吳培仁 尤 俊 洪清琦

人乳頭狀瘤病毒（human papilloma virus，HPV）是人類易感病毒，它與人類鱗狀上皮具有高度親和性。HPV目前已分離鑒定出118型，2003年流行病學(xué)分類研究定義了15種高危型HPV（如HPV16、HPV18等）和12種低危型HPV（如HPV6、HPV11等）。1982年Syrjanen［1］首次報道HPV與食管鱗癌關(guān)系后，大量研究揭示HPV是導(dǎo)致食管鱗癌發(fā)病率高的一個重要病因?qū)W因素［2-3］，但其致瘤機(jī)制尚未完全闡明。本研究采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence quantitation polymerase chain reaction，F(xiàn)Q-PCR）技術(shù)對閩南人的食管鱗癌、癌旁正常組織標(biāo)本進(jìn)行HPV檢測，探討HPV16、18型在閩南人食管鱗癌和癌旁正常組織中感染情況以及與閩南人食管鱗癌發(fā)生的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

選取2009年10月至2012年12月廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤外科，出生生長于閩南地區(qū)未做任何化學(xué)、放射治療經(jīng)手術(shù)病理證實的食管鱗癌患者100例，年齡35～78歲，男64例，女36例；病理組織學(xué)分級，Ⅰ級3例，Ⅱ級77例，Ⅲ級20例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移61例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移39例；腫瘤浸潤程度，T11例，T220例，T336例，T443例。

1.2 方法

將手術(shù)切除的新鮮食管鱗癌標(biāo)本的癌組織及癌旁正常組織各取100份，所有標(biāo)本均在手術(shù)后2 h內(nèi)收集。采用FQ-PCR技術(shù)進(jìn)行HPV-DNA檢測，檢測試劑盒為中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司生產(chǎn)。按照試劑盒提供的操作流程提取各份樣本DNA，每份樣本分別構(gòu)建兩個PCR體系，兩個體系的通用引物和探針包含的亞型分別為：高危HPV16型和HPV18型；同時在羅氏480PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序按試劑要求編輯。陽性結(jié)果判斷：如果增長曲線呈S型曲線且Ct值＜40，則實驗結(jié)果判為陽性，最終根據(jù)每份樣本兩個體系的陽性結(jié)果情況綜合判斷HPV型別情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用行×列表資料的χ2檢驗方法，對多個樣本率進(jìn)行比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高危型HPV16、18在食管鱗癌組織中感染情況

高危型HPV16、18在食管鱗癌組織中的陽性率分別為14.00%（14/100）、15.00%（15.00/100）。男女患者高危型HPV16、18陽性率分別為14.06%（9/64）、15.63%（10/64）和13.89%（5/36）、13.89%（5/36）；差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0，P＞0.05；χ2=0.054，P＞0.05）。高危型HPV16和18在食管鱗癌組織中的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組感染率40.98%（25/61）明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組10.25%（4/39），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=10.91，P＜0.01）；其中HPV16型的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組感染率19.91%（12/61）明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組5.13%（2/39），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.18，P＜0.05）；HPV18型的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組感染率21.31%（13/61）明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組5.13%（2/39），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.88，P＜0.05）。HPV16、18感染與患者年齡、性別、病理類型、腫瘤分級、腫瘤浸潤程度均無相關(guān)性，均P＞0.05。

2.2 高危型HPV16、18在癌旁組織中感染情況

高危型HPV16、18在癌旁組織中的陽性率分別為7.00%（7/100）、8.00%（8/100），男女患者高危型HPV16、18陽性率分別為6.25%（4/64）、6.25%（4/64）和8.33%（3/36）、11.11%（4/36）；差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.153 6，P＞0.05；χ2=0.739 7，P＞0.05）。高危型HPV16和18在癌旁的有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組感染率分別為14.52%（9/61）、15.38%（6/39），差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.741 8，P＞0.05）。HPV16、18感染與患者年齡、性別、病理類型、腫瘤分級、腫瘤浸潤程度均無相關(guān)性，均P＞0.05。

2.3 高危型HPV16、18在食管鱗癌和癌旁組織中感染的比較

高危型HPV16、18在食管鱗癌組織中的陽性率為14.00%、15.00%，高于相應(yīng)癌旁組織7.00%、8.00%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=1.303 6，P＞0.05；χ2=1.203 6，P＞0.05）。

3 討論

HPV是一類雙鏈閉合環(huán)狀DNA病毒，具有高度組織特異性和宿主特異性，基因組約為8 000 bp［4］，HPV DNA基因組按其功能分為3個編碼區(qū)：1）早期基因編碼參與病毒DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及細(xì)胞轉(zhuǎn)化的蛋白；2）晚期基因編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白；3）上游調(diào)節(jié)區(qū)位于E區(qū)和L區(qū)之間，包含啟動子等調(diào)控元件，與病毒DNA復(fù)制轉(zhuǎn)錄的調(diào)控有關(guān)［5］?，F(xiàn)已經(jīng)明確基因組全序列有80多種DNA病毒分型［6］，其中15種高危致病亞型包括HPV-16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68，而HPV6、11、42、43、44為低危型［7］；目前已有證實HPV16和HPV18病毒分型也是食管鱗癌的主要高危致病亞型［8］。曹邦偉等［9］使用Meta分析1982年至2009年關(guān)于HPV感染與食管癌關(guān)聯(lián)的病例對照研究發(fā)現(xiàn)，HPV高危型別（16和18型）的感染與食管癌的發(fā)生依然顯示出明顯的易感關(guān)聯(lián)。

