薛淑雅，楊月峰

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重組腺病毒載體靶向性策略的研究進(jìn)展

薛淑雅，楊月峰

230032 合肥，安徽醫(yī)科大學(xué)研究生院（薛淑雅）；100850 北京，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)血液學(xué)研究室（楊月峰）

近年來，研究者致力于突破基因治療的瓶頸，極大推動(dòng)了基因治療的發(fā)展。載體系統(tǒng)是基因治療的基礎(chǔ)，截止 2013 年 7 月，在“Gene Therapy Clinical Trial Worldwide”網(wǎng)站登記注冊(cè)的基因治療方案中，重組腺病毒載體占 476 項(xiàng)（23.5%）。在 6 個(gè)亞群（A-F）、50 多種血清型的腺病毒載體中，5 型腺病毒（adenovirus type 5，Ad5）可特異性識(shí)別并結(jié)合多種正常組織高表達(dá)的柯薩奇病毒-腺病毒受體（coxsackie-adenovirus receptor，CAR）從而進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮作用，基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高，因此，Ad5 是目前應(yīng)用最廣泛的腺病毒載體。

雖然 Ad5 對(duì)多種組織具有高效感染能力，但也存在脫靶效應(yīng)這一缺陷。例如，正常肝臟細(xì)胞中 CAR 的表達(dá)高，系統(tǒng)用藥可能會(huì)使大量病毒滯留肝臟，產(chǎn)生毒副作用，使得 Ad5 在臨床應(yīng)用中存在很大隱患[1]。因此，提高重組腺病毒的靶向性對(duì)于推動(dòng)重組腺病毒的臨床應(yīng)用意義重大。那么，如何增強(qiáng)腺病毒感染或目的基因表達(dá)的靶向性呢？近年來，研究者嘗試通過多種途徑提升重組腺病毒的靶向性，大量文獻(xiàn)報(bào)道主要是通過對(duì)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)靶向和基因轉(zhuǎn)錄靶向的調(diào)控，實(shí)現(xiàn)治療的靶向性。我們對(duì)現(xiàn)有的研究進(jìn)展作一綜述。

1 基因轉(zhuǎn)導(dǎo)靶向性策略

基因轉(zhuǎn)導(dǎo)，簡(jiǎn)言之就是將目的基因?qū)氲教囟ǖ募?xì)胞中。提高靶向性的實(shí)質(zhì)就是提高重組腺病毒載體對(duì)特定細(xì)胞（組織）的感染效率，與此同時(shí)，降低其對(duì)其他細(xì)胞（組織）的感染效率。目前常用的策略包括：①改構(gòu)腺病毒外殼，使其選擇性地與靶細(xì)胞膜表面的特異性受體結(jié)合；②通過雙功能分子和雙特異性抗體介導(dǎo)靶向轉(zhuǎn)導(dǎo)[2]等。

1.1 重組腺病毒外殼的改構(gòu)與修飾

眾所周知，Ad5 通過識(shí)別靶細(xì)胞表面的 CAR 受體進(jìn)入細(xì)胞，其具體過程為：腺病毒的纖維頂球與靶細(xì)胞表面 CAR 受體等黏附、結(jié)合；然后，由五聚體基部的一段肽鏈精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp，RGD）與細(xì)胞表面的“第二受體”整合素 αvβ3 和 αvβ5 識(shí)別并結(jié)合，通過受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞作用使病毒內(nèi)化；最后，完成目的基因的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制。基于此過程，針對(duì)參與病毒與靶細(xì)胞識(shí)別、病毒內(nèi)化等過程的關(guān)鍵外殼蛋白，進(jìn)一步進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造與修飾，是提高重組腺病毒基因轉(zhuǎn)導(dǎo)靶向性的最直接策略。

