以丙氨酸消旋酶為靶點的高通量抗結核藥物篩選模型的建立及應用

周爽，蒙建洲，關艷，胡辛欣，司書毅，肖春玲

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以丙氨酸消旋酶為靶點的高通量抗結核藥物篩選模型的建立及應用

周爽，蒙建洲，關艷，胡辛欣，司書毅，肖春玲

100050 北京，中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)藥生物技術研究所國家新藥（微生物）篩選實驗室

建立以結核分枝桿菌丙氨酸消旋酶為靶點的新型高通量抗結核藥物篩選模型，篩選丙氨酸消旋酶的抑制劑，獲得以丙氨酸消旋酶為靶點的新型抗結核藥物先導物。

以結核分枝桿菌 H37Rv 基因組為模板，pET28a表達質粒為載體，將基因克隆至 pET28a，構建 pET28a::重組表達質粒，表達并純化得到重組結核分枝桿菌丙氨酸消旋酶；通過測定反應產(chǎn)物 NADH 在 340 nm 處光密度變化速率，檢測酶反應活性，構建并優(yōu)化該酶抑制劑的高通量篩選模型；應用該模型對化合物庫進行篩選；測定活性化合物 IC50以及對結核分枝桿菌的 MIC。

成功構建了結核分枝桿菌基因的表達載體；得到了純度較高的重組丙氨酸消旋酶，測得該酶的比活力為 13.53 kU/mg；所建立的丙氨酸消旋酶高通量篩選模型穩(wěn)定性高，符合高通量篩選的要求；通過對 70 000 個化合物進行篩選，得到了 5 個活性較高的化合物，其中，IMB-XZ5 對結核分枝桿菌的 MIC 為 4 ~ 8 μg/ml，且對結核分枝桿菌的作用具有較高的特異性。

建立了穩(wěn)定性好、靈敏度較高的結核分枝桿菌丙氨酸消旋酶抑制劑高通量篩選模型，應用該模型篩選得到了具有較好抗結核活性的丙氨酸消旋酶抑制劑。

丙氨酸消旋酶； 抗結核藥； 酶抑制劑； 高通量篩選

近年來結核病感染人數(shù)逐年攀升，2012 年全球結核病新增 860 萬人，結核病死亡人數(shù)約 130 萬人[1]。中國是結核病高負擔國家，多藥耐藥結核病以及與 HIV 結合感染情況的增加，使結核病疫情的防控面臨著更為嚴峻的挑戰(zhàn)?？焖傺邪l(fā)新型抗結核藥物，解決結核病治療所面臨的難題成為控制結核病疫情的當務之急。

針對已經(jīng)確認的靶點尋找全新結構抗結核新藥是最快捷而有效的途徑。丙氨酸消旋酶（alanine racemase，ALR）是已經(jīng)確認的抗結核藥物靶點，該酶可以催化 L-丙氨酸與 D-丙氨酸之間相互轉化[2-3]。D-丙氨酸是菌體細胞壁中肽聚糖合成的必需前體物質，而自然界中只存在天然來源的 L-丙氨酸，因此 L-丙氨酸進入菌體后必須通過 ALR 的催化作用生成 D-丙氨酸，用于細胞壁的合成[4]。ALR 廣泛存在于原核細胞中，且在不同的生物體中的相似性較高，氨基酸序列覆蓋率為 35% ~ 50%，在部分細菌中存在兩個編碼基因和，而結核分枝桿菌（，MTB）的基因組中只存在一個 ALR 的編碼基因[5]。由于人體細胞中不存在 ALR，所以針對 ALR 靶點的抗菌藥物在人體中具有高度的選擇性。