本研究應(yīng)用FQ-PCR技術(shù)檢測100例閩南人的食管鱗癌和對應(yīng)100例癌旁正常鱗狀上皮組織HPV感染情況，結(jié)果顯示食管鱗癌高危型HPV16、18陽性率高于癌旁組織（14.00%vs.7.00%和15.00%vs.8.00%），提示高危型HPV16、18與閩南地區(qū)食管鱗癌的發(fā)生存在關(guān)聯(lián)。劉新勝等［10］應(yīng)用導(dǎo)流雜交法檢測河南地區(qū)57例食管鱗癌組織及相應(yīng)癌旁組織進(jìn)行HPV16、18檢測，結(jié)果顯示：高危型HPV16、18在河南地區(qū)食管鱗癌組織中的陽性率為36.84%（21/57）和19.30%（11/57），明顯高于癌旁組織陽性率14.04%和10.53%，且兩組感染HPV的陽性率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示高危型HPV16、18感染與該地區(qū)食管鱗癌的發(fā)生存在明顯關(guān)聯(lián)。姚品芳等［11］應(yīng)用免疫組化S-P法檢測湖北鐘祥和麻城食管鱗癌及正常食管黏膜HPV16/18E6陽性率分別為45.0%和0%，且兩組感染HPV的陽性率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），認(rèn)為HPV16、18感染在該地區(qū)食管癌發(fā)生上具有普遍意義。崔明辰等［12］研究也提示食管鱗癌與HPV16、18感染有關(guān)，認(rèn)為造成食管HPV感染率差異的原因可能與標(biāo)本來源、標(biāo)本數(shù)量、環(huán)境地理因素、遺傳易感性和檢測方法不同有關(guān)。本研究與國內(nèi)外研究不符考慮存在以下因素：1）HPV感染可能存在種族差異；2）HPV在正常人群消化系中都有一定的感染率，具有自限性，大部分感染是暫時的，當(dāng)機(jī)體的防御機(jī)制改變或基因發(fā)生突變時，HPV感染可發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化；3）可能與檢測方法不同有關(guān)。

本研究顯示高危型HPV16、18在食管鱗癌組織中的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組感染率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（40.98%vs.10.25%）；提示HPV16、18可能參與食管鱗癌的進(jìn)化步驟和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的過程，HPV與癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移關(guān)系有待進(jìn)一步研究。劉新勝等［10］研究河南地區(qū)HPV16、18感染在食管鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組感染率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（77.78%vs.36.67%）；認(rèn)為HPV感染與食管癌發(fā)生發(fā)展不同階段可能發(fā)揮重要作用。許建功等［13］研究也認(rèn)為高危型HPV16和18感染與食管鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。由于HPV一般要在感染二、三十年后致癌，這么長的潛伏期可能與病毒整合到宿主適當(dāng)?shù)奈恢眯枰荛L的時間有關(guān)；病毒整合入宿主細(xì)胞不僅使病毒癌蛋白得到長期穩(wěn)定的表達(dá)，而且因為插入造成宿主DNA的重排，由此造成基因絮亂，對細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化起著至關(guān)重要的作用。

本研究表明HPV16、18感染與食管鱗癌組織分化程度、腫瘤浸潤程度、患者性別、年齡、病理類型均無明顯相關(guān)性，提示HPV16、18感染可能僅作為食管鱗癌發(fā)生的危險因素。陳衛(wèi)剛等［14］研究表明哈薩克族食管鱗癌HPV感染率無男女性別差異。

楊蘭等［15］研究認(rèn)為：HPV DNA在良性和癌前病變中以游離形式存在，而在惡性腫瘤中整合于基因細(xì)胞中，下游區(qū)域HPV16、18E6和E7整合入宿主細(xì)胞后參與細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)化，E7基因可通過與Rb家族相互作用使細(xì)胞周期失控，DNA大量合成并喪失DNA復(fù)制的保真度；E6基因則通過結(jié)合并降解P53，阻止DNA的修復(fù)或阻止細(xì)胞進(jìn)入程序性死亡。顯示HPV18在已有HPV16感染的食管鱗癌中可加強(qiáng)HPV16的致癌作用，即當(dāng)HPV16，18合并感染時提高了細(xì)胞病變的風(fēng)險，說明HPV16、18感染在致癌功能上存在協(xié)同互補作用。提示HPV16、18感染與食管鱗癌發(fā)病有關(guān)，與本研究結(jié)果相同，說明HPV16、18感染可能是閩南地區(qū)食管鱗癌發(fā)病原因之一。

1 Syrjanen KJ.Histological changes identical to those of condylomatous lesions found in esophageal squamous cell carcinomas[J].Arch Geschwulstforsch,1982,52(4):283-292.

