趙玉瓊，李瑞生，陳 華

(1.解放軍總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，北京 100853； 2.解放軍第302醫(yī)院實(shí)驗(yàn)技術(shù)研究保障中心，北京 100039)

組織的固定在石蠟切片的整個(gè)過程中起著重要作用，固定液的種類很多，分為單純固定液和混合固定液，各種固定液的滲透強(qiáng)弱不同，對組織的固定效果也不同，從而影響切片的質(zhì)量。小腸是食物消化吸收的重要部位，在小腸腔面隆起形成許多環(huán)形皺襞和細(xì)小的絨毛。

由于腸腔內(nèi)存在消化功能強(qiáng)大的胰酶，因此，小腸也是尸溶最早出現(xiàn)的組織之一。以福爾馬林固定液固定的腸道組織，常常出現(xiàn)腸絨毛固定不好，絨毛頂端出現(xiàn)上皮細(xì)胞脫落、甚至是大片組織壞死的現(xiàn)象，這可能會(huì)干擾對動(dòng)物健康狀態(tài)的判斷以及病理結(jié)果的判定。我們以往選擇復(fù)檢時(shí)取腸道斷端邊緣，或者固定時(shí)剪開腸道的方式來避免這種現(xiàn)象的出現(xiàn)，但是，腸道斷端邊緣取材有時(shí)也存在剪切擠壓的影響和固定效果不一的問題；剪開腸道對于觀察完整腸腔結(jié)構(gòu)存在影響。因此，我們選擇了三種不同的固定液，對比觀察對大、小鼠腸道組織切片質(zhì)量的影響，以期找到適用大、小鼠腸道組織固定的方法。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級雄性SD大鼠，4周齡，體重80～100 g，12只；清潔級雄性KM小鼠，四周齡，體重18～25 g，12只，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司【SCXK(京)2012-0001】,動(dòng)物使用許可【SYXK(軍)2012-0062】。

1.2 儀器和試劑

儀器：Tissue-TeK VIP 5 Jr櫻花全自動(dòng)脫水機(jī)，YABO-200file組織包埋機(jī)，YABO-200file烤片機(jī)，Leitz 1516組織切片機(jī)。

試劑：10%中性福爾馬林固定液，無水乙醇，冰醋酸，苦味酸，甲醛溶液(37%～40%)，均購自北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司，Harris蘇木素-伊紅染色液，購自北京博益恒豐科技有限責(zé)任公司。

1.3 固定液配制與組織固定

10%中性福爾馬林固定液(批號：20121015)：固定方法為10%中性福爾馬林固定液固定24 h后置換50%新鮮固定液繼續(xù)固定24 h；

Bouin’s固定液：將苦味酸飽和水溶液、甲醛溶液(37%～40%)、冰醋酸分別按照15∶5∶1的體積比例配制，固定方法為Bouin’s液中固定12 h后轉(zhuǎn)入10%中性福爾馬林固定液中繼續(xù)固定24 h。

改良Davidson’s固定液：將甲醛溶液(37%～40%)、無水乙醇、冰醋酸和蒸餾水分別按照6∶3∶1∶10的體積比例配制，固定方法為改良Davidson’s液中固定18 h后轉(zhuǎn)入10%中性福爾馬林固定液中繼續(xù)固定24 h。

1.4 動(dòng)物血常規(guī)指標(biāo)、血生化指標(biāo)檢測

動(dòng)物經(jīng)一夜禁食后，腹腔注射戊巴比妥鈉(45 mg/kg)麻醉，眼底靜脈叢采血，取血4 mL，其中2 mL血液用于血常規(guī)指標(biāo)檢測，以EDTA-K2抗凝，以血細(xì)胞分析儀(Sysmex XE2100)測定RBC、HGB、WBC、MCV、 MCH、MCHC、RDW、PLT、MPV；2 mL血液用于血液生化指標(biāo)檢測，以自動(dòng)生化分析儀(羅氏 cobas8000)檢測AST、ALT、ALP、BUN、T-CHO、 CK、TP、 LDL、HDL、TG、 T-BIL、 GLU、 CREA、I-BIL、D-BIL。

