廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東 湛江 524001

miR-192與ZEB2在結(jié)直腸癌中的表達及其臨床意義

吳巍蕓 周宇

廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東 湛江 524001

背景與目的：微小RNA(microRNA，miRNA)是一類具有重要調(diào)控作用的非編碼小分子RNA，在多種疾病的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。本研究通過檢測結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)組織中miR-192及E盒結(jié)合鋅指蛋白2(zinc finger E-box binding homeobox 2，ZEB2) mRNA、蛋白表達，分析miR-192的異常表達與CRC的臨床病理特征的關(guān)系及與ZEB2的相關(guān)性。方法：選擇CRC組織和癌旁組織(距腫瘤邊緣≥5 cm)各30例，結(jié)直腸腺瘤組織25例，正常結(jié)直腸組織15例。實時定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reation，qRT-PCR)法檢測上述各組中miR-192及ZEB2 mRNA表達；蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測ZEB2蛋白表達；對CRC組織中miR-192與臨床病理特征關(guān)系及前者與ZEB2的相關(guān)性進行分析。結(jié)果：CRC組miR-192表達明顯下調(diào)，ZEB2 mRNA和蛋白表達明顯上調(diào)，分別與癌旁組、結(jié)直腸腺瘤組及正常組相比，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；miR-192的表達下調(diào)與CRC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.021)和遠處轉(zhuǎn)移(P=0.023)相關(guān)。在CRC組織中，miR-192與ZEB2蛋白的表達呈顯著的負相關(guān)關(guān)系(r=-0.365，P＜0.05)。結(jié)論：miR-192在CRC組織中的表達下調(diào)與腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)，且可能通過ZEB2參與CRC的發(fā)生、發(fā)展過程。

微小RNA；結(jié)直腸癌；E盒結(jié)合鋅指蛋白2；臨床意義

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)在我國發(fā)病率呈上升態(tài)勢，位于惡性腫瘤致死因素的第4位［1］。CRC的發(fā)生、發(fā)展經(jīng)歷了正常的結(jié)直腸黏膜轉(zhuǎn)化為黏膜過度增生和腺瘤的形成，并演變至癌及癌的浸潤與轉(zhuǎn)移等復(fù)雜過程，在此過程中涉及多種基因異常改變。微小RNA (microRNA，miRNA)是一類非編碼小分子RNA，參與腫瘤細胞的增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移、血管生成和多藥耐藥等過程，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用［2-4］。已有報道，miR-192在多種腫瘤中表達異常［5-7］。我們先前的研究發(fā)現(xiàn)，miR-192模擬物轉(zhuǎn)染結(jié)直腸癌SW480和SW620細胞后，E盒結(jié)合鋅指蛋白2(zinc finger E-box binding homeobox 2，ZEB2) mRNA及蛋白的表達明顯下調(diào)，細胞的遷移和侵襲能力下降；雙熒光素酶報告基因檢測也顯示ZEB2基因3’-UTR存在miR-192的結(jié)合位點，說明miR-192可能參與CRC的發(fā)生、發(fā)展過程［8］。但miR-192與CRC臨床病理特征的關(guān)系未見進一步研究，本實驗通過檢測miR-192及其靶基因ZEB2在CRC中的表達和2者的相關(guān)性，分析其臨床意義，為闡明CRC發(fā)生、發(fā)展的分子機制提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 研究對象

收集廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院2012年3月—2013年5月結(jié)直腸癌手術(shù)切除標本30例，每例標本分別取結(jié)直腸原發(fā)腫瘤組織及癌旁組織(距腫瘤邊緣≥5 cm，且術(shù)后病理證實無癌組織侵犯)，患者術(shù)前均未接受化療或放療。腸鏡下活檢的結(jié)直腸腺瘤組織25例，健康人體格檢查腸鏡下獲取正常結(jié)直腸組織15例。新鮮標本離體后迅速置于液氮中，于-80 ℃保存。本研究遵循倫理學標準并得到本院倫理委員會批準及受試者的知情同意。

1.2 主要試劑

RNAiso Plus、One Step PrimeScript? miRNA cDNA Synthesis Kit、PrimeScript? RT Master Mix (Perfect Real Time)、SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ(Perfect Real Time)均購自寶生物工程(大連)有限公司。miR-192、U6、ZEB2、β-actin引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。兔抗人ZEB2抗體購自美國Santa Cruz公司。小鼠抗人β-actin抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗兔或羊抗小鼠IgG二抗、超敏ECL化學發(fā)光試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 實時定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)檢測各組miR-192和ZEB2 mRNA的表達

