鞠瑞，陳晨，郭磊，李娟，葉菜英，張德昌

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羧胺三唑抑制腫瘤細胞誘導的巨噬細胞中腫瘤壞死因子-α的釋放

鞠瑞，陳晨，郭磊，李娟，葉菜英，張德昌

100005 北京，中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所藥理學系

觀察體外培養(yǎng)的腫瘤細胞對巨噬細胞炎癥因子——腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的誘導作用；初步探索羧胺三唑（CAI）對腫瘤誘導的巨噬細胞中 TNF-α 釋放的影響。

利用 transwell 裝置，建立 Lewis 肺癌細胞（LLC）與 RAW264.7 巨噬細胞共培養(yǎng)體系，采用熒光定量 PCR 方法和 ELISA 方法分別分析 RAW264.7 中 TNF-α 的表達和釋放；用 LLC 條件培養(yǎng)基（LCM）誘導 RAW264.7，同時給予 CAI 處理，采用 CCK-8 方法分析 LCM 和 CAI 對 RAW264.7 活力的影響，采用 ELISA 方法分析 CAI 對誘導后的 RAW264.7 中 TNF-α 釋放的影響。

與 LLC 共培養(yǎng) 24 h 可顯著增加RAW264.7 中 TNF-α 相對表達量[單獨培養(yǎng) vs 共培養(yǎng)，（1.00 ± 0.12）vs（2.23 ± 0.17），< 0.01]和釋放[單獨培養(yǎng) vs 共培養(yǎng)，（65.21 ± 12.76）vs （143.92 ± 19.22）pg/ml，< 0.05]；LCM 和 CAI 在 1 h 和 4 h 對 RAW264.7 活力沒有影響，CAI 可以顯著抑制 LCM 對RAW264.7 中 TNF-α 釋放的誘導（4 h，< 0.01）。

LLC 腫瘤微環(huán)境可以誘導 RAW264.7 中 TNF-α 的表達增加；CAI 對這種誘導的抑制使其在腫瘤環(huán)境中表現(xiàn)出一定的抗炎作用，可能是其抗腫瘤作用的機制之一。

腫瘤壞死因子 α； 巨噬細胞； 共培養(yǎng)； 羧胺三唑

巨噬細胞是一種易被周圍環(huán)境所誘導的細胞，大致可以被分為 M1 表型（經(jīng)典激活的巨噬細胞）和 M2 表型（替代激活的巨噬細胞）。在對腫瘤的影響方面，一般認為 M1 巨噬細胞能夠分泌大量促炎介質(zhì)，具有殺傷腫瘤細胞的功能；而 M2 巨噬細胞則參與組織重塑和創(chuàng)傷修復過程，分泌促炎介質(zhì)減少，具有促進腫瘤發(fā)展的作用[1]。

腫瘤組織中浸潤的巨噬細胞，即腫瘤相關(guān)巨噬細胞（TAM），其主要細胞因子的釋放特征被認為與 M2 巨噬細胞相似。然而，TAM 不能被簡單等同于 M2 巨噬細胞，它也有 M1 巨噬細胞的某些特征，也能通過長期釋放低濃度的促炎介質(zhì)在腫瘤微環(huán)境中引起“并不劇烈”的炎癥反應(yīng)[2-3]。這些低濃度的促炎介質(zhì)成為腫瘤細胞的生長信號，在腫瘤細胞的增殖、血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移等各個環(huán)節(jié)促進腫瘤的發(fā)展。在 TAM 釋放的多種促炎介質(zhì)中，腫瘤壞死因子-α（TNF-α）能夠調(diào)控多種炎癥介質(zhì)和促血管生成因子的合成，扮演關(guān)鍵角色[4]。

羧胺三唑（CAI）是一種非細胞毒類的抗癌藥物，對多種腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移有抑制作用[5-7]。除此之外，CAI 還在多種急慢性和免疫性炎癥的動物模型中表現(xiàn)出抗炎作用。其抗炎作用主要歸因于對炎癥組織和致炎動物腹腔巨噬細胞中 TNF-α 等炎癥介質(zhì)釋放的抑制[8-9]。

在本項實驗中，將腫瘤細胞（或其條件培養(yǎng)基）與巨噬細胞進行共培養(yǎng)，觀察腫瘤環(huán)境對巨噬細胞中 TNF-α 表達和釋放的影響，并在此基礎(chǔ)上檢測 CAI 對該誘導模型中 TNF-α 釋放的影響，補充說明其在腫瘤微環(huán)境中同樣具有抗炎作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系 RAW264.7 巨噬細胞購自中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所細胞中心。Lewis 肺癌細胞（LLC）購自中國科學院上海生科院細胞資源中心。

