陳為一 李小龍 齊岳亮 李洪利 尹崇高 劉曉麗 張寶剛 郭文君*

1.濰坊醫(yī)學院病理學教研室，山東 濰坊261053；2.濰坊醫(yī)學院醫(yī)學研究實驗中心，山東 濰坊261053；3.濰坊醫(yī)學院護理學院，山東 濰坊 261053

PTTG1影響膠質(zhì)瘤細胞侵襲力機制的研究

陳為一1 李小龍1 齊岳亮1 李洪利2 尹崇高3 劉曉麗3 張寶剛1 郭文君1*

1.濰坊醫(yī)學院病理學教研室，山東 濰坊261053；2.濰坊醫(yī)學院醫(yī)學研究實驗中心，山東 濰坊261053；3.濰坊醫(yī)學院護理學院，山東 濰坊 261053

背景與目的：研究證實垂體腫瘤轉(zhuǎn)化基因1(pituitary tumor transforming gene 1，PTTG1)的表達情況與各類腫瘤細胞的惡性程度有關(guān)，但是其在膠質(zhì)瘤中的作用尚不清楚。本研究旨在探討PTTG1在惡性膠質(zhì)瘤侵襲中的作用及其臨床意義。方法：應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測PTTG1蛋白在不同膠質(zhì)瘤細胞系中的表達；采用小RNA質(zhì)粒干擾技術(shù)抑制U87細胞中PTTG1蛋白的表達，應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染的效率；通過體外侵襲實驗檢測轉(zhuǎn)染后細胞侵襲力的變化；采用Western blot技術(shù)檢測經(jīng)過表皮細胞生長因子(epithelial growth factor，EGF)刺激后敲除PTTG1的細胞組(siPTTG1/U87)與轉(zhuǎn)染空載的細胞組(Scr/U87)中Akt、ARK5磷酸化的情況。結(jié)果：PTTG1蛋白在各惡性膠質(zhì)瘤細胞系中均高表達；敲除PTTG1后U87細胞的侵襲力明顯下降；對Scr/U87細胞進行EGF刺激5 min后，Akt、ARK5的磷酸化情況顯著增強，而無論有無EGF的刺激，siPTTG1/U87中Akt、ARK5的磷酸化情況都沒有明顯改變。結(jié)論：在惡性膠質(zhì)瘤細胞中，PTTG1蛋白呈高表達狀態(tài)并且與侵襲性顯著相關(guān)，其對侵襲性的調(diào)控可能是通過Akt-ARK5通路實現(xiàn)的。

膠質(zhì)瘤；侵襲；垂體腫瘤轉(zhuǎn)化基因1；ARK5；siRNA

膠質(zhì)瘤是一種預(yù)示著不良預(yù)后的實體腫瘤。其早期診斷困難，侵襲性強，即使在腫瘤診斷技術(shù)與治療方法日新月異的今天，全世界膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后依然沒有顯著的提高［1-3］。垂體瘤轉(zhuǎn)化基因1(pituitary tumor transforming gene1，PTTG1)最早是由Pei等［4］通過PCR技術(shù)從小鼠的垂體腫瘤細胞中發(fā)現(xiàn)的一種原癌基因。隨后，研究者在人類的睪丸中用克隆技術(shù)也發(fā)現(xiàn)了這種基因［5］。PTTG1被認為與腫瘤細胞的惡性程度和不良預(yù)后有關(guān)［6］。有研究表明，PTTG1與乳腺癌的復(fù)發(fā)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)［7］。但是，PTTG1是否與膠質(zhì)瘤的高侵襲性有關(guān)鮮見報道。已有研究證明，PTTG1位于PI3K/Akt通路的上游［8］，并且本實驗室的前期研究成果表明，ARK5對膠質(zhì)瘤的侵襲性有促進作用，并且與膠質(zhì)瘤患者的不良預(yù)后有密切關(guān)系［9］。因此，本研究旨在探討PTTG1在惡性膠質(zhì)瘤侵襲中的作用及臨床意義，并進一步分析影響膠質(zhì)瘤細胞的侵襲現(xiàn)象的分子機制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

正常星形細胞NHA購自美國ScienCell研究實驗室；U87、U251、LN-299細胞系購自美國ATCC細胞庫；RPMI-1640培養(yǎng)液購自美國Hyclone公司；一抗PTTG1購自美國Santa Cruz公司；一抗ARK5、p-ARK5、p-AKT購自美國Cell Signaling公司；表皮細胞生長因子(epithelial growth factor，EGF)購自美國R&D systems公司。胰蛋白酶、彩色預(yù)染蛋白、DOO18質(zhì)粒中量抽提試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；侵襲實驗所用24孔細胞培養(yǎng)板購自美國Corning公司；Matrigel膜基質(zhì)購自威格拉斯生物技術(shù)(北京)有限公司；24孔趨化小室、細胞轉(zhuǎn)染試劑購自北京康為世紀生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