ALR屬于5-磷酸吡哆醛（pyridoxal 5'-phosphate，PLP）依賴型的異構酶家族，其活性構型是由兩個 43 kD 的單體組合而成的二聚體結構，每個單體中含有兩個活性結合位點：即 PLP 結合位點和丙氨酸結合位點[6]，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的 ALR 抑制劑中多數(shù)是以 PLP 結合位點為靶點的競爭性抑制劑，由于原核生物中 PLP 依賴型的酶普遍存在[7-8]，所以，以ALR 為靶點的藥物很可能是多靶點的。目前，作用于 ALR 的抗結核藥物 D-環(huán)絲氨酸（D-cycloserine，DCS）已應用于臨床，但由于其靶點不專一，毒副作用較大，臨床使用受到了限制[9]，且 DCS 的結構改造也沒有明顯改善其毒性[10-11]。因此，尋找針對 ALR 靶點的高效低毒的新型抗結核藥物具有重要的意義。

本研究通過體外重組表達獲得具有天然酶活性的 MTB ALR 蛋白，基于ALR 可以催化 L-丙氨酸和 D-丙氨酸之間互相轉化，利用其逆反應生成 L-丙氨酸，加入級聯(lián)反應酶 L-丙氨酸脫氫酶（L-alanine dehydrogenase，ALD）催化生成丙酮酸，同時將氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）還原為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH），ALR 活性的變化將導致 NADH 的光密度的變化。我們利用該原理建立并優(yōu)化了 MTB ALR 抑制劑的高通量篩選（HTS）模型，為針對以 ALR 為靶點的新型高效低毒的抗結核藥物的發(fā)現(xiàn)提供了一種快速有效的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 D-丙氨酸、L-丙氨酸、D-環(huán)絲氨酸、ALD、PLP、二甲基亞砜（DMSO）均購自美國 Sigma 公司；NAD 購自瑞士 Roche 公司；異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）購自美國 Merck 公司；CellTiter 96 AQuenous 單溶液細胞增殖檢測試劑盒（MTS檢測試劑盒）購自美國 Promega 公司；表達載體 pET28a 質粒本實驗室保存；蛋白質分子量標準購自加拿大 Fermentas 公司；引物合成和質粒測序由上海生工生物工程技術服務有限公司完成；DNA 分子量標準、大腸桿菌 DH5α 和 BL21(DE3)pLysS 菌株均購自北京全式金生物技術有限公司。

1.1.2 儀器 DNA Engine?PCR 儀、PowerPacTM蛋白垂直電泳槽、Gel DOC 凝膠成像系統(tǒng)均為美國 Bio-Rad 公司產(chǎn)品；His trapTMHP 親和層析柱、AKTA 蛋白純化儀均為美國 GE 公司產(chǎn)品；EnpireTM酶標儀為美國 Perkin Elmer 公司產(chǎn)品；LegendTMMACH1.6/R 離心機為美國 Thermo 公司產(chǎn)品；Uibra CellTM細胞超聲破碎儀為美國 Sonic 公司產(chǎn)品；Orion Model 828 型電子 pH 計為德國 Sartorius 公司產(chǎn)品；MCV-B161Sb 超凈工作臺為日本 Sanyo 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 MTB ALR 表達載體的構建 以 MTB H37Rv 基因組為模板，以ALR-PF：5' CGGATGAAACGGTTCTGGGAGAATGTCGGAAAGC 3'（下劃線為R I 酶切位點）和 ALR-PR：5' CATACCACGGTTTTCAGCCTCGCGA TAGGTCCT 3' 為引物（下劃線為d III 酶切位點），進行 PCR 擴增，條件為：95 ℃預變性5 min；98 ℃變性 20 s，70 ℃復性 15 s，72 ℃延伸 1.5 min，30 個循環(huán)；最后 72 ℃反應 8 min。PCR 產(chǎn)物用R I 和d III 雙酶切后與表達載體 pET28a 連接，轉化進入DH5α。用含50 mg/L 卡那霉素的 LB 平板篩選陽性克隆，將測序正確的質粒轉化進入BL21(DE3)pLysS，在含 50 mg/L 卡那霉素的 LB平板上篩選得到 ALR 蛋白穩(wěn)定表達的菌株?；静僮鲄⒁姺肿涌寺嶒炛改蟍12]。

