段須杰，任彤，羅厚勇，劉睿，徐衛(wèi)濤

近年來，具有靶向明確，副作用小等優(yōu)勢的抗體藥物受到國內(nèi)外藥企的廣泛關(guān)注。2012年，抗體藥物全球銷售額已達 650 億美元左右，并占據(jù)全球十大暢銷藥物的半壁江山[1]。

動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)和抗體質(zhì)量分析已然成為我國抗體藥物產(chǎn)業(yè)化的主要限制因素[2]。培養(yǎng)基優(yōu)化作為動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，長期被國外生物技術(shù)公司（如Thermo Fisher 公司、Sigma 公司等）、醫(yī)藥巨頭所壟斷。盡管目前國內(nèi)抗體藥物的表達水平有顯著提高（1～2 g/L），但仍以使用商業(yè)培養(yǎng)基為主，缺乏自主知識產(chǎn)權(quán)的產(chǎn)品。由于對所使用的培養(yǎng)基成分未知，一旦出現(xiàn)抗體質(zhì)量問題便無從優(yōu)化，特別對于生物仿制藥開發(fā)而言，抗體質(zhì)量的一致性顯得尤為重要。與此同時，使用商業(yè)化培養(yǎng)基還需承擔(dān)較高的開發(fā)成本，往往是自主開發(fā)培養(yǎng)基成本的 5～10 倍。

1 生產(chǎn)用動物細胞概述

對于抗體藥物而言，為了滿足其生物活性，需要對蛋白質(zhì)進行正確的折疊和翻譯后修飾，因此用于抗體生產(chǎn)用宿主細胞以哺乳動物細胞為主。迄今為止，在已批準(zhǔn)的抗體藥物中，所使用的動物細胞主要包括 CHO 細胞、NS0 細胞和SP2/0 細胞，其中 CHO 細胞作為生產(chǎn)用宿主細胞達到50% 左右，NS0 細胞達到 20% 以上[3]。

CHO 細胞是 1957年 Tjio 和 Puck 將原代培養(yǎng)的中國倉鼠卵巢細胞永生化獲得的，包括 K1、DG44 和DUXB11 三種。其中，DG44 和 DUXB11 細胞由于不具有二氫葉酸還原酶（dihydrofolate reductase，DHFR）活性，需要添加甘氨酸、次黃嘌呤和胸苷才能正常生長。因此兩者通常采用 DHFR 篩選系統(tǒng)獲得生產(chǎn)用細胞株。而 CHOK1 則恰恰相反，常與谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）篩選系統(tǒng)聯(lián)用。

NS0 細胞是由 Galfr 和 Milstein 于 1981年獲得的一株不合成分泌免疫球蛋白重鏈或輕鏈的鼠骨髓瘤細胞。與CHO 細胞相比，NS0 細胞更傾向于凋亡，可能是由于營養(yǎng)物耗竭或者培養(yǎng)微環(huán)境產(chǎn)生的壓力所造成[4]。此外，NS0 細胞為膽固醇營養(yǎng)缺陷型，因此在培養(yǎng)過程中需要添加膽固醇以維持細胞正常生長。由于 NS0 細胞內(nèi)源 GS 缺乏活性，因而常與 GS 篩選系統(tǒng)聯(lián)用獲得穩(wěn)定高產(chǎn)的細胞株。

從表達抗體質(zhì)量的角度來看，CHO 細胞生產(chǎn)的抗體與人類自身抗體更為接近，而采用 NS0 或 SP2/0 細胞所表達的抗體則會產(chǎn)生非人源的糖基化修飾，如 α(1,3)-半乳糖結(jié)構(gòu)和 N-羥乙?；窠?jīng)氨酸（N-glycolyl neuraminic acid，NGNA）唾液酸結(jié)構(gòu)，在人體內(nèi)會產(chǎn)生免疫原性，因而近年來較為少用[3]。值得一提的是，CHO 細胞的內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒不易傳播人類，而 NS0 細胞則可能產(chǎn)生傳染性反轉(zhuǎn)錄病毒[4]。

