信號通路中的分子，如基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）和MMP-9來抑制其靶基因細胞凋亡基因（PDCD）的mRNA和蛋白水平，從而抑制肝癌細胞凋亡［11］，越來越多的研究表明miRNA-21-PDCD環(huán)路異常在肝癌發(fā)生中具有重要的作用，相信關于miRNA-21-PDCD環(huán)路作為肝癌治療靶點的可能性會備受關注；2）miRNA-221：miRNA-221與腫瘤發(fā)生密切相關，其在膠質(zhì)母細胞瘤、前列腺癌等多種腫瘤中表達異常，高表達miRNA-221的腫瘤進展快、存活率差、復發(fā)率高。諸多研究［12-14］表明miRNA-22l在肝癌組織中高表達。近年來很多學者進行關于miRNA-221致癌機制的研究：Gramantieri等［12］在體外將肝癌細胞株分為miRNA-221轉(zhuǎn)染及抑制組，通過熒光素酶基因檢測法發(fā)現(xiàn)miRNA-221抑制組可促進腫瘤細胞凋亡，Bmf基因具有促進細胞凋亡的作用，進一步研究發(fā)現(xiàn)miRNA-221正是通過與Bmf基因mRNA的3'UTR結(jié)合抑制其表達從而促進肝癌的發(fā)生、發(fā)展。亦有研究［13-14］闡述其作用機制可能為高表達miRNA-221抑制細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑P27、P57的表達從而調(diào)控細胞周期促進細胞增殖。2010年Pineau等［15］利用肝癌小鼠模型，發(fā)現(xiàn)miRNA-221的過表達刺激致瘤小鼠的肝祖細胞的生長。同時確定miRNA-221的作用靶點為mTOR通路的調(diào)節(jié)劑：DNA損傷誘導轉(zhuǎn)錄因子4（DDIT4）。因此，使用miRNA-221合成的抑制劑可能是一種很有前途的肝癌治療方法。在去年Yuan等［16］應用2/3手術誘導部分肝切除的肝再生模型中，證實過表達的miRNA-221加速小鼠體內(nèi)肝細胞增殖。miRNA-221過表達導致肝細胞迅速進入S期從而實現(xiàn)肝再生。芳香烴核易位（ARNT）信使RNA是miRNA-221的一個作用靶點，與miRNA-221的促細胞增殖活性有關。因此，miRNA-221過表達促進肝細胞增殖，作用于miRNA-221的藥物可通過防止細胞凋亡、誘導肝臟再生來治療肝衰竭；3）miRNA-224：miRNA-224是一個新近被提出的在肝癌組織中表達上調(diào)的小分子 RNA。2008年，Wang等［17］在19例肝癌患者中進行miRNA表達譜檢測，發(fā)現(xiàn)miRNA-224在肝癌患者中有顯著上調(diào)，還發(fā)現(xiàn)miRNA-224通過抑制ALP-5基因的轉(zhuǎn)錄和表達以增加肝癌細胞的增殖。2012年Scisciani等［18］通過RT-PCR方法和芯片檢測發(fā)現(xiàn)p65/NFκB蛋白復合物是miR-224表達的直接轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，并與miRNA-224在肝癌中上調(diào)有關；4）miRNA-10：Yan等［19］從細胞黏附實驗中發(fā)現(xiàn)miRNA-10a在肝癌中表達上調(diào)，并促進肝癌細胞的體外遷移和侵襲，厄酪氨酸激酶受體FphA4被認定為miRNA-10a的靶基因，F(xiàn)phA4通過調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程和β1整合素通路影響細胞浸潤和粘連。miRNA-10b最近報道在肝癌中表達上調(diào)，其上調(diào)與肝癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移有關。研究［20］結(jié)果證實，CADM1受miRNA-10b的過表達抑制，而CADM1的沉默導致細胞運動性和侵襲顯著增加。這些結(jié)果表明miRNA-10b可通過積極地靶向CADM1來調(diào)節(jié)肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。