1.2.2 MTB ALR 的表達與純化 挑取單菌落于 LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min 過夜培養(yǎng)，以 1:100 的比例接種于含 100 mmol/L 山梨醇的 LB 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至600約為0.6。加入 IPTG 至終濃度為 20 μmol/L，加入乳糖至終濃度為 5 mmol/L，16 ℃、200 r/min 誘導過夜。低溫離心收集菌體，加入裂解緩沖液（50 mmol/L NaH2PO4、300 mmol/L NaCl、30 mmol/L咪唑，pH 8.0），液氮-冰水反復凍融 5 次，再用細胞超聲破碎儀在 70% 能量下，以 3 s/8 s 破碎 100 個循環(huán)，8000 ×離心 10 min 后收集上清。利用 Ni+親和層析柱分離目的蛋白，上樣前加入 PLP 至終濃度 0.5 mmol/L，用洗脫緩沖液（50 mmol/L NaH2PO4、300 mmol/L NaCl、500 mmol/L 咪唑，pH 8.0）與裂解緩沖液按比例進行梯度洗脫，得到的純化產(chǎn)物用 SDS-PAGE 電泳進行檢測，純化的蛋白加入 PLP 至 0.1 mmol/L，置于–80 ℃下保存。

1.2.3 酶活測定及篩選條件的優(yōu)化 酶活檢測為 37 ℃下檢測反應體系在 340 nm 下光密度（340）隨時間的變化。酶活反應于 96 孔酶標板中進行，體系包括：100 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）、10 mmol/L NAD、0.1 U/ml ALD、10 mmol/L D-丙氨酸、0.3 μg ALR，終體積為 100 μl。分別在 4、25、30、34、37、42、48、52、58、65 ℃下處理30 min 后，進行 ALR 的活性測定。

篩選條件優(yōu)化的參數(shù)包括：反應溫度（28、31、34、37、40、45 ℃），反應pH值（2 ~ 11，間隔選取 17 個 pH 值），反應底物 NAD 濃度（20 ~ 0.16 mmol/L，二倍稀釋）和 D-丙氨酸濃度（20 ~ 0.16 mmol/L，二倍稀釋），級聯(lián)反應酶 ALD 濃度（0.4、0.3、0.2、0.15、0.1、0.075、0.05、0.025 U/ml），ALR 酶量（16.80 ~ 0.26 U，二倍稀釋）及 DMSO 比例（10%、8%、6%、4%、3%、2%、1%）。

Z'因子法是評價高通量篩選模型穩(wěn)定性的一種重要方法。根據(jù)公式計算Z' 因子值：

Z' = 1 – 3（SDn + SDp）/（Vn – Vp）。

其中 Vn 和 SDn 分別為陰性對照孔的酶反應速率平均值和標準差；Vp 和SDp 分別為陽性對照孔的酶反應速率平均值和標準差。

1.2.4 酶抑制劑的高通量篩選 以優(yōu)化后的反應條件進行篩選，每塊 96 孔酶標板上設 88 個待測樣品孔及 4 個陽性對照孔和 4 個陰性對照孔，其中陽性對照化合物為 DCS。每孔加入待測樣品終濃度為 20 μg/ml，在 37 ℃條件下檢測 40 min 內反應體系340的變化，計算酶的反應速率。利用反應速率計算樣品對 ALR 的抑制率（IR）：

IR（%）=（1 – VS/VN）× 100%

其中 VS代表待測樣品孔的酶反應速率；VN代表陰性對照孔的平均酶反應速率。

根據(jù)以上條件，我們對本所化合物庫中的70 000 余個化合物進行了初篩，選擇 IR ≥ 50% 的樣品作為活性樣品，并按照初篩的反應條件和反應方法進行復篩，根據(jù)復篩的結果確定化合物對 ALR 的抑制率。