Ad5 外殼蛋白的改構(gòu)或修飾，可提高其對(duì) CAR 受體低表達(dá)的腫瘤細(xì)胞的感染效率，同時(shí)，降低對(duì) CAR 高表達(dá)的正常組織的感染。Wickham 等[3]和 Murugesan 等[4]的研究結(jié)果表明在野生型纖維蛋白的 C 末端連接多聚 RGD，可識(shí)別 αv 整聯(lián)蛋白，從而提高 CAR 低表達(dá)細(xì)胞的感染效率；進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，改構(gòu)后的病毒對(duì) CAR 高表達(dá)的肝臟等組織的感染效率降低，因此無明顯系統(tǒng)毒性；同時(shí)對(duì)卵巢移植瘤的感染效率選擇性提高，治療效果明顯增強(qiáng)。另有研究表明，在纖毛結(jié)節(jié)區(qū)的 HI 環(huán)中插入與整合素結(jié)合的短肽（CDCGRDCFC，RGD-4C），可提升對(duì) CAR 陰性細(xì)胞的感染效率和基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率[5]。

不同血清型的重組腺病毒識(shí)別不同的表面受體，而 B 組腺病毒可識(shí)別腫瘤細(xì)胞和造血細(xì)胞高表達(dá)的 CD46 分子。為提高重組腺病毒對(duì)腫瘤或造血細(xì)胞的靶向性，研究者結(jié)合 C 族 5 型腺病毒和 B 族腺病毒，構(gòu)建了具有嵌合纖維頂球的重組腺病毒載體，包括 Ad5/F11P、Ad5/3 和 Ad5F35 等。Lu 等[6]采用11p 型腺病毒（Ad11p）的纖維頂球替換 5 型腺病毒載體的纖維頂球，獲得的雜合病毒 Ad5F11p 可顯著增強(qiáng)對(duì)造血細(xì)胞的感染效率。此外，含有 Ad5 與 Ad3 嵌合型纖維頂球的重組腺病毒可明顯增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的感染效率[7]。同時(shí)，研究者驚喜地發(fā)現(xiàn)，將 5 型腺病毒載體的纖毛完全置換為 35 型腺病毒的纖毛，可使重組腺病毒的體內(nèi)分布發(fā)生巨大變化，為實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)給藥打下基礎(chǔ)[8]。因此，通過對(duì)重組腺病毒纖毛以及外殼蛋白的修飾，可使重組腺病毒具有特定的靶向性。

1.2 雙功能分子或雙特異性抗體介導(dǎo)的靶向性策略

雙功能分子或雙特異性抗體，即分子橋或抗體橋，其一端與腺病毒的衣殼蛋白結(jié)合，另一端與細(xì)胞表面特異性受體結(jié)合，從而將重組腺病毒導(dǎo)向靶細(xì)胞，該策略是提高轉(zhuǎn)導(dǎo)靶向性的另一重要方式。腫瘤細(xì)胞表面往往高表達(dá)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體（fibroblast growth factors receptor，F(xiàn)GFR）和表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）等分子。研究表明，它們與腺病毒外殼蛋白的雙特異性分子可顯著提高對(duì)頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、膀胱癌細(xì)胞（EGFR+）以及膠質(zhì)細(xì)胞瘤（CAR 低表達(dá)）等多種腫瘤細(xì)胞的感染效率，同時(shí)又可減少肝臟毒性。另有研究表明，抗結(jié)節(jié)區(qū)抗體的 Fab 片段與 FGFR2 共扼結(jié)合，可提高重組腺病毒的治療效果，包括提升目的基因表達(dá)量，降低肝臟和系統(tǒng)毒性等[9-11]。

分子橋或抗體橋雖可顯著提高腺病毒基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的靶向性，但仍存在不足之處，如制備和鑒定雙功能分子橋費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，體內(nèi)用藥有時(shí)可引起腺病毒的清除，補(bǔ)體系統(tǒng)激活等，從而限制了其臨床應(yīng)用[12]。因此，積極改進(jìn)制備工藝以及優(yōu)化分子結(jié)構(gòu)，可以推進(jìn)其在臨床上的應(yīng)用。