除此之外，PER.C6 細胞作為一種新型的宿主細胞已用于表達抗體藥物，并能夠獲得與人類更為接近的糖基化結(jié)構(gòu)。但到目前為止，采用 PER.C6 細胞生產(chǎn)的多種候選抗體藥物仍處于臨床研究階段。

2 培養(yǎng)基組分及功能

由于動物細胞對營養(yǎng)物質(zhì)、培養(yǎng)環(huán)境的要求較為苛刻，培養(yǎng)基一般包括 60～80 種營養(yǎng)物質(zhì)，某些培養(yǎng)基組分甚至超過 100 種。除此以外，不同種類的動物細胞對于培養(yǎng)基組分的要求也不盡相同，而且組分的改變也會對抗體的質(zhì)量產(chǎn)生顯著影響。因此，如何依據(jù)動物細胞種類，通過培養(yǎng)基優(yōu)化以滿足抗體產(chǎn)量和質(zhì)量的“雙重要求”成為抗體產(chǎn)業(yè)化過程中亟待解決的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

2) 在救助實踐中，救助船舶無害通行權(quán)成立和行使的困境、救助船舶進入領(lǐng)海搜尋之禁止、救助船舶越過他國領(lǐng)海所必須履行的通知義務(wù)并接受沿海國合法的管理與安排等情形都是這種縱向競合的直接體現(xiàn)。

本文將以介紹 CHO 細胞和 NS0 細胞培養(yǎng)基為主，逐一闡述動物細胞培養(yǎng)基成分及其相應(yīng)作用，為開發(fā)適合動物細胞的“個性化培養(yǎng)基”提供理論指導(dǎo)。

2.1 水

水是培養(yǎng)基的重要組分之一，卻往往被研究人員所忽視，培養(yǎng)基用水品質(zhì)的好壞將直接影響到細胞的生長狀態(tài)。水中的污染物主要包括無機物、有機物、細菌產(chǎn)物（內(nèi)毒素）、顆粒等。無機物包括重金屬、鐵、鈣、氯等。有機物主要是植物腐敗的副產(chǎn)物和洗滌劑。因此培養(yǎng)基用水必須經(jīng)過高度純化獲得。一般而言，培養(yǎng)基采用注射用水或者采用同級別的超純水進行配制。

2.2 碳水化合物

葡萄糖是培養(yǎng)基中最常使用的碳水化合物，用于提供能源。然而，葡萄糖代謝會產(chǎn)生對細胞生長和抗體合成重要影響的副產(chǎn)物——乳酸。通過控制葡萄糖濃度或者采用其他能源物質(zhì)（如半乳糖、果糖等）可以降低培養(yǎng)過程中的乳酸產(chǎn)量，但可能會對抗體的糖基化類型產(chǎn)生影響，進而影響抗體在體內(nèi)的生物活性[5-7]。此外，也有文獻報道通過在培養(yǎng)基中添加丙酮酸代替谷氨酰胺作為能源物質(zhì)，可以降低乳酸和氨的產(chǎn)量[8]。

2.3 氨基酸

構(gòu)成生物體蛋白質(zhì)的氨基酸約 20 種，大體可分為必需氨基酸（essential amino acid，EAA）和非必需氨基酸（nonessential amino acid，NEAA），它們不僅用于合成蛋白質(zhì)，同時還通過氨基酸代謝途徑提供能源。由于不同種類的動物細胞甚至同一類別的不同克隆對于氨基酸的代謝情況都可能完全不同，因此，對于培養(yǎng)基中氨基酸的優(yōu)化顯得尤為重要，不但要保證各種氨基酸濃度的平衡，同時要避免因某種氨基酸消耗殆盡，導(dǎo)致細胞生長停止或者凋亡[9]。