1.2.5 活性化合物的特異性評價及 IC50測定 該模型的反應體系中存在兩步酶促反應，所以對具有抑制活性的化合物進行特異性評價，以排除假陽性樣品。反應中直接加入 L-丙氨酸作為反應底物，加入級聯(lián)反應酶 ALD 與篩選得到的抑制劑進行作用，利用優(yōu)化后的反應條件進行抑制活性的評價。

采用優(yōu)化后的反應條件測定抑制劑對 ALR 的 IC50值，化合物濃度為 200、100、50、25、12.5、6.25、3.12、1.56、0 μg/ml，計算出抑制率后使用 origin 8.1 分析各抑制劑的 IC50。

1.2.6 抗結核活性測定 于 96 微孔板中進行，用 7H9 培養(yǎng)基[含10% 的 ADC（白蛋白、葡萄糖、過氧化氫酶）、0.05% 的吐溫 80]對抑制劑進行二倍稀釋，終濃度分別為 128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.12 μg/ml，結核分枝桿菌的接種量約為2 × 105cfu/ml，稀釋菌液于 15 min 內接種完畢，于 37 ℃孵育 10 d 觀察結果。

1.2.7 活性化合物的細胞毒性及抗菌譜初步評價 選擇具有抗結核活性的化合物檢測對小鼠巨噬細胞 J774A.1 的細胞毒性。將新鮮傳代的J774A.1 細胞接種至 96 孔板中，每孔約 2 × 104個細胞，37 ℃、5% CO2環(huán)境下孵育至細胞貼壁，加入活性化合物至終濃度為 100、50、25、12.5、6.25、3.12、1.56、0.78 μg/ml，孵育 24 h，分別加入 10 μl MTS 檢測液孵育 2 h，480 nm 條件下檢測吸光度，使用 origin 8.1 分析化合物的 TC50。選取 20 株不同的菌株進行抗菌譜測定，同樣利用二倍稀釋法測定抑制劑對不同菌株的 MIC 值，評價化合物抗菌活性的特異性。

2 結果

2.1 ALR 表達載體的構建

PCR 產(chǎn)物經(jīng) 1% 的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，得到了長度為 1227 bp 的基因（圖 1）。通過菌落 PCR 選取陽性的轉化菌落，提取質粒 pET28a::，用雙酶切的方法進一步驗證（圖 2）。酶切鑒定正確的質粒進行序列測定，測序結果與 Genebank 中 H37Rv 的基因（Rv3423c，NC_000962.3）序列進行比對，比對結果一致。

bp 1 2 8000500030002000 1000750500 300150

Figure 1 PCR product of

bp 1 2 8000500030002000 1000750500 300150

Figure 2 Restriction enzymatic analysis of pET28a::

2.2 ALR 的表達和純化

對表達純化得到的重組 MTB ALR 蛋白進行SDS-PAGE 分析，相對分子質量約 48 kD，與理論預期一致。雖然大部分表達的 ALR 蛋白在沉淀當中，但上清經(jīng)純化后也可以看到明顯的目的條帶，并且為單一條帶（圖 3）。

kD1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 957255433426 1710

Figure 3 SDS-PAGE of expressed and purified ALR protein

2.3 酶活測定及酶穩(wěn)定性測定

ALR 酶活測定原理是應用吸光光度法檢測體系中反應產(chǎn)物 NADH 的濃度變化來反映 ALR 的酶活。結果表明，NADH 在低濃度范圍內與其340成線性關系（圖 4）。ALR 酶活力的定義：37 ℃反應條件下，每分鐘催化生成 1 μmol/L NADH 的酶量設定為 1 U。純化后 ALR 為 62.63 μg/ml，酶比活力為13.53 kU/mg。ALR 在 52 ℃以下處理 30 min 活性基本保持穩(wěn)定，52和58 ℃處理使酶活有所下降，65 ℃處理酶活下降明顯（圖 5）。