2 基因轉(zhuǎn)錄靶向性策略

基因轉(zhuǎn)錄靶向性，是指在多種轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的調(diào)控下，實(shí)現(xiàn)目的基因在細(xì)胞內(nèi)的高效、特異表達(dá)。其主要策略包括：①采用特異性啟動(dòng)子調(diào)控目的基因的表達(dá)；②采用條件復(fù)制型溶瘤腺病毒策略；③采用雙啟動(dòng)子[13]、增強(qiáng)子[14]和乏氧調(diào)控元件[15]等策略。

2.1 特異性啟動(dòng)子調(diào)控策略

通過組織或腫瘤特異性啟動(dòng)子（增強(qiáng)子）等調(diào)控外源基因的表達(dá)，是提高治療基因轉(zhuǎn)錄靶向性，減少毒性反應(yīng)的重要途徑之一。理想的特異性調(diào)控序列，應(yīng)具有無泄漏、特異性高、可調(diào)控和表達(dá)效率高等特點(diǎn)。至今，已有包括癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）[16]和人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶（telomerase reverse transcriptase，hTERT）[17]的調(diào)控序列等多種腫瘤特異性啟動(dòng)子應(yīng)用于該策略。例如，采用單純的或經(jīng)修飾的 CEA 特異性調(diào)控序列，控制胞嘧啶脫氧酶（cytosine deaminase，CD）基因的表達(dá)，可使自殺基因高效、特異表達(dá)，實(shí)現(xiàn)腫瘤的靶向性治療[18-19]；由 hTERT 啟動(dòng)子調(diào)控腺病毒基因組，并攜帶細(xì)胞因子信號(hào)肽抑制劑 3（suppressor of cytokine signaling 3，SOCS3）基因的重組腺病毒，能有效靶向腫瘤細(xì)胞并對(duì)正常細(xì)胞無毒副作用，因此被廣泛應(yīng)用于肝癌的治療研究[20]。CEA、AFP、hTERT 等啟動(dòng)子雖可在惡性腫瘤細(xì)胞獲得特異性表達(dá)，但仍存在一定的泄漏。因此，腫瘤的靶向性基因治療需要尋找表達(dá)更嚴(yán)密、效率更高的腫瘤特異性啟動(dòng)子。

轉(zhuǎn)錄靶向的策略，是目前溶瘤腺病毒構(gòu)建最常用的方法。在轉(zhuǎn)錄水平，通過腫瘤特異性啟動(dòng)子，如甲狀腺球蛋白啟動(dòng)子[21]和前列腺細(xì)胞特異性抗原（PSA）啟動(dòng)子等，調(diào)控腺病毒復(fù)制必需基因的表達(dá)，可實(shí)現(xiàn)重組腺病毒特異性的復(fù)制。通過 PSA 特異性啟動(dòng)子和前列腺特異性增強(qiáng)子（PSE）調(diào)控腺病毒復(fù)制必需基因 E1A 的表達(dá)，構(gòu)建的前列腺癌特異性溶瘤腺病毒 CV706 可以有效地實(shí)現(xiàn)前列腺腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性復(fù)制，從而進(jìn)一步殺傷前列腺腫瘤細(xì)胞。該溶瘤腺病毒已完成 I 期臨床安全性評(píng)價(jià)[22]。

除腫瘤特異性啟動(dòng)子外，可用于轉(zhuǎn)錄靶向調(diào)控的特異性啟動(dòng)子還包括神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）啟動(dòng)子、II 型肺泡上皮特異性啟動(dòng)子和細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞黏附分子-2（intracellular cell adhesion molecule-2，ICAM-2）啟動(dòng)子等組織或細(xì)胞特異性啟動(dòng)子等[23-25]。