1.5 腸道組織取材

大、小鼠麻醉?xiàng)l件下放血處死，剖開腹腔，對大鼠腹腔臟器做肉眼觀察。取腸道組織約5 cm(距幽門15 cm處)，將其分為三段分別放入三種固定液中進(jìn)行固定。第一段組織放入10%中性福爾馬林固定液固定24 h，后置換50%新鮮固定液繼續(xù)固定24 h；第二段組織放入Bouin's液中固定12 h，后轉(zhuǎn)入10%中性福爾馬林固定液中繼續(xù)固定24 h；第三段放入改良Davidson's液中固定18 h，后轉(zhuǎn)入10%中性福爾馬林固定液中繼續(xù)固定24 h。待組織固定完全后，將每段腸道分為腸道兩端和中間兩部分，分別進(jìn)行脫水、石蠟包埋、切片、烤片和HE染色。光學(xué)顯微鏡下觀察切片效果。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物血液學(xué)檢查

動(dòng)物血常規(guī)指標(biāo)和血生化指標(biāo)檢測結(jié)果未發(fā)現(xiàn)異常值，所有檢測指標(biāo)均處于正常范圍之內(nèi)，動(dòng)物處于健康狀態(tài)。

2.2 大體解剖檢查

動(dòng)物腹腔臟器肉眼觀察未見異常。

2.3 三種固定液下腸道組織石蠟切片HE染色結(jié)果

三種固定液固定的腸道組織石蠟切片的HE染色存在差異(圖1，彩插2)。10%中性福爾馬林固定液固定的組織：腸道組織黏膜層，黏膜下層，肌層，漿膜層4層結(jié)構(gòu)清晰，色彩鮮艷，透明度高，細(xì)胞核質(zhì)對比明顯，中央乳糜管清晰，腸腺清楚完整，整體結(jié)構(gòu)有些不完整，部分腸絨毛出現(xiàn)脫落現(xiàn)象。Bouin's液固定的組織：腸道組織黏膜層，黏膜下層，肌層，漿膜層4層結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞核質(zhì)對比明顯，中央乳糜管清晰，腸腺清楚完整，腸絨毛結(jié)構(gòu)完整，但是色彩較暗淡。改良Davidson’s液固定組織:腸道組織黏膜層，黏膜下層，肌層，漿膜層4層結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞核質(zhì)對比明顯，整體結(jié)構(gòu)完整，中央乳糜管清晰，十二指腸腺清楚完整，腸絨毛結(jié)構(gòu)完整，色彩也不如單純福爾馬林固定液的組織鮮艷。

2.4 腸道兩端和中間段石蠟切片HE染色結(jié)果

10%中性福爾馬林固定液固定的組織，在斷端取材的固定效果較好，出現(xiàn)的異常主要為腸絨毛頂部的上皮脫落，而在中間段的組織固定效果大多不好，腸絨毛頂部上皮脫落的現(xiàn)象普遍存在，有的部位還出現(xiàn)壞死現(xiàn)象。Bouin’s液和改良Davidson’s液固定的組織，腸道的兩端和中間段石蠟切片的效果無明顯區(qū)別。

3 討論

固定的目的是為了防止組織的自溶與腐敗，防止細(xì)胞內(nèi)的酶類轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄晕镔|(zhì)，以保持原有的結(jié)構(gòu)，組織固定后，均呈一定的硬化狀態(tài)，增加了組織的韌性，而且不易變形，有利于后續(xù)的組織處理。