OD3403.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0 10 20 30 40 50 60 70 NADH 濃度 (mmol/L)Concentration of NADH (mmol/L)

Figure 4 Relationship between the concentration of NADH and340

反應速度（mmol/L?min）V0 (mmol/L?min)0.09 0.08 0.07 0.06 0.05 0.04 0.03 0.02 0 10 20 30 40 50 60 70 溫度（℃）Temperature (℃)

Figure 5 Stability of ALR

2.4 篩選條件的優(yōu)化及高通量篩選模型的評價

酶反應溫度在 37 ℃以下時，隨著溫度的升高，ALR 反應速度增加，40 ℃時反應速度有所下降，可能酶部分失活，45 ℃時反應速度小幅提升，但在 40 ℃和 45 ℃下酶反應速度波動誤差較大，可能是溫度的升高影響了模型及儀器的穩(wěn)定性，為保證模型穩(wěn)定性，選擇第一個峰值 37 ℃為篩選溫度。體系中 pH 大于 7 時，ALR 表現(xiàn)出酶活力，并隨著 pH 的升高酶活力逐漸增加，pH > 9 時，酶活力變化幅度減小，體系堿性過強可能影響篩選化合物的穩(wěn)定性，故篩選的 pH 確定為 8.5 ~ 9.0。隨著底物濃度的增加，酶反應速度逐漸提高達到平臺期，最佳D-丙氨酸濃度為10 mmol/L，最佳 NAD 濃度為 10 mmol/L，最佳 ALR 酶量為 4.2 U，最佳級聯(lián)反應酶 ALD 的濃度為 0.08 U/ml。DMSO 的濃度對 ALR 酶活力影響較小，1% 的 DMSO 對反應體系基本沒有影響（圖 6）。

目前廣泛使用的 HTS 模型的穩(wěn)定性和可靠性評估參數(shù)是 Z'因子，它是一個統(tǒng)計學參數(shù)，一般認為，如果 1 > Z' > 0.5，說明該篩選模型是比較理想的，適合于 HTS 的方法。本實驗中 HTS 的 Z'因子值為 0.76，且所有評價參數(shù)均符合 HTS 模型的標準（表 1）。因此，所建立的篩選方法是一種穩(wěn)定性和靈敏度都較好的 HTS 方法。

2.5 ALR 抑制劑的篩選及 IC50測定

采用建立的 HTS 篩選模型，對本所化合物庫內的 70 000 余個化合物進行篩選，得到 5 個抑制率≥ 50% 的化合物，且對二級酶聯(lián)反應中 ALD 抑制活性 < 30%，分別測定它們對 ALR 的 IC50，結果見表 2。

反應速度（mmol/L?min）V0 (mmol/L?min)0.120.110.100.090.080.070.060.050.04 反應速度（mmol/L?min）V0 (mmol/L?min)0.160.140.120.100.080.060.040.020–0.02 25 30 35 40 45 50 2 4 6 8 10 12 溫度（℃）Temperature (℃)A pH 值pH valueB

反應速度（mmol/L?min）V0 (mmol/L?min)0.080.070.060.050.040.030.020.010–0.01 反應速度（mmol/L?min）V0 (mmol/L?min)0.080.070.060.050.040.030.020.010–0.01 5 10 15 20 25 5 10 15 20 25 D-丙氨酸濃度（mmol/L）Concentration of D-alanine (mmol/L) C NAD 濃度（mmol/L）Concentration of NAD (mmol/L)D

反應速度（mmol/L?min）V0 (mmol/L?min)0.080.070.060.050.040.030.020.010–0.01 反應速度（mmol/L?min）V0 (mmol/L?min)0.140.120.100.080.060.040.020 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 5 10 15 20 LAD 濃度（U/ml）Concentration of LAD (U/ml)E ALR 蛋白的酶活力單位（U）Activity of ALR (U)F

反應速度（mmol/L?min）V0 (mmol/L?min)12 10 8 6 4 2 0 2 4 6 8 10 12 DMSO 濃度（%）Concentration of DMSO (%)G