3.2.2 在肝癌中表達下調(diào)的miRNA 1）miRNA-122：miRNA-122只在肝細胞中表達，約占肝細胞總miRNA量的70%，每個細胞內(nèi)約有50 000個拷貝，不僅參與肝臟分化的調(diào)節(jié)，還參與維持肝臟正常功能，是一種調(diào)節(jié)肝臟發(fā)育的肝特異性miRNA，所以關于miRNA-122的研究也逐漸成為熱點［21］。Gramantieri等［22］利用含有381個人類miRNA探針的基因芯片檢測17例原發(fā)性肝癌組織及21例肝硬化組織內(nèi)miRNA的表達水平，發(fā)現(xiàn)miRNA-122a表達下調(diào)，進一步研究發(fā)現(xiàn)cyclin G1的mRNA為其作用靶點之一。miRNA-122a可能是通過抑制cyclin G1的表達達到維持染色體穩(wěn)定、抑制細胞增殖、促進細胞凋亡的作用，在肝癌發(fā)生發(fā)展中扮演著腫瘤抑制物的角色［23］。近年來，大量研究［24-26］發(fā)現(xiàn)miRNA-122在肝癌組織中表達下調(diào)，并通過負反饋作用于抗凋亡基因Bcl-w家族和促進血管增生、細胞轉(zhuǎn)移的ADAM-1基因，正反饋作用于促進細胞凋亡的Wnt-1信號通路從而調(diào)節(jié)肝癌細胞的血管生成、細胞凋亡和轉(zhuǎn)移；2）miRNA-199：miRNA-199在肝癌和其他惡性腫瘤組織中均有許多表達下調(diào)的報道。Fornari等［27］將39例肝癌標本及10例正常肝組織標本篩選后，發(fā)現(xiàn)miRNA-199轉(zhuǎn)染組可以使細胞周期阻滯于G1期，減少肝癌細胞侵襲力，提高肝癌細胞對缺氧誘導凋亡及阿霉素的敏感性，并最終證實mTOR和C-Met基因均為其作用靶點。mTOR基因在細胞生長、侵襲、凋亡及蛋白翻譯、代謝等過程中起著重要作用，抑制其表達可以使細胞周期阻滯于G1期，從而促發(fā)細胞凋亡。C-Met基因有促進新生血管形成和內(nèi)皮細胞運動、保護細胞免受各種誘導細胞凋亡因子影響的作用。miRNA-199正是通過抑制上述2種基因的表達從而促進肝癌細胞凋亡、減少其侵襲力，增加其對誘導因素的敏感性。同時miRNA-199可抑制PAK4從而抑制癌細胞的增殖，PAK蛋白是的Rho GTP酶對細胞骨架重組和核信號的關鍵激酶，能夠促進細胞增殖［28］。此外，caveolin-2是參與重要的細胞功能，包括信號轉(zhuǎn)導、脂質(zhì)代謝、細胞的生長控制和凋亡的一種蛋白質(zhì)，最近幾年，以caveolin-2為靶點來進行腫瘤抑制已經(jīng)成為研究熱門，研究［29］表明miRNA-199在肝癌細胞中通過抑制蛋白caveolin-2的功能以抑制腫瘤細胞增殖分化。盤狀結(jié)構(gòu)域受體1（DDR1）參與細胞侵襲相關信號轉(zhuǎn)導通路，研究［30］表明miRNA-199抑制DDR1從而抑制肝癌細胞轉(zhuǎn)移。目前晚期肝癌順鉑化療患者由于耐藥性問題在臨床治療中療效欠佳，研究［31］表明順鉑肝癌化療中miRNA-199表達下調(diào)，促進自噬基因ATG7表達的自噬活動，這一研究為解決順鉑化療的耐藥性問題提出新的解決途徑；3）miRNA-101：Su等［32］利用含有308個人類miRNA的芯片，分析肝癌細胞株、手術切除肝癌組織和正常肝細胞中miRNA的表達譜，發(fā)現(xiàn)miRNA-101明顯下調(diào)，達94. 1%，轉(zhuǎn)染miRNA-101組腫瘤細胞在體外克隆和體內(nèi)生長均受抑制，并且轉(zhuǎn)染組腫瘤細胞對饑餓及化療藥物更加敏感。進一步試驗發(fā)現(xiàn)miRNA-101的靶基因為McL-1，McL-1是Bcl-2家族中的一種抗細胞凋亡基因，其主要致癌機制是保護細胞免受各種刺激細胞凋亡的因素的影響，降低其表達可以促進腫瘤細胞凋亡。miRNA-101通過與McL-1的3'UTR結(jié)合抑制其表達，進而抑制肝癌的發(fā)生及發(fā)展。Zhang等［33］研究發(fā)現(xiàn)miRNA-101的靶基因為SOX-9基因，SOX-9基因?qū)儆赪nt/β-catenin信號通路負性調(diào)控因子SOX家族，miRNA-101通過抑制SOX-9基因表達，促進肝癌細胞凋亡；4）miRNA-214：Shih等［34］的研究表明miRNA-214的下調(diào)，活化肝癌衍生生長因子HDGF旁分泌途徑，有助于腫瘤血管生成，從而導致肝癌的血管增生。同年，Wang等［35］證實miRNA-214在肝癌細胞標本表達下調(diào)，進一步的研究揭示miRNA-214可以直接靶向3'-UTR的β-連環(huán)蛋白的mRNA，抑制其蛋白質(zhì)的表達，β-連環(huán)蛋白表達下調(diào)抑制細胞生長，這些發(fā)現(xiàn)表明miRNA-214可作為腫瘤抑制物，通過抑制β-連環(huán)蛋白來抑制肝癌發(fā)生。鑒于這些，miRNA-214可以作為肝癌治療的靶標。