1.1.2 試劑 DMEM 高糖培養(yǎng)基、谷氨酰胺、青霉素和鏈霉素購自中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所細胞中心；胎牛血清購自美國 Gibco 公司；CAI 由中國醫(yī)學科學院藥物研究所提供；CCK-8 試劑購自日本同仁化學研究所；TNF-α ELISA 試劑盒購自上海依科賽生物制品有限公司；mRNA 提取試劑盒購自北京百泰克試劑公司；Oligo(dT)18和 M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶購自美國 Promega 公司；SYBR Green I 熒光定量 PCR 試劑盒購自杭州博日科技有限公司；TNF 和 β-actin 引物購自上?；瞪锛夹g(shù)有限公司。

1.1.3 裝置和儀器 Transwell（0.4 μm）、0.22 μm 濾器購自美國 Millipore 公司；酶標儀 Synergy 4 為美國基因公司產(chǎn)品；熒光定量 PCR 儀 IQ 5 為美國 Bio-Rad 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 RAW264.7 細胞和 LLC 細胞培養(yǎng) RAW264.7 和 LLC 細胞用 DMEM 高糖培養(yǎng)基（加入 10% 胎牛血清、1% 谷氨酰胺、50 mg/ml 青霉素和100 mg/ml 鏈霉素）在 37 ℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)。

1.2.2 RAW264.7 細胞和 LLC 細胞共培養(yǎng) 收集處于對數(shù)生長期的 LLC 細胞，以 5 × 104個/孔的數(shù)量接種至嵌入 24 孔板的 transwell 上室中。收集處于對數(shù)生長期的 RAW264.7 細胞，以 6 × 105個/孔的數(shù)量接種于 24 孔板中。待 transwell 中 LLC 細胞貼壁后，將 transwell 嵌入至生長有 RAW264.7 細胞的孔中。以 LLC 細胞單獨培養(yǎng)、RAW264.7 細胞單獨培養(yǎng)作為對照。共培養(yǎng) 24 h。

1.2.3 LLC 細胞條件培養(yǎng)基收集和誘導 收集處于對數(shù)生長期的 LLC 細胞，將 5 × 105個細胞接種至 T75 培養(yǎng)瓶中。待細胞生長 5 d 后，收集 T75 中的培養(yǎng)上清，過 0.22 μm 濾器除去上清中的 LLC 細胞，處理后的培養(yǎng)上清為 LLC 條件培養(yǎng)基（LCM）。收集處于對數(shù)生長期的 RAW264.7 細胞，以 6 × 105個/孔的數(shù)量接種于 24 孔板中。以 50% LCM（50% LCM + 50% 新鮮培養(yǎng)基）培養(yǎng) RAW264.7 細胞，同時給予 CAI 20 μmol/L 分別處理 1、2 和 4 h。以完全新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)的 RAW264.7 細胞作為對照。

1.2.4 CCK-8 測定 RAW264.7 細胞活力 在 RAW264.7 細胞和 LLC 細胞共培養(yǎng)實驗和 LCM 誘導實驗中，收集各組上清后，細胞以 PBS 洗2 次，然后向各孔加入 500 μl PBS 和 50 μl CCK-8 試劑，混勻后在 37 ℃、5% CO2環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)1 h。然后將各孔上清轉(zhuǎn)移至 96 孔板中，測定450 nm 處吸光度。

1.2.5 ELISA 測定 TNF-α 釋放 收集RAW264.7細胞和 LLC 細胞共培養(yǎng)實驗和 LCM誘導實驗中各組的上清，用 ELISA 試劑盒測定上清中 TNF-α 的含量。

1.2.6 RT-PCR 測定 TNF-α 表達 用 mRNA 提取試劑盒提取 RAW264.7 細胞和 LLC 細胞共培養(yǎng)實驗中各組RAW264.7 細胞的 mRNA 。經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后，用 SYBR Green I 熒光定量 PCR 試劑盒對 TNF-α 進行擴增。TNF-α 正向引物：5' GTCTACTG AACTTCGGGGTGAT 3'；TNF-α 反向引物：5' CAC TTGGTGGTTTGCTACGAC 3'。β-actin 正向引物：5' CCTGAGGCTCTTTTCCAGCC 3'；β-actin 反向引物：5' TAGAGGTCTTTACGGATGTCAACGT 3'。用 Biorad IQ 5 進行檢測和分析。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 與 LLC 細胞共培養(yǎng)后，RAW264.7 細胞中 TNF-α 表達明顯增加