2 Mammas IN,Sourvinos G,Zaravinos A,et al.Vaccination against human papilloma virus(HPV):epidemiological evidence of HPV in nongenital cancer[J].Pathol Oncol Res,2011,17(1):103-109.

3 Afonso LA,Moyses N,Cavalcanti SM.Human papilloma virus DETECTION AND P16 methylation pattern in a case of esophageal papilloma.Braz[J].Med Biol Res,2010,43(7):694-696.

4 Kusumoto-Matsuo R,Kanda T,Kukimoto I.Rolling circle replication of human papillomavirus type 16 DNA in epithelial cell extracts[J].Genes Cells,2011,16(1):23-33.

5 Cheah PL,Looi LM,Mun KS,et al.Implications of continued upregulation of p16(INK4a)through the evolution from high-grade squamous intraepithelial lesion to invasive squamous carcinoma of the cervix[J].Malays J Pathol,2011,33(2):83-87.

6 Steben M,Duarte-Franco E.Human papillomavirus infection:epidemiology and pathophysiology[J].Gynecol Oncol,2007,107(2):S2-S5.

7 Wei JW,Xu ZH,Luo SQ,et al.The detection and its clinical significance of human papillomavirus types 6/11 and 16/18[J].Lab Med Clin,2011,8(19):2320-2321［.韋家偉,許澤輝,羅世強(qiáng),等.人乳頭狀瘤病毒6/11、16/18型的檢測及臨床意義[J].檢驗醫(yī)學(xué)與臨床,2011,8(19):2320-2321.］

8 Duensing S,Duensing A,Crum CP,et al.Human papillomavirus type 16E7 oncoprotein induced abnormal centrosomesythesis is an earlyevent in the evolving malignamt phenotype[J].Cancer Res,2001,61(6):2356-2360.

9 Cao BW,Yu JL,He H.Meta Analysis of esophageal carcinoma and HPV infections in China[J].Journal of Shoudu Medical University,2010,31(2):258-263.［曹邦偉,于晶琳,荷 歡.中國人群中HPV感染與食管癌發(fā)生關(guān)聯(lián)的Meta分析[J].首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2010,31(2):258-263.］

10 Liu XS,Guo WT,Zhao GQ.Association between HPV16、18 and esophageal squamous cell carcinoma in henan regions[J].China Foreige Medical Treatment,2012,3(1):99-100［.劉新勝,郭文濤,趙國強(qiáng).河南地區(qū)食管鱗癌與HPV16、18關(guān)系的研究[J].中外醫(yī)療,2012,3(1):99-100.］

11 Yao PF,Huang HY,Fu YG,et al.The companre of HPV infection in esophageal carcinoma in henan emigration of hubei zhongxiang and hubei native residenter[J].J Cancer Research on Prevention and Treatment,2005,32(1):46-48.[姚品芳,黃環(huán)元,付由高,等.湖北鐘祥河南移民與湖北本地居民食管狀細(xì)胞癌組織中HPV感染的比較[J].腫瘤防治研究,2005,32(1):46-48.]

12 Cui MC,Yue HS,Zhang DY,et al.Detection of human papillomavirus in esophageal carcinoma tissues of pationts from Luohe region of Henan Province[J].Journal of Medical Research,2011,40(11):73-74［.崔明辰,岳鶴聲,張冬云,等.漯河地區(qū)食管癌患者組織中人乳頭狀瘤病毒感染的檢測[J].醫(yī)學(xué)研究雜志,2011,40(11):73-74.］

13 Xu JG,Wang WJ.Correlation study of high risk HPV infection and Lin28b expression in esophageal carcinoma[J].The Journal of Practical Medicine,2012,28(8):1227-1230［.許建功,王武軍.高危型HPV感染與食管鱗癌組織中Lin28b表達(dá)的相關(guān)性研究[J].實用醫(yī)學(xué)雜志,2012,28(8):1227-1230.］

14 Chen WG,Yang CM,Xu LH,et al.Detection of human papillomavirus in esophageal cancer in Xinjiang Kazakh patients by general primer-mediated polymerase chain reaction[J].World Chinese Journal of Digestology,2012,20(12):1049-1053［.陳衛(wèi)剛,楊春梅,徐麗紅,等.通用引物巢式PCR法對哈薩克族食管鱗癌HPV感染的檢測[J].世界華人消化雜志,2012,20(12):1049-1053.］

15 Yang L,Chen L,Shun ZZ,et al.Analysis of human papillomavirus DNA infection in Kazakh esophageal carcinomas in Xinjiang province[J].World Chinese Journal of Digestology,2007,15(19):2114-2119［.楊 蘭,陳 玲,孫振柱,等.新疆哈薩克族食管癌中HPV感染狀況分析[J].世界華人消化雜志,2007,15(19):2114-2119］