谷氨酰胺作為重要的能源物質(zhì)，同時還是嘌呤、嘧啶的合成前體，對于非 GS 表達系統(tǒng)的細胞（如 CHO-DHFR 細胞）生長十分重要，主要是由于細胞內(nèi)源 GS 基因表達水平較低所致。而對于GS 表達系統(tǒng)的細胞（如 GS-CHO 和GS-NS0）而言，谷氨酰胺則無需添加至培養(yǎng)基。除此以外，還應(yīng)根據(jù)具體的細胞株特性來有選擇地添加氨基酸，例如有些 CHO 細胞屬于脯氨酸缺陷型，因此需將脯氨酸作為EAA 添加至培養(yǎng)基中。

2.4 維生素

維生素是維持細胞正常生理狀態(tài)的一種重要的生物活性化合物，在細胞中多形成酶的輔基或輔酶。維生素分為水溶性和脂溶性兩類。水溶性維生素主要指 B 族維生素，包括硫胺素（B1）、核黃素（B2）、煙酰胺（B3）、泛酸（鈣）（B5）、吡哆醇（醛）（B6）、生物素（B7）、葉酸（B9）和氰鈷胺素（B12）。脂溶性維生素主要有維生素 A、維生素 D、維生素 E 和維生素 K。與脂溶性維生素相比，水溶性維生素能夠更好維持細胞生長并保證較高的活率[10]。此外，維生素 C 或維生素 E 通常作為抗氧化劑添加至培養(yǎng)基中，但對細胞生長或者抗體合成影響較小[11]。

2.5 無機鹽及微量元素

培養(yǎng)基中的無機鹽包括 Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cl–、、、等。其中，Na+、K+和 Cl–負責(zé)調(diào)節(jié)許多營養(yǎng)物質(zhì)和大分子的跨膜運輸；Mg2+是細胞間質(zhì)的重要組分，同時還是酶反應(yīng)的輔因子；Ca2+參與細胞生理活動，并調(diào)節(jié)細胞膜功能；主要起到 pH 緩沖作用。deZengotita 等[12]研究發(fā)現(xiàn)通過流加 NaH2PO4可以顯著提高 GS-NS0 細胞密度，可能是由于磷元素是細胞磷脂、DNA 和 RNA 的重要組成部分。

微量元素主要包含鐵、銅、鋅、硒、錳等。鐵是一種必需元素，因為鐵涉及眾多參與 DNA 復(fù)制和細胞代謝的酶，鐵缺陷會引起細胞周期停滯在 G0 或者 G1 期，甚至使快速分裂的細胞發(fā)生凋亡[13]。銅離子作為培養(yǎng)基中重要的氧化劑，對抗體質(zhì)量（二硫鍵形成、C 末端降解、唾液酸含量等）、細胞代謝（細胞密度、乳酸含量等）都會產(chǎn)生重要影響[14-15]。鋅作為胰島素的替代物，在無蛋白培養(yǎng)基開發(fā)中得到廣泛應(yīng)用[16]。硒元素則是谷胱甘肽過氧化物酶的輔因子，能夠保護細胞不受活性氧的傷害[17]。錳元素作為一系列糖基轉(zhuǎn)移酶重要輔因子，在抗體糖基化過程中起到關(guān)鍵作用，改變培養(yǎng)基中 Mn2+濃度可以顯著影響抗體的糖基化特征[18]。

2.6 脂類及前體

脂類是細胞膜的重要組成部分。由于磷脂、脂肪酸和膽固醇共同影響細胞膜的流動性，氯化膽堿、肌醇、乙醇胺、油酸、亞油酸等物質(zhì)常以脂類前體形式添加至培養(yǎng)基中用于合成細胞膜。與 CHO 細胞不同，NS0 細胞通常為膽固醇缺陷型，因此在 NS0 細胞培養(yǎng)中常將膽固醇以脂類混合物的形式添加，但是脂類的添加有可能會改變蛋白的糖基化特征[19-20]。此外，Li 等[4]通過在培養(yǎng)過程中添加 5-氮雜胞苷使得 NS0 細胞成為膽固醇非依賴性細胞，抗體產(chǎn)量達到4.5 g/L。