提取 RAW264.7 細胞和 LLC 細胞共培養(yǎng)實驗中各組 RAW264.7 細胞的 mRNA，進行反轉(zhuǎn)錄和熒光定量 PCR。結(jié)果顯示，與 LLC 共培養(yǎng) 24 h 的 RAW264.7 細胞中 TNF-α 表達顯著增加。單獨培養(yǎng)的 RAW264.7 細胞中 TNF-α 相對表達量為（1.00 ± 0.12），共培養(yǎng)組 RAW264.7 細胞中 TNF-α 相對表達量為（2.23 ± 0.17），< 0.01（圖 1）。

TNF-α 表達倍數(shù)Fold expression of TNF-α3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0 LLC– LLC+

Figure 1 Relative fold expression of TNF-α in RAW264.7 single cultured or co-cultured with LLC for 24 h (**< 0.01)

2.2 與 LLC 細胞共培養(yǎng)后，RAW264.7 細胞中 TNF-α 釋放明顯增加

RAW264.7 細胞和 LLC 細胞共培養(yǎng)實驗中，單獨培養(yǎng)及與 LLC 共培養(yǎng) 24 h 的 RAW264.7 活力無明顯差別（圖 2A）。培養(yǎng) 24 h 后收集各組上清，進行 ELISA 測定。結(jié)果顯示，LLC 細胞本身釋放的 TNF-α 水平很低，為（5.97 ± 2.35）pg/ml；但是 LLC 能夠顯著促進 RAW264.7 細胞中 TNF-α 的釋放：單獨培養(yǎng)和共培養(yǎng)的 RAW264.7 細胞釋放的 TNF-α 水平分別為（65.21 ± 12.76）和（143.92 ± 19.22）pg/ml，< 0.05（圖 2B）。這兩部分結(jié)果顯示，LLC 細胞使 RAW264.7 細胞中 TNF-α 表達和分泌水平增加幅度相似，表明 LLC 細胞通過某種機制主要在表達水平誘導 RAW264.7 細胞中 TNF-α 增加。

2.3 CAI 顯著抑制 LCM 誘導的 RAW264.7 細胞中 TNF-α 的釋放

受到腫瘤細胞誘導的炎性細胞，如巨噬細胞，釋放 TNF-α 增加。但這種誘導對 TNF-α 的增加程度較低，不但不會殺傷腫瘤細胞，反而成為腫瘤細胞生長的有利因素。上述共培養(yǎng)實驗采用 transwell 裝置將兩種細胞置于一個體系中，兩者只有培養(yǎng)基的交流，并不直接接觸。因此 LLC 是通過其釋放在培養(yǎng)基中的物質(zhì)對 RAW264.7 進行誘導的。我們接下來使用 LLC 的條件培養(yǎng)基（LCM）對 RAW264.7 進行誘導，在 1 h 和 4 h 時間點，LCM 以及 CAI 對細胞活力沒有明顯影響（圖 3A），LCM 同樣可以促進 RAW264.7 中 TNF-α 的釋放，并且 CAI 能夠有效抑制 LCM 誘導導致的 TNF-α 增加（圖 3B）。

OD450 1.6 1.2 0.8 0.4 0 腫瘤壞死因子-α 含量（pg/ml）TNF-α (pg/ml)200 160 120 80 40 0 LLC– LLC+A LLC LLC– LLC+ RAW264.7B

Figure 2 Cell viability (A) and TNF-α secretion (B) of RAW264.7 single cultured or co-cultured with LLC for 24 h (**< 0.01)

OD450 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 腫瘤壞死因子-α（pg/ml）TNF-α (pg/ml) 120 100 80 60 40 20 0 1 4 1 2 4 時間（h）Time (h)A 時間（h）Time (h)B

Figure 3 The effect of LCM and CAI on RAW264.7 viability (A) and TNF-α secretion (B) within 4 hours

3 討論

TAM 在腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程中發(fā)揮重要作用。它兼具 M1 表型和 M2 表型巨噬細胞的標記物，通過調(diào)節(jié)各種促炎、抗炎介質(zhì)的平衡扮演腫瘤“幫兇”的角色[2]。在腫瘤發(fā)生、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成的各個環(huán)節(jié)中，TAM 釋放的 TNF-α 均發(fā)揮重要作用[4]。TAM 經(jīng)腫瘤微環(huán)境誘導生成的 TNF-α 水平遠低于經(jīng)典激活（如脂多糖刺激）的巨噬細胞釋放的 TNF-α 水平。而正是這種“并不劇烈”的炎癥反應(yīng)，不但不會殺傷腫瘤細胞，反而成為腫瘤細胞的生長信號。目前認為 TNF-α 促進腫瘤發(fā)展的機制主要有以下幾點：①通過影響活性氧破壞 DNA，并抑制 DNA 的修復；②通過旁分泌方式成為腫瘤細胞生存信號；③通過誘導基質(zhì)金屬蛋白酶誘導組織的重塑；④通過調(diào)控趨化因子及其受體控制淋巴細胞的浸潤；⑤通過誘導促血管生成因子促進血管的形成；⑥促進腫瘤產(chǎn)生對細胞毒類藥物的耐藥；⑦促進腫瘤惡液質(zhì)發(fā)生等。