Figure 6 Optimization of screening conditions (A: Optimization of temperature; B: Optimization of pH value; C: Optimization of D-alanine concentration; D: Optimization of NAD concentration; E: Optimization of LAD concentration; F: Optimization of enzyme concentration; G: Effect of DMSO concentration)

表 1 MTB ALR 高通量篩選體系的評價

表 2 活性化合物的酶抑制率、IC50及抗結核活性 MIC

2.6 ALR 抑制劑的生物學活性評價

2.6.1 ALR 抑制劑的抗結核活性測定 經(jīng)過 3次重復試驗，測定 ALR 抑制劑對敏感和耐藥MTB 的抑菌活性，其中有 3 個化合物表現(xiàn)出了一定的抗結核活性，化合物 IMB-XZ5 的抗結核活性最強，MIC = 4 ~ 8 μg/ml（表 2）。

2.6.2 活性化合物 IMB-XZ5 的細胞毒性評價 化合物 IMB-XZ5 的細胞毒性較低，100 μg/ml 濃度下仍未達到 50% 的細胞致死率，所以該化合物對 J774A.1 的 TC50大于 100 μg/ml。

2.6.3 活性化合物 IMB-XZ5 的抗菌譜測定 選取抗結核活性較好的化合物IMB-XZ5 進行抗菌譜測定，其對不同菌株的 MIC 如表 3 所示，該化合物對 MTB 的抗菌活性表現(xiàn)出了很好的特異性。

3 討論

ALR 是結核分枝桿菌自然狀態(tài)下生存所必需的，ALR 的缺失會使 MTB 在巨噬細胞及小鼠體內無法生存[13]，且人體中不需要 ALR 的功能存在，所以 ALR 一直是抗結核藥物開發(fā)的重要靶點，而 DCS 的臨床應用也進一步確證了 ALR 作為抗結核藥物靶點的可行性。但是臨床中以 ALR為靶點的抗結核藥物只有 DCS，且由于其毒性較大，在臨床使用中受到限制，只能作為二線藥物用于結核病的治療[9]。DCS 以及近年來發(fā)現(xiàn)的新型 ALR 抑制劑大多是 PLP 的拮抗劑，由于 PLP 依賴型的酶廣泛存在，所以抑制劑在作用過程中也并沒有很好的選擇性[6]。因此，尋找具有新型作用機制的 MTB ALR 抑制劑成為本研究的重點。

表 3 活性化合物 IMB-XZ5 對不同菌株的 MIC

為了建立 MTB ALR 抑制劑的 HTS 模型，我們構建了 MTB ALR 的重組表達載體，并純化得到了 ALR 可溶性蛋白。在蛋白純化過程中，我們發(fā)現(xiàn)在常規(guī)的誘導條件下，ALR 蛋白多數(shù)形成包涵體，可溶性差。為此我們優(yōu)化了蛋白表達條件，在培養(yǎng)基中加入山梨醇及乳糖，同時降低 IPTG 濃度，使誘導條件更加溫和。另外，優(yōu)化裂解液的 pH 值，加強菌體的破碎力度，使蛋白更好地釋放溶解。最終，我們得到了純度較高的可溶性 ALR。經(jīng)過酶活測定，ALR 可用于模型的高通量篩選。