2.2 條件復(fù)制型腺病毒策略

條件復(fù)制型腺病毒（conditionally-replicating adenovirus，CRAD），又稱溶瘤腺病毒（oncolytic adenovirus），是指在腫瘤細(xì)胞中特異性復(fù)制并裂解腫瘤細(xì)胞，進(jìn)而釋放子代病毒，去感染周圍的腫瘤細(xì)胞，通過級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)最終消滅腫瘤。目前，CRAD 已被廣泛應(yīng)用于腫瘤的治療與研究，并在動(dòng)物及臨床前研究階段取得了令人鼓舞的結(jié)果。目前，有大量的相關(guān)臨床試驗(yàn)正在開展。CRAD 的主要構(gòu)建策略包括：①選擇性敲除腺病毒在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制不必需的基因，但這些基因?qū)τ谙俨《驹谡＜?xì)胞中復(fù)制卻是必不可少的，如 ONYX-015 和 H101 等，其中 ONYX-015 處于 III 期臨床研究階段，而 H101 已在中國批準(zhǔn)上市；②通過腫瘤（組織）特異性啟動(dòng)子調(diào)控腺病毒復(fù)制必需基因 E1A 的表達(dá)等。第二種策略是目前研究者普遍采用的一種應(yīng)用較為靈活且具有廣泛意義的方法，已在特異性啟動(dòng)子調(diào)控策略中闡述，接下來詳細(xì)闡述第一種策略。

重組腺病毒 EIA 基因中 55 kD 蛋白區(qū)段缺失后，可使病毒在 p53 突變的細(xì)胞中選擇性復(fù)制并裂解細(xì)胞，最具代表性的是美國 ONYX 公司研發(fā)的腫瘤特異性增殖型病毒 ONYX-015，目前處于治療復(fù)發(fā)性頭部和頸部癌癥的 III 期臨床試驗(yàn)階段，治療結(jié)直腸、卵巢、胰腺和口腔腫瘤的 II 期臨床試驗(yàn)階段，以及治療消化道、食道和肝臟腫瘤的 I 期臨床試驗(yàn)階段[26]；dl922-947 和△24 則通過刪除病毒單一保守區(qū) E1A-CR2 區(qū)基因，使其失去與 pRb 結(jié)合功能，從而實(shí)現(xiàn)靶向溶瘤[27]；而 AxdAdB-3 則同時(shí)存在E1A 和 E1B-55KD 兩處突變從而限制其只能夠在 p53 和 pRb 同時(shí)缺失的細(xì)胞中復(fù)制[28]。此外，Doronin 等[29]報(bào)道，去除 E3 區(qū)而 ADP 過表達(dá)的溶瘤腺病毒可選擇性地在分裂相的腫瘤細(xì)胞中復(fù)制，進(jìn)而顯著延緩腫瘤的生長(zhǎng)。

CRAD 只在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，而在正常細(xì)胞中不復(fù)制，具有產(chǎn)生旁觀者效應(yīng)、溶瘤效應(yīng)及明顯提高治療基因的表達(dá)效率等優(yōu)勢(shì)。

2.3 雙啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和乏氧調(diào)控元件等調(diào)控策略

多項(xiàng)研究表明，通過雙啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和乏氧調(diào)控元件等策略，可顯著提高腺病毒的靶向性。轉(zhuǎn)錄控制的溶瘤腺病毒 CG5757，攜帶了兩個(gè)腫瘤特異性啟動(dòng)子，包含 E2F-1 和人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶基因。臨床前研究結(jié)果顯示，CG5757 全身應(yīng)用具有低毒性及更好的腫瘤選擇性和更強(qiáng)的療效[13]。此外，將乏氧調(diào)控元件整合入改良后的人 α-甲胎蛋白（hAFP）啟動(dòng)子后，大大提高了溶瘤腺病毒的選擇性和抗腫瘤效應(yīng)[15]。