2.7 核苷

動物細胞一般可以通過從頭合成途徑合成核苷酸，因此一般情況下不需要在培養(yǎng)基中添加外源核酸類物質(zhì)。但對于從頭合成途徑受阻的細胞（DHFR 缺陷型細胞）就必須添加補救途徑的底物——次黃嘌呤和胸苷。Chen 等[21]研究發(fā)現(xiàn)每 5 mg/L 胸苷中添加 10 mg/L 次黃嘌呤能夠顯著促進CHO 細胞生長。Carvalhal 等[22]在培養(yǎng)基中添加 1 mmol/L腺嘌呤或鳥嘌呤會造成 CHO 細胞生長嚴(yán)重抑制，而相同濃度的尿嘧啶或胞嘧啶則對細胞生長沒有影響。此外，核苷類物質(zhì)的添加還可能對抗體的糖基化特征產(chǎn)生影響，因此在培養(yǎng)基優(yōu)化時需特別注意[23]。

2.8 生長因子及轉(zhuǎn)運蛋白

胰島素和胰島素樣生長因子-1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）常添加至培養(yǎng)基中，兩者均能夠刺激葡萄糖利用，以及 RNA、蛋白質(zhì)和磷脂的合成。Rouiller 等[24]通過添加糖皮質(zhì)激素（氫化可的松）可以顯著提高 CHO 細胞活率并提高蛋白產(chǎn)量，而 Jing 等[25]通過添加地塞米松在提高糖蛋白的唾液酸含量方面取得了成功。

轉(zhuǎn)鐵蛋白是一種常用的糖蛋白，能夠結(jié)合鐵，與鐵向細胞的傳遞密切相關(guān)。由于轉(zhuǎn)鐵蛋白成本較高，人們逐漸采用鐵螯合劑來代替轉(zhuǎn)鐵蛋白。Zhang 等[26]發(fā)現(xiàn)檸檬酸鐵和亞硒酸鈉的復(fù)合物能夠有效地代替轉(zhuǎn)鐵蛋白。陳飛[27]認為在無血清培養(yǎng)基中沒有檸檬酸鐵存在時，即使添加高濃度的轉(zhuǎn)鐵蛋白也不能有效支持 CHO 細胞生長和抗體表達，也就是說檸檬酸鐵在支持 CHO 細胞生長方面具有轉(zhuǎn)鐵蛋白不可替代的作用。

2.9 其他物質(zhì)

2.9.1 還原劑 還原型谷胱甘肽和巰基乙醇通常作為還原劑添加至培養(yǎng)基中，可以保護細胞免受活性氧損傷，對維持細胞活率起到一定作用。

2.9.2 保護劑 Pluronic F68、甲基纖維素和聚乙烯醇常作為保護劑加入培養(yǎng)基中，可減少細胞與氣泡間的黏附力，避免由于氣泡破裂對細胞造成的損傷[28]。

2.9.3 誘導(dǎo)劑 丁酸鈉作為一種誘導(dǎo)劑，常添加至培養(yǎng)基中用于提高抗體產(chǎn)量[29]，但是丁酸鈉的加入可能對抗體的糖基化形式也會有影響。Borys 等[30]通過添加丁酸鈉顯著降低了 NGNA 的含量。

3 培養(yǎng)基開發(fā)策略及手段

3.1 培養(yǎng)基開發(fā)策略

盡管 CHO 細胞和 NS0 細胞對于培養(yǎng)基組分的要求有所不同，但是都需要添加數(shù)十種組分來維持細胞的正常生長和抗體表達。與此同時，進行培養(yǎng)基優(yōu)化時不僅需要考慮單一組分的影響，還要關(guān)注組分間還可能存在的交互作用，這就使得培養(yǎng)優(yōu)化成為耗時且復(fù)雜的工作。因此，選擇合適的培養(yǎng)基開發(fā)策略及手段將直接決定培養(yǎng)基的開發(fā)時間和最終效果。對于動物細胞的培養(yǎng)基開發(fā)策略大體相同，主要分為基礎(chǔ)培養(yǎng)基開發(fā)和流加培養(yǎng)基開發(fā)兩個階段。