用RNAiso Plus提取組織的總RNA。按照One Step PrimeScript? miRNA cDNA Synthesis Kit及PrimeScript? RT Master Mix (Perfect Real Time)試劑盒說明書分別進行miR-192及ZEB2的逆轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)所得的cDNA再使用SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(Perfect Real Time)試劑盒進行PCR。miR-192以U6作為內(nèi)參。ZEB2以β-actin作為內(nèi)參。qRT-PCR引物序列如下，miR-192上游引物：5’-CTGACCTATGAATTGACAGCC-3’；U6上游引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’；miRNA下游引物Uni-miR qPCR Primer包含在逆轉(zhuǎn)錄試劑盒中；ZEB2上游引物：5’-TCTGCGACATAAATACGA-3’，ZEB2下游引物：5’-GAGTGAAGCCTTGAGTGC-3’；β-actin上游引物：5’-GGCGGCAACACC A T G T A C C C T-3’，β-a c t i n下游引物：5’-AGGGGCCGGACTCGTCATACT -3’。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸20 s，擴增40個循環(huán)。目的基因與內(nèi)參基因的Ct值比較后(△Ct)，miR-192及ZEB2 mRNA的相對表達量用2-△Ct法計算。

1.4 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測組織ZEB2蛋白的表達

用細胞裂解液裂解組織，提取總蛋白。采用SDS-PAGE電泳分離，電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，ZEB2抗體(1∶500)及β-actin抗體(1∶1 000)溫育過夜，TBST液漂洗后，加入HRP標記的羊抗兔或羊抗小鼠IgG二抗(1∶1 000)室溫溫育1 h。TBST液漂洗后，加入ECL發(fā)光液，X光壓片顯影。Quantity One軟件計算并分析ZEB2蛋白相對表達水平。

1.5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析。4組間比較采用單因素方差分析，miR-192的表達與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系分析采用χ2檢驗，miR-192表達量與ZEB2蛋白表達的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR-192 在各組組織中的表達

分別與癌旁組、結(jié)直腸腺瘤組及正常組比較，CRC組miR-192表達下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(分別為P=0.021、P=0.016、P=0.023)；癌旁組、結(jié)直腸腺瘤組及正常組3組間相互比較，miR-192的表達差異均無統(tǒng)計學意義(分別為P=0.835、P=0.698、P=0.839，圖1)。

2.2 ZEB2在各組組織的表達

分別與癌旁組、結(jié)直腸腺瘤組及正常組比較，CRC組ZEB2 mRNA和蛋白表達均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(mRNA：分別為P=0.037、P=0.031、P=0.035；蛋白：分別為P=0.010、P=0.002、P=0.049)；癌旁組、結(jié)直腸腺瘤組及正常組3組間相互比較，ZEB2 mRNA和蛋白表達差異均無統(tǒng)計學意義(mRNA：分別為P=0.870，P=0.688，P=0.800；蛋白：分別為P=0.522、P=0.875、P=0.494，圖2)。

2.3 miR-192的表達與CRC臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

在30例CRC組織標本中，與相應(yīng)的癌旁組織比較，有19例的miR-192表達下調(diào)，并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.021)及遠處轉(zhuǎn)移(P=0.023)顯著相關(guān)(表1)。

2.4 miR-192與ZEB2蛋白表達的相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析顯示，在CRC組織中，miR-192表達下調(diào)與ZEB2蛋白的高表達呈負相關(guān)(r=-0.365，P＜0.05，圖3)。

3 討 論

miRNA是一類非編碼小分子RNA，可通過形成RNA誘導沉默復(fù)合物，與靶mRNA的3’-非編碼區(qū)完全或不完全互補結(jié)合，促進靶mRNA降解或抑制其轉(zhuǎn)錄后翻譯，從而在病理生理過程中發(fā)揮作用［9］。miRNA在多種腫瘤組織中表達異常，而在一種腫瘤組織中也存在多種miRNA表達異常［10-12］。miRNA作為調(diào)控基因表達的分子，通過與下游靶基因的作用，調(diào)控著腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，在腫瘤的演變過程扮演著非常重要的角色。因此，深入研究miRNA在腫瘤中的調(diào)控機制，以期尋找藥物作用靶點，為基因治療腫瘤提供理論基礎(chǔ)。

miRNA-192在惡性腫瘤中起著重要的作用，其表達異常在多種腫瘤中得到證實。研究發(fā)現(xiàn)，與正常肺組織相比，miR-192在肺癌組織中表達下調(diào)，在體外實驗中，過表達miR-192通過作用于RB1基因可以抑制肺癌細胞的增殖和促進凋亡［5］。Khella等［13］的研究發(fā)現(xiàn)，過表達miR-192可以抑制腎癌細胞的遷移及侵襲能力。本研究小組曾發(fā)現(xiàn)，miR-192模擬物轉(zhuǎn)染結(jié)直腸癌SW480和SW620細胞后，細胞的遷移和侵襲能力下降［8］。本研究結(jié)果顯示，CRC組織中miR-192的表達下調(diào)，顯著低于非腫瘤組織，而在癌旁組織、結(jié)直腸腺瘤和正常組織中，miR-192的表達差異無統(tǒng)計學意義，說明miR-192下調(diào)與CRC的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。本研究也發(fā)現(xiàn)，miR-192的低表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示miR-192可能參與CRC的進展過程。