3 腺病毒雙靶向或多靶向策略

應(yīng)用不同腫瘤特異性啟動(dòng)子分別來控制腺病毒復(fù)制必需基因，如 E1A、E1B 和 E4 等，并結(jié)合外殼蛋白修飾等方法，可實(shí)現(xiàn)更為安全的多靶向溶瘤腺病毒治療。有學(xué)者首先利用 hTERT 啟動(dòng)子、存活蛋白啟動(dòng)子和 CEA 啟動(dòng)子分別控制 E1A、E1B 和 E4 基因的表達(dá)，同時(shí)將 5 型腺病毒的纖維蛋白替換成 35 型。結(jié)果表明，該重組腺病毒能夠更安全、更有效地殺傷腫瘤[30]。

由劉新垣院士提出的癌癥的靶向雙基因-病毒治療策略，是指分別采用不同的策略構(gòu)建溶瘤腺病毒 Ad-TERT 和 ZD55，然后分別將多種抗癌基因加入 ZD55 及 Ad-TERT 系統(tǒng)中。結(jié)果顯示，其療效優(yōu)于 ONYX-015、ZD55 或Ad-TERT[31-32]。研究證實(shí)，將分別攜帶不同基因的兩個(gè)病毒聯(lián)合使用，可以發(fā)揮其協(xié)同效應(yīng)或互補(bǔ)作用，可增強(qiáng)其抗癌功能。這種雙基因-病毒治療策略，獲得了良好的抗癌療效，也是迄今不需用化療輔助就可在動(dòng)脈腫瘤模型中將腫瘤全部消滅的、極具發(fā)展前景的生物治療方案之一[33]。

4 展望

重組腺病毒是臨床應(yīng)用最為廣泛的基因治療載體，但是目前僅有很少的方案進(jìn)入 III 期臨床試驗(yàn)。因此，要實(shí)現(xiàn)其在臨床中的廣泛應(yīng)用，還有諸多問題需要解決，如靶向性、病毒抗體的產(chǎn)生等問題。將重組腺病毒與其他治療手段，如放療、化療、免疫治療等聯(lián)合應(yīng)用，將是基因治療的重要發(fā)展方向。已有研究報(bào)道，將 ONYX-015 和化療藥物如5-氟尿嘧啶、順鉑等聯(lián)合應(yīng)用，可發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用，且療效優(yōu)于單獨(dú)化療[34-35]。

此外，溶瘤腺病毒本身在刺激機(jī)體抗腫瘤免疫上有較大的優(yōu)勢(shì)，如腫瘤細(xì)胞溶解后釋放大量自身抗原，為刺激機(jī)體產(chǎn)生腫瘤抗原特異性免疫反應(yīng)提供了豐富的腫瘤抗原來源。利用溶瘤腺病毒作為載體，攜帶免疫調(diào)節(jié)基因或腫瘤相關(guān)抗原，感染腫瘤細(xì)胞后可作為腫瘤疫苗刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)該抗原的免疫反應(yīng)。因此，如何將重組腺病毒與腫瘤免疫治療有機(jī)地結(jié)合起來，以充分調(diào)動(dòng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，是重組腺病毒領(lǐng)域的一個(gè)重要研究方向[36]。

本課題組在腺病毒轉(zhuǎn)錄靶向調(diào)控方面開展了大量工作，建立了基于 Adeasy系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄靶向溶瘤腺病毒制備體系，并先后完成了具有端粒酶靶向和前列腺癌靶向溶瘤腺病毒的研制和體內(nèi)外評(píng)價(jià)工作[37]，目前，正在完善臨床前研究；此外，本課題組利用 Ad11p 腺病毒的 CD46 分子靶向作用，成功建立了具有造血細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞靶向的 Ad5/F11p 重組腺病毒系統(tǒng)[6, 38]。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步完善重組腺病毒靶向性策略，推動(dòng)腺病毒基因治療的臨床研究，將是我們下一步工作的重點(diǎn)。

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國家高技術(shù)發(fā)展研究計(jì)劃（863計(jì)劃）（2012AA020807）；國家自然科學(xué)基金（30901379）

楊月峰，Email：yuefengyang1981@163.com

2013-11-29

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.02.008