3.1.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基開發(fā)策略 基礎(chǔ)培養(yǎng)基是以支持并促進細胞生長為目的，其開發(fā)策略可以分兩類：自下而上（Bottom-Up）和自上而下（Top-Down）[31]。Bottom-Up 策略是指分別考察單一組分不同濃度對細胞生長和產(chǎn)物合成的影響。該策略由于需要逐一考察每個組分的影響，因此需要大量試驗且非常耗時。而 Top-Down 策略則是將培養(yǎng)基首先分成若干“亞類”（subgroup），針對“亞類”進行篩選和組合，而后針對“亞類”內(nèi)組分進行優(yōu)化。Ma 等[32]通過Top-Down 策略成功開發(fā)了適合 CHO 細胞和 NS0 細胞的化學(xué)成分明確的培養(yǎng)基。需要指出的是，無論通過何種策略開發(fā)出的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，往往需要與流加培養(yǎng)基聯(lián)合使用，以判斷該基礎(chǔ)培養(yǎng)基的各類組分是否滿足流加培養(yǎng)模式。

3.1.2 流加培養(yǎng)基開發(fā)策略 與基礎(chǔ)培養(yǎng)基不同，補料培養(yǎng)基的添加是為了增加細胞密度，延長細胞活率，并提高抗體產(chǎn)量，通常包括葡萄糖、氨基酸、維生素和磷酸鹽，而無機鹽和微量元素往往不包含在內(nèi)。因此，設(shè)計流加培養(yǎng)基一方面要保證營養(yǎng)成分不會耗竭，同時也不能造成乳酸、氨等代謝副產(chǎn)物過度累積。Xie 和 Wang[33]根據(jù)雜交瘤細胞組成，葡萄糖、氨基酸和維生素的消耗速率設(shè)計流加培養(yǎng)基和流加策略，可以顯著地降低乳酸和氨的含量。

3.2 培養(yǎng)基開發(fā)手段

3.2.1 試驗設(shè)計 試驗設(shè)計（DOE）是一種安排試驗和分析試驗數(shù)據(jù)的數(shù)理統(tǒng)計方法，以較少的次數(shù)、較短的周期和較低的成本，獲得理想的試驗結(jié)果以及得出科學(xué)結(jié)論。培養(yǎng)基開發(fā)過程中常用的試驗方法主要有一次一因素（OFAT）設(shè)計、Plackett-Burman 設(shè)計、混料設(shè)計、響應(yīng)面設(shè)計等[34-37]。

OFAT 設(shè)計指通過改變單一因素的濃度來確定其最優(yōu)濃度。但由于動物細胞培養(yǎng)基成分復(fù)雜，且存在因素間的交互影響，因此該方法只適用于個別組分的優(yōu)化。Plackett-Burman 設(shè)計是一種兩水平的試驗設(shè)計方法，可以通過最少的試驗次數(shù)從大量考察因素中迅速篩選出顯著影響因素，但該方法卻忽略了因素間的交互作用[34]。響應(yīng)面設(shè)計則是通過對有限的因子進行建模和函數(shù)擬合，考慮因子間的交互關(guān)系，已達到最優(yōu)響應(yīng)效果的一種方法[35]。混料試驗常用于基礎(chǔ)培養(yǎng)基和植物水解物的優(yōu)化，DMEM/F12培養(yǎng)基便是混料試驗的最佳例證[37]。上述 DOE 設(shè)計方法均可借助商業(yè)化軟件完成試驗設(shè)計，例如 Design Xpert、Minitab 等。