本實驗依據(jù) ALR 可以催化 L-丙氨酸消旋生成 D-丙氨酸的逆反應，級聯(lián)L-丙氨酸在 LAD 的作用下生成丙酮酸，同時催化 NAD 還原生成 NADH，從而利用 NADH 的吸收特性對 ALR 蛋白的活性進行測定。通過對反應體系的溫度、pH、底物濃度、反應酶量、DMSO 等條件的優(yōu)化，建立了 ALR 抑制劑的 HTS 篩選模型，其 Z'因子值約為 0.76。通過對本所化合物庫中 70 000 個化合物的篩選，表明該模型具有快速、靈敏、穩(wěn)定等特點，為尋找和發(fā)現(xiàn) MTB ALR 的抑制劑提供了一種新的技術和方法。利用該模型，我們也發(fā)現(xiàn)了 5 個具有 ALR 抑制活性的化合物（抑制率 > 50%）。其中抑制活性最強的化合物 IC50值為 5.8 μmol/L。隨后我們對這 5 個抑制劑的抗結核活性進行了測定，發(fā)現(xiàn)其中有 3 個化合物表現(xiàn)出了一定的抗結核活性，抑制劑 IMB-XZ1、IMB-XZ2 和 IMB-XZ5 的抗結核 MIC 分別為 64、32 和 4 ~ 8 μg/ml。其中化合物 IMB-XZ5 的抗結核活性高于 DCS（MIC = 32 μg/ml），具有進一步研究的意義，而 IMB-XZ2 的酶抑制活性最高，但是抗結核活性較弱，可能與化合物的細胞通透性有關。對于酶抑制活性較強而抗結核活性不明顯的化合物，我們將對其進行一系列的結構改造，以改善其細胞通透性及抗菌活性。我們又進一步測定了 IMB-XZ5 對小鼠巨噬細胞的毒性及對其他菌株的抗菌譜特性，發(fā)現(xiàn)該化合物細胞毒性低，且對 MTB 具有很好的選擇性。鑒于已發(fā)現(xiàn)的多數(shù) ALR 抑制劑，包括二線抗結核藥物 DCS 均缺乏對 MTB 的選擇性，而我們得到的 IMB-XZ5 的抗結核活性強于 DCS，且毒性較低、特異性較強，所以，IMB-XZ5 具有很好的發(fā)展前景及研究意義。但是，由于該化合物對 MTB ALR 的酶抑制活性偏低，所以我們懷疑該化合物的作用靶點可能不專一，對于該化合物的作用機制和作用靶點的研究仍在進行中，同時其體內抗結核活性及藥代動力學性質也有待進一步研究。

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Establishment and application of a novel high throughput screening model targeting alanine racemase fromH37Rv

ZHOU Shuang, MENG Jian-zhou, GUAN Yan, HU Xin-xin, SI Shu-yi, XIAO Chun-ling

To establish a high throughput screening (HTS) model targeting(MTB) alanine racemase (ALR) for the discovery of novel antitubercular drugs and to determine inhibitory activities against MTB of the inhibitors.

The H37Rv ALR coding genewas amplified and cloned into pET28a expression vector. The recombinant ALR was expressed inBL21(DE3)pLysS and its activity was measured by detecting the absorption at 340 nm wavelength. HTS model was established based on the activity of ALR and Z' factor was used to evaluate the quality of HTS model. About 70 000 compounds were screened using this model and the IC50of inhibitors were determined. Inhibitory activities against H37Rv and some other bacteria strains of the inhibitors were also evaluated.

Recombinant H37Rvvector was successfully constructed and expressed, with the optimal enzymatic activity of ALR being 13.53 kU/mg. The parameters suggested that this HTS model was highly stable and feasible for HTS drug screening. Of the 70 000 compounds, 5 compounds appeared inhibitory activities to ALR in this HTS model. The inhibitor IMB-XZ5 was determined active against H37Rv with the MIC 4 - 8 μg/ml and the specificity was obvious.

A steady and sensitive HTS model for MTB ALR inhibitors was established. One of the ALR inhibitors was evaluated and has potential to become an active and specific anti-TB lead compounds.

Alanine racemase; Antitubercular agents; Enzyme inhibitors; High throughput screening

XIAO Chun-ling, Email: xiaocl318@163.com

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.02.006

“重大新藥創(chuàng)制”國家科技重大專項（2012ZX09301002- 003/001 014）

肖春玲，Email：xiaocl318@163.com

2013-12-16

Author Affiliation: The National Laboratory for Screening New Microbial Drugs, Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China