在本項研究中，我們首先建立 LLC 細胞與 RAW264.7 細胞共培養(yǎng)的模型，確定了前者對后者 TNF-α 表達和釋放的促進作用和促進的程度。經(jīng)過與 LLC 共培養(yǎng)，RAW264.7 中 TNF-α 釋放顯著增加，但是遠低于脂多糖的刺激作用，這一點與目前對腫瘤炎性微環(huán)境的認識一致。由于已知 CAI 在多種炎癥模型中表現(xiàn)出下調(diào) TNF-α 的作用，我們在該模型的基礎(chǔ)上檢測了 CAI 對腫瘤微環(huán)境中 TNF-α 含量的影響，發(fā)現(xiàn) CAI 在所設(shè)時間點均顯著抑制 LLC 對 TNF-α 的誘導作用。

目前，通過拮抗 TNF-α 進行抗腫瘤治療已被廣泛認可。Infliximab 和 etanercept 治療腫瘤的I期和II期臨床研究發(fā)現(xiàn)它們能有效控制晚期患者的病情[10-12]。一些研究也已經(jīng)證實，能夠下調(diào) TNF-α 的沙利度胺對多發(fā)性骨髓瘤、腎細胞癌、前列腺癌、黑色素瘤、膠質(zhì)瘤和 Kaposi 肉瘤有抑制作用[13-15]。

CAI 在多種移植瘤模型中表現(xiàn)出抗癌作用，并且其抗癌治療已進入臨床試驗階段。本項研究結(jié)果顯示，除直接抑制腫瘤細胞的生長外，CAI 還能抑制 TAM 中炎癥介質(zhì)——TNF-α 的釋放，這可能是其抗腫瘤作用的另一個機制。利用這一作用，我們可嘗試將 CAI 與其他抗炎藥物聯(lián)合使用，觀察其抑制 TNF-α 和腫瘤生長的效果能否得到增強。這將是優(yōu)化 CAI 抗癌作用的一個比較理想的思路，可能會有可觀的應(yīng)用前景。

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Carboxyamidotriazole inhibits the tumor necrosis factor-α secretion from the tumor cells-induced macrophages

JU Rui, CHEN Chen, GUO Lei, LI Juan, YE Cai-ying, ZHANG De-chang

To investigate the tumor necrosis factor-α (TNF-α) expression and secretion enhancement in macrophages induced by tumor cells, as well as the inhibitory effect of carboxyamidotriazole (CAI) on TNF-α induction in tumor-educated macrophages.

The Lewis lung carcinoma (LLC) cells and RAW264.7 macrophages were co-cultured with the transwell inserts, LLC conditioned medium (LCM) was also used to induce RAW264.7 with or without CAI treatment. Real time RT-PCR and ELISA methods were applied to analyze the TNF-α expression and secretion in RAW264.7, respectively. CCK-8 was applied to determine the effect of LLC (LCM) and CAI on the viability of RAW264.7.

TNF-α expression [cultured alone vs co-cultured, (1.00 ± 0.12) vs (2.23 ± 0.17),< 0.01] and secretion [cultured alone vs co-cultured, (65.21 ± 12.76) vs (143.92 ± 19.22) pg/ml,< 0.05] were greatly increased in RAW264.7 after being co-cultured with LLC for 24 hours. LCM and CAI did not influence the viability of RAW264.7 at 1 hour and 4 hour, while CAI inhibited TNF-α secretion in RAW264.7 induced by LCM (4 h,< 0.01).

LLC tumor environment can greatly enhance the TNF-α expression in RAW264.7. CAI inhibits this induction significantly and shows anti-inflammation activity in tumor environment, which may contribute to its anti-cancer effects.

Tumor necrosis factor-alpha; Macrophages; Co-culture; Carboxyamidotriazole

ZHANG De-chang, Email: zhangdechang45@vip.sina.com; YE Cai-ying, Email: caiyingye@126.com

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.02.007

“十二五”國家科技重大專項（2014ZX09507003-003）；國家自然科學基金（81201728）；高等學校博士學科點專項科研基金新教師類（20121106120019）

張德昌，Email：zhangdechang45@vip.sina.com；葉菜英，Email：caiyingye@126.com

2013-12-26

Author Affiliation: Department of Pharmacology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100005, China