ZEB2通過抑制E-cadherin的表達，激活幾種基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)，包括MMP1、MMP2、MMP14，誘導細胞發(fā)生上皮-基質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進細胞遷移和侵襲［14］。有研究發(fā)現(xiàn)，ZEB2與CRC的侵襲轉(zhuǎn)移能力相關(guān)，但如何調(diào)控ZEB2發(fā)揮此作用的機制仍未明了［15］。Hu等［16］發(fā)現(xiàn)miR-141可以通過調(diào)節(jié)ZEB2的表達水平來抑制CRC細胞遷移和侵襲。本組資料顯示，分別與癌旁組、結(jié)直腸腺瘤組、正常組比較，ZEB2在CRC組織中表達上調(diào)，而且與miR-192的表達呈負相關(guān)。說明在CRC中miR-192可能通過與ZEB2的作用，調(diào)控ZEB2的表達，從而影響CRC細胞的遷移、侵襲能力。

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The expression and clinical signi fi cance of microRNA-192 and ZEB2 in colorectal cancer

WU Weiyun, ZHOU Yu
(Department of Gastroenterology, Affiliated Hospital of Guangdong Medical College, Zhanjiang Guangdong 524001, China)

ZHOU Yu E-mail: ahdg2005@126.com

Background and purpose: MicroRNA(miRNA) is a class of small non-coding RNA playing an important regulatory role in many diseases. In this study, we explore the levels of miR-192 and zinc fi nger E-box binding homeobox 2 (ZEB2) in CRC, the clinical signi fi cance of miR-192 and the correlation between the expression of miR-192 and ZEB2 protein. Methods: The expression levels of miR-192 and ZEB2 mRNA in 30 colorectal carcinoma samples, 30 corresponding cancer-adjacent tissue samples (from the edge of tumor ≥5 cm), 25 colorectal adenoma samples, and 15 normal tissue samples were quanti fi ed using quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). ZEB2 protein expression was determined using Western blot. The relationship between the miR-192 and clinicopathological factors, miR-192 and ZEB2 protein expression was analyzed. Results: Signi fi cant upregulation of miR-192 expression and reduction of ZEB2 mRNA and protein expression were identi fi ed in CRC tissues, compared to cancer-adjacent tissues, colorectal adenoma samples, and normal tissues (P＜0.05). Low miR-192 levels were signi fi cantly associated with lymph node (P=0.021) and distant metastasis (P=0.023). An inverse relationship between miR-192 and ZEB2 protein expression was identified in CRC group (r=-0.365, P＜0.05). Conclusion: MiR-192 downexpression was correlated with CRC metastasis. MiR-192 may play a role in the development and progression of CRC through ZEB2.

MicroRNA; Colorectal cancer; Zinc fi nger E-box binding homeobox 2; Clinical signi fi cance

10.3969/j.issn.1007-3969.2014.07.005

R735.3

A

1007-3639(2014)07-0507-05

2014-02-18

2014-06-03）

“癌癥研究新視野大會”將于上海舉行

周宇 E-mail:ahdg2005@126.com

由美國癌癥研究學會(American Association for Cancer Research，AACR)主辦的“癌癥研究新視野大會”將于2014年10月9～12日在上海金茂君悅大酒店舉行。本屆會議主題為“靶向治療的突破”，將著重介紹癌癥研究的主要領(lǐng)域中最新、最令人振奮的科研成果，并為世界各地的癌癥研究者們提供溝通交流和科學互動的寶貴平臺，推動癌癥科學與醫(yī)學的發(fā)展，促進國際間合作。大會議程覆蓋了癌癥研究的全部領(lǐng)域，從基礎(chǔ)研究到轉(zhuǎn)化醫(yī)學，再到臨床，眾多國內(nèi)外知名專家教授將會呈上一場場精彩演講。同時我們還會帶來AACR 2014全球年會(2014年4月5～9日在圣地亞哥舉行)上的精彩內(nèi)容。更多詳情請登陸大會網(wǎng)站www.AACR.com.cn，聯(lián)系熱線86-21-23123591。