和鳳軍 陳 普 陳學(xué)秋 唐柱生

云南中醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500

骨髓基質(zhì)干細(xì)胞 (Bone marrow stromal stem cells，BMSCs)屬于中胚層細(xì)胞，該細(xì)胞為多能干細(xì)胞，取材容易，對(duì)機(jī)體損傷小，易于基因操作，分離培養(yǎng)簡(jiǎn)便，擴(kuò)增能力強(qiáng)，免疫性低等特點(diǎn)。BMSCs在某些信號(hào)和特定條件的影響下，可分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞等，還可以跨胚層分化，已廣泛應(yīng)用于腦和脊髓損傷、骨損傷、軟骨缺損與損傷、心肌細(xì)胞損傷等的修復(fù)、基因治療和臨床治療的研究，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景?，F(xiàn)將骨髓基質(zhì)干細(xì)胞 (BMSCs)國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展綜述如下。

1 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)及應(yīng)用研究現(xiàn)狀

骨髓基質(zhì)干細(xì)胞 (BMSCs)又稱為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal sterm cells，MSCs)。1976 年Friedenstein等［1］首先提出骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 (MSCs)的概念。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 (MSCs)因其在培養(yǎng)時(shí)呈集落增殖和對(duì)塑料培養(yǎng)材料的貼壁特性，曾被稱為集落形成單位成纖維細(xì)胞 (colony forming unit fibroblasts，CFUF)或塑料貼壁細(xì)胞。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞 (BMSCs)存在于骨髓網(wǎng)狀間質(zhì)內(nèi)，可分化為骨髓基質(zhì)細(xì)胞 (bone marrow stromal cell，BMSC)等。因該細(xì)胞為多能干細(xì)胞，分離培養(yǎng)簡(jiǎn)便，擴(kuò)增能力強(qiáng)，免疫性低，同種移植或異種移植時(shí)免疫排斥反應(yīng)弱。BMSCs在某些信號(hào)和環(huán)境的影響下，錨靠一類組織，分化成該組織細(xì)胞。在骨髓中成熟的細(xì)胞能夠反分化［2-3］。在特定條件下，還可以跨胚層分化［4-5］。

有研究表明［6-7］，BMSCs體外分離培養(yǎng)后，在一定的信號(hào)和環(huán)境誘導(dǎo)下，可分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞等。在不同的微環(huán)境條件下已將BMSCs成功誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、心肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌肉、皮膚、肝、肺、神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等，且在人和嚙齒類動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)中均顯示了這種終身分化能力［8-11］。

BMSCs在腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子 (brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、堿性成纖維生長(zhǎng)因子的誘導(dǎo)或與腦組織細(xì)胞共同培養(yǎng)下，BMSCs可分化為具有神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志的細(xì)胞［12-13］，如微管相關(guān)蛋白1B、神經(jīng)元特異微管 (Tubulin)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶 (NSE)以及波形蛋白。Woodbury［14］等報(bào)道，在體外增加細(xì)胞內(nèi)cAMP含量，成年鼠和人的BMSCs可分化為早期神經(jīng)前體細(xì)胞。Tamir A等［23］研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs約10%處于S+G2+M期，大多數(shù)細(xì)胞處于G0/G1期，高比例的G0/G1期細(xì)胞說(shuō)明BMSCs具有高度分化的潛能。

目前BMSCs通過(guò)蛛網(wǎng)膜下腔注射用于脊髓損傷臨床治療［23，26］，通過(guò)局部注射或靜脈注射治療骨關(guān)節(jié)病［24］，均取得明顯臨床療效，安全性好，副作用輕，初步顯示了廣闊的臨床應(yīng)用價(jià)值。

2 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的制備、培養(yǎng)及生物學(xué)特性

2.1 BMSCs的制備、培養(yǎng) BMSCs主要存在于全身結(jié)締組織，以紅骨髓組織中含量最豐富，亦存在于胎兒臍血中［25］。BMSCs的體外培養(yǎng)始于 20世紀(jì) 70年代中期，F(xiàn)riedenstein等開(kāi)始用貼壁的方式培養(yǎng)分離到BMSCs，為紡錘形細(xì)胞，經(jīng)2～4d休眠后迅速增殖，且能多次傳代。

迄今為止，分離BMSCs的方法有:密度梯度離心法、貼壁篩選法、流式細(xì)胞儀法、全骨髓培養(yǎng)法、免疫磁珠法等。密度梯度離心法是利用骨髓中各種細(xì)胞的密度不同進(jìn)行分離;全骨髓培養(yǎng)法和貼壁篩選法是利用BMSCs易于貼壁的特性進(jìn)行純化;流式細(xì)胞儀法是根據(jù)細(xì)胞大小不同和細(xì)胞表面的特殊標(biāo)志進(jìn)行細(xì)胞分選。常用培養(yǎng)基為含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基。