3.2.3 miRNA與HBV相關性肝癌 miRNA-602是與HBV相關性肝癌關系密切的一種miRNA。我國是“乙肝大國”，與HBV感染相關的原發(fā)性肝癌愈發(fā)被重視，越來越多的學者開展miRNA與HBV相關性肝癌的研究，Yang等［36］分別檢測慢性乙型肝炎肝組織、乙肝病毒陽性肝硬化組織、乙肝病毒陽性肝癌組織及正常肝組織的miRNA，發(fā)現(xiàn)miRNA-602在3種異常肝組織中的表達明顯高于正常肝臟組織。進一步研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-602的靶基因為腫瘤抑制基因RASSFlA，表達上調(diào)的miRNA-602抑制RASSFlA的表達。研究［37］指出miRNA-602在HBV感染早期階段即過度表達，并通過抑制抑癌基因RASSFlA的表達以介導慢性乙型肝炎發(fā)展到HBV相關性肝癌的這一過程。他們還發(fā)現(xiàn)，miRNA-602定位于9q34.3，是常見乙肝病毒基因整合位點，推測乙肝病毒在該區(qū)域的插入是導致miRNA-602過度上調(diào)表達的原因。miRNA-602可能作為HBV相關性肝癌的早期檢測物，在癌變前的肝炎、肝硬化階段作為治療靶點。

3.3 miRNA在肝癌中的臨床意義

3.3.1 miRNA作為腫瘤標志物 miRNA可作為輔助肝癌診斷和評估肝癌預后的腫瘤標志物，如前文，下調(diào)的miRNA-122、miRNA-199、miRNA-101、miRNA-214，與腫瘤侵襲、復發(fā)的風險增高有關，同樣，上調(diào)的miRNA-21、miRNA-221、miRNA-224，miRNA-10亦與預后不良有關。研究［38］表明，血漿或血清中的miRNA并不被RNA酶裂解，因此通過外周血檢測miRNA，可以用于惡性腫瘤的篩查和診斷，且外周血樣本來源比活檢標本簡便，操作易行，傷害輕，對于腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)具有重要意義，外周血檢測miRNA對肝癌等血運豐富器官的惡性腫瘤更有意義。研究發(fā)現(xiàn)超過20種血漿或血清中的miRNA檢測與肝癌相關聯(lián)。此外，Zhou等［39］的研究證明miRNA-122、miRNA-192、miRNA-21、miRNA-223、miRNA-26a、miRNA-27a和 miRNA-801a對檢測早期肝癌精確度較高。當然外周血檢測到的miRNA相對于組織仍具有一定局限性，包括血清中的miRNA并不能完全直接反映組織中miRNA的表達水平；血清中miRNA含量較少，更適于研究高表達的miRNA而非低表達的miRNA等。對此仍需要進一步的研究和驗證，提高檢測方法的靈敏性和特異性。

3.3.2 miRNA作為治療靶點 miRNA不僅有利于肝癌的診斷，對靶向治療和基因治療等也具有提示作用。目前研究miRNA用于腫瘤的治療主要為2種思路：1）促進或補充在腫瘤組織中異常低表達的抑癌性miRNA（補充替代療法），或抑制該腫瘤miRNA的癌性靶基因以減緩腫瘤發(fā)展，延長生存期。前者（miRNA-26a［40］、miRNA-122［41］、miRNA-124［42］）在小鼠肝癌模型中被證實有效，但這種假設尚未在肝癌患者中進行測試；2）抑制腫瘤中異常高表達的癌性miRNA，通過應用反義寡核苷酸技術沉默腫瘤組織中高表達的miRNA，進而抑制腫瘤細胞生長和或轉(zhuǎn)移，有研究［43］設計出取自寡核苷酸序列的小分子，作用于miRNA-96發(fā)夾前體并抑制其生物合成，從而抑制其表達，誘導癌細胞凋亡。目前反義寡核苷酸技術在體內(nèi)如何發(fā)揮效應最為關鍵，還需要進一步的研究。

4 小結(jié)與展望

肝癌是侵襲力強、死亡率高的惡性腫瘤。其早期診斷困難，治療手段有限，總體預后較差，嚴重危害人民健康。miRNA作為一類新的分子靶標，自發(fā)現(xiàn)之日便一直是科學研究的熱點所在，其在很多惡性腫瘤中的作用得到證實，也有越來越多的miRNA被應用于腫瘤的診斷、治療及預后判斷等。許多相關的科學研究都為miRNA應用于肝癌的基因診斷、治療及預后判斷提供良好的依據(jù)，具有廣闊的前景。但目前miRNA與肝癌關系的研究仍處于起步階段，很多機制仍無法闡述，在臨床的應用仍需更進一步的探索和更多證據(jù)的支持。

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10.3969/j.issn.1673-5412.2014.05.036

R735.7；R730.23

A

1673-5412（2014）05-0447-05

2014-03-26）

邢茜（1991-），女，碩士在讀，主要從事腫瘤內(nèi)科臨床及相關科研工作。F-mail：754968890@sjtu.edu.cn

陳思宇（1975-），女，博士，副主任醫(yī)師，碩士生導師，主要從事腫瘤內(nèi)科臨床及相關科研工作。F-mail：chensiyu@ 126.com