10%中性福爾馬林溶液：滲透性強(qiáng)，固定均勻，收縮性小，但經(jīng)酒精脫水后收縮較大，甲醛不能使白蛋白和核蛋白沉淀。甲醛通過使蛋白質(zhì)分子發(fā)生交聯(lián)而產(chǎn)生固定作用。大、小鼠腸道組織經(jīng)10%中性福爾馬林固定后組織較柔軟，切片可觀察到腸絨毛脫落、甚至壞死的現(xiàn)象[1-3]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的為大、小鼠新鮮腸組織，血液學(xué)檢查表明動(dòng)物血常規(guī)和13項(xiàng)血清生化指標(biāo)未見異常，大體解剖檢查腹腔臟器未見異常，推測動(dòng)物處于健康狀態(tài)，這些腸道的異常形態(tài)不是動(dòng)物本身的病變，為制片假象，可能是由于腸道內(nèi)存在溶組織功能強(qiáng)大的胰酶，而且腸道的漿膜層、平滑肌層組織比較致密，在福爾馬林溶液滲透至腸絨毛頂端之時(shí)，已經(jīng)發(fā)生了尸溶作用。

Bouin's固定液：該固定液中的冰醋酸穿透作用快，是良好的核蛋白沉淀劑，能使染色體的保存如同生活時(shí)一樣，并能把未分裂的細(xì)胞核染色質(zhì)沉淀成為可以染色的塊狀體，故細(xì)胞核染色顯得清楚，使核漿顏色對比鮮明，冰醋酸對膠原纖維等組織有輕度膨脹作用，但用量大易使組織發(fā)脆，而甲醛對組織有收縮作用。兩種試劑的混合使用，用以抵消彼此間的副作用[4]。苦味酸能沉淀蛋白，也有軟化組織的作用，苦味酸和醋酸配合使用能很好的保存組織結(jié)構(gòu)[5-6]。Bouin’s 液組織滲透性強(qiáng)且滲透速度快而均勻、組織收縮幅度小，不出現(xiàn)變脆現(xiàn)象，HE染色組織結(jié)構(gòu)清晰完整。張會(huì)卿等發(fā)現(xiàn)[7]，Bouin’s液固定活檢的睪丸組織進(jìn)行病理診斷，效果明顯高于福爾馬林或95%酒精。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大、小鼠小腸經(jīng)Bouin's液固定后組織有一定的硬度，未見腸絨毛頂部上皮細(xì)胞脫落、壞死現(xiàn)象，組織結(jié)構(gòu)細(xì)致、清晰，切片的染色效果好，只是色彩沒有單純福爾馬林溶液固定的切片鮮艷。推測可能是由于冰醋酸的快速穿透作用，使腸絨毛在死后胰酶作用之前被固定，因而保持了較好的組織結(jié)構(gòu)。

改良Davidson’s液：是一種快速固定液，組織放入后會(huì)快速變白呈不透明狀，對小標(biāo)本固定更為迅速。甲醛和乙醇對組織的細(xì)胞內(nèi)液有輕度的收縮作用，而冰醋酸對組織的膨脹作用尤為強(qiáng)烈， 核腫脹明顯， 因此三者合用抵消了甲醛和無水乙醇的收縮以及冰醋酸固定液所引起的組織膨脹和核的腫脹，并且冰醋酸能迅速固定染色質(zhì)，助于染色，固定液中加入冰醋酸其作用快，固定效果均勻，能夠清晰的顯示核結(jié)構(gòu)[8]。盛嬋等發(fā)現(xiàn)[9-10]，Davidson’s固定液可明顯提高睪丸和眼球的切片質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大、小鼠小腸經(jīng)改良Davidson’s液固定后，切片質(zhì)量與Bouin's固定液效果類似，色彩鮮艷程度略好一些。

綜上所述，10%中性福爾馬林固定液用于大、小鼠小腸固定，組織切片易于出現(xiàn)腸粘膜上皮脫落、壞死的異常結(jié)果，為固定液的滲透作用速度缺陷，不是動(dòng)物自身的病理性改變。 Bouin’s和改良Davidson’s固定液均可迅速地固定大、小鼠腸道組織，避免了腸粘膜上皮脫落、壞死的制片異常，而且切片組織結(jié)構(gòu)更精細(xì)、清晰，略顯不足的是染色色彩不如單純福爾馬林固定液的組織切片鮮艷。

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