常用的BMSCs分離液有兩種:Percoll分離液 (密度1.073g/mL)和Ficoll分離液 (密度1.077g/mL)。采用密度梯度離心法和貼壁篩選法相結(jié)合，利用Percoll分離液可得到高純度的BMSCs［15］。有研究者從臍靜脈的內(nèi)皮中分離出BMSCs［16］。因BMSCs取材簡(jiǎn)便，易于分離培養(yǎng)，組織相容性好，經(jīng)培養(yǎng)分離純化后可行自體移植、同種移植、異種移植。

2.2 BMSCs的生物學(xué)特性 人體骨髓中BMSCs含量很稀少，每1×105～106個(gè)單個(gè)核細(xì)胞中有一個(gè)BMSCs，體外分離培養(yǎng)、擴(kuò)增或純化才能滿足研究和治療的需要。對(duì)人和大鼠的熒光激活細(xì)胞分類 (fluorescence activated cell Sorter，F(xiàn)ACS)分析表明［17-18］，BMSCs含有三個(gè)細(xì)胞亞群:①大的和明顯成熟細(xì)胞 (mature BMSCs);②小的無(wú)顆粒細(xì)胞;③小的粒細(xì)胞 (RS-2 cells)。

傳代培養(yǎng)的BMSCs細(xì)胞形態(tài)均一，呈梭形、紡錘形。從第6代開(kāi)始凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增多，培養(yǎng)至9代后生長(zhǎng)緩慢，出現(xiàn)胞漿空泡化，胞體變大等老化現(xiàn)象。第3～6代可用于臨床治療使用［23］。BMSCs表達(dá)中等量MHC-I類分子，不表達(dá)MHC-Ⅱ類分子與人類白細(xì)胞抗原 (HLA)識(shí)別有關(guān)的T淋巴細(xì)胞共刺激分子，BMSCs免疫原性低，機(jī)體產(chǎn)生的免疫反應(yīng)很弱［23］。BMSCs可分泌多種生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素6、白細(xì)胞介素11、白細(xì)胞介素12等;還可分泌多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，如腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、膠質(zhì)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子等［23］。

目前雖然尚未發(fā)現(xiàn)BMSCs的特異性標(biāo)志物，但研究發(fā)現(xiàn)多能間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)特異性標(biāo)志物如:CD68，CD44，CD77，CD90，而不表達(dá)CD34造血干細(xì)胞的特異性標(biāo)志物［19］。向神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的BMSCs不表達(dá)造血譜系標(biāo)志物CD11，CD45， CD34， CD14， 而 表 達(dá) CD44， CD71，CD90［14］。流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞貼壁附著后均一表達(dá) SH2， SH3， CD29， CD44， CD71， CD90， CD106，CD120a，CD124等多種表面蛋白［20］。BMSCs表達(dá)多種表面抗原如粘附分子類、整合素家族、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子受體家族、干擾素受體和 TNF受體等［25］。BMSCs移植途徑有:靜脈注射、局部注射、硬膜內(nèi)注射、蛛網(wǎng)膜下腔注射、腹腔注射等。

3 BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化的研究進(jìn)展

BMSCs在EGF或BDNF誘導(dǎo)下可分化為神經(jīng)細(xì)胞［21］。Woodbury［14］在體外用 β 巰基乙醇 (BME)及二甲亞砜(DMSO)誘導(dǎo)BMSCs，培養(yǎng)大鼠的神經(jīng)細(xì)胞，80%的細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)元特異性烯醇化酶 (Neuron specific endolase，NSE)、神經(jīng)微絲蛋白 (Neurofilament-M，NF-M)及尼氏體。Hou L［22］在體外分離、提純、分化人臍帶血中的BMSCs，而在Mesencult培養(yǎng)基中用熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(FACS)將BMSCs在2、5、8通道誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元細(xì)胞。分化的神經(jīng)元細(xì)胞具有特異性標(biāo)志物NF、NSE及尼氏體，免疫組織化學(xué)檢測(cè)顯示細(xì)胞巢蛋白呈陽(yáng)性表達(dá)。

4 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用研究前景和展望

BMSCs因具備多向分化潛能，取材容易，對(duì)機(jī)體損傷小，易于基因操作，分離培養(yǎng)簡(jiǎn)便，擴(kuò)增能力強(qiáng)，組織相容性好等特點(diǎn)。在某些信號(hào)和特定微環(huán)境的誘導(dǎo)下，可分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞等，還可以跨胚層分化，已廣泛應(yīng)用于腦和脊髓損傷、骨損傷、軟骨缺損與損傷、心肌細(xì)胞損傷等的修復(fù)、基因治療、臨床治療的研究，取得了明顯的臨床療效，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。而B(niǎo)MSCs治療疾病的相關(guān)機(jī)理探索、BMSCs特異性標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)、BMSCs移植的遠(yuǎn)期安全性評(píng)價(jià)將成為今后的研究重點(diǎn)和研究方向。

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