3.2.2 培養(yǎng)基消耗分析 通過檢測不同時期細胞培養(yǎng)上清營養(yǎng)物（如氨基酸、維生素、微量元素等）及代謝物（如乳酸、氨、CO2等）濃度，計算其消耗或生成速率，并在此基礎(chǔ)上設(shè)計流加培養(yǎng)基組分，既要避免營養(yǎng)物在培養(yǎng)過程中消耗殆盡，又要防止?fàn)I養(yǎng)物流加過剩，造成代謝副產(chǎn)物累積。目前，市售的商業(yè)化儀器已經(jīng)基本滿足上述物質(zhì)的測定，如生化分析儀（NOVA）、高效液相色譜（HPLC）、電感耦合等離子發(fā)射光譜（ICP）等。

3.2.3 代謝組學(xué) 代謝組學(xué)（Metabolomics）是通過對比不同試驗組的所有代謝物組分，尋找其他代謝譜差異的研究方法。通過代謝組學(xué)可以提供培養(yǎng)基優(yōu)化過程中組分改變對于細胞代謝中間產(chǎn)物乃至整個代謝網(wǎng)絡(luò)的影響，從而為培養(yǎng)基優(yōu)化工作提供更堅實的理論基礎(chǔ)[38-39]。Dietmair 等[39]通過代謝組學(xué)研究不同培養(yǎng)基對 CHO 細胞生長（比生長速率和最高細胞密度）的影響，并確定了一系列與細胞生長有關(guān)的代謝中間產(chǎn)物。

3.2.4 高通量篩選系統(tǒng) 由于涉及數(shù)十種組分的篩選和優(yōu)化，如采用傳統(tǒng)的孔板或搖瓶方式進行培養(yǎng)基開發(fā)工作，一方面耗時費力，另一方面試驗培養(yǎng)條件的精確控制較難，進而影響對試驗結(jié)果的判斷。而高通量篩選系統(tǒng)（SimCellTM、Micro-24TM、ambrTM等）的出現(xiàn)不僅能夠模擬反應(yīng)器的控制條件，而且能夠?qū)崿F(xiàn)試驗條件的高通量篩選，顯著加快培養(yǎng)基開發(fā)進程[40]。例如，SimCell 是一種由 Bioprocess 公司開發(fā)的用于流加培養(yǎng)的微型生物反應(yīng)器，能夠?qū)崟r監(jiān)測細胞密度、活率、pH 和溶氧，每個微反應(yīng)體積為 650 μl，可同時進行上千個試驗[41]。

4 結(jié)語與展望

近年來，抗體藥物在國內(nèi)外發(fā)展勢頭迅猛。一方面國家通過新藥創(chuàng)制科技重大專項為生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供強有力的科技支撐，另一方面越來越多的抗體藥物面臨“專利懸崖”，使得國內(nèi)大量資金流向生物仿制藥的研發(fā)。

然而，國內(nèi)大多數(shù)企業(yè)尚不具備抗體藥物開發(fā)的關(guān)鍵技術(shù)。特別對于培養(yǎng)基而言，90% 以上的企業(yè)仍以使用商業(yè)培養(yǎng)基為主，使得開發(fā)成本居高不下。一旦出現(xiàn)產(chǎn)品質(zhì)量問題，便很難對培養(yǎng)基進行優(yōu)化。如何根據(jù)細胞株特性設(shè)計“個性化培養(yǎng)基”以滿足抗體藥物產(chǎn)量和質(zhì)量的“雙重要求”已成為國內(nèi)從事抗體藥物開發(fā)企業(yè)需要亟待解決的問題。作者期望通過對近年來動物細胞培養(yǎng)基開發(fā)研究進行綜述，對國內(nèi)研發(fā)人員從事培養(yǎng)基優(yōu)化起到一定的指導(dǎo)作用，從而提高國內(nèi)生物制藥企業(yè)的核心競爭力，早日實現(xiàn)中國抗體產(chǎn)業(yè)的繁榮。

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