U87、U251和LN-299細胞系均購自美國ATCC細胞庫，屬于人惡性膠質(zhì)瘤細胞系，具有高侵襲性。人類正常的星形細胞(normal human astrocytes，NHA)，購自美國ScienCell研究實驗室，無侵襲性。4種細胞均根據(jù)公司建議，采用常規(guī)細胞培養(yǎng)，操作參照本實驗室人員姬靜等［10］的研究。

1.2.2 質(zhì)粒構(gòu)建與細胞轉(zhuǎn)染

本研究所用質(zhì)粒PTTG1 siRNAs由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。取對數(shù)生長期的U87細胞做實驗，細胞分3組：①U87細胞，常規(guī)培養(yǎng)，不做任何處理；②Scr/U87細胞，瞬時轉(zhuǎn)染插入具有一段亂碼序列的質(zhì)粒做對照；③siPTTG1/U87，瞬時轉(zhuǎn)染插入具有目標片段5′-GACCCUGGAUGUUGAAUUG-3′的質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染步驟參照轉(zhuǎn)染試劑說明書。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)實驗

具體操作參照姬靜等［10］的研究。將轉(zhuǎn)染后的siPTTG1/U87細胞和Scr/U87細胞培養(yǎng)72 h后提取蛋白，制備SDS-PAGE凝膠，蛋白質(zhì)變性后電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，滴加一抗PTTG1、Akt、pARK5、pAkt進行溫育，二抗溫育后顯影。

1.2.4 體外癌細胞侵襲能力檢測

按姬靜等［10］的研究操作。結(jié)果置400倍光鏡下觀察，5個高倍鏡視野，計數(shù)Boyden小室下室面的細胞數(shù)即為穿透人工基膜的細胞數(shù)，每個實驗重復(fù)3次，取平均數(shù)作為實驗結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料之間的比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 PTTG1蛋白在膠質(zhì)瘤細胞系中高表達

對4種細胞系常規(guī)培養(yǎng)后，待細胞長到80%滿，提取蛋白做Western blot檢測。實驗結(jié)果顯示，PTTG1蛋白在各惡性膠質(zhì)瘤細胞系中均高表達，而在人類正常的星形細胞中不表達(圖1)。

圖1 PTTG1在不同細胞系中的表達Fig. 1 The expression of PTTG1 in different cells

2.2 PTTG1在siPTTG1/U87和SCR/U87中的表達

瞬時轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)72 h，然后提取蛋白，應(yīng)用Western blot實驗檢測蛋白含量。結(jié)果顯示PTTG1的表達在siPTTG1/U87細胞中明顯比在Scr/U87細胞中低(圖2)。提示細胞轉(zhuǎn)染成功。

圖2 PTTG1在siPTTG1/U87細胞和Scr/U87細胞中的表達Fig. 2 The expression of PTTG1 in the siPTTG1/U87 and Scr/ U87

2.3 PTTG1對膠質(zhì)瘤細胞U87侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響

轉(zhuǎn)染小RNA干擾質(zhì)粒成功之后，進行transwell實驗，固定染色后結(jié)果見圖2。經(jīng)過SPSS統(tǒng)計軟件分析，實驗組穿透Matrivgel基質(zhì)膜的細胞數(shù)(20.00±5.31)少于對照組細胞(40.00±4.48)，差異有統(tǒng)計學意義(t=11.1，P=0.000)。

圖3 體外侵襲實驗觀察PTTG1對U87細胞侵襲力的影響Fig. 3 The in fl uence of PTTG1 in the invasion of U87 in vitro (Giemsa, ×400)

2.4 EGF刺激細胞，檢測ARK5和Akt的磷酸化

為了研究PTTG1影響膠質(zhì)瘤細胞侵襲力現(xiàn)象的分子機制，本研究對Scr/U87細胞和siPTTG1/U87使用10 ng/mL EGF在無血清的培養(yǎng)基中分別刺激0和5 min，分析Akt與ARK5的磷酸化情況。結(jié)果顯示，在EGF刺激5 min后，Scr/U87細胞中Akt、ARK5的磷酸化增強；而siPTTG1/U87中，經(jīng)過EGF刺激5 min，Akt、ARK5磷酸化的水平均沒有明顯變化(圖4)。

圖4 EGF刺激后siPTTG1/U87細胞和Scr/U87細胞中Akt和ARK5磷酸化的變化Fig. 4 The differences of phosphorylation of Akt and ARK5 in the siPTTG1/U87 and Scr/U87 cells after EGF stimulation

3 討 論

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是人類高度惡性的腫瘤之一，兒童和50～60歲的人群是本病的高發(fā)人群，目前尚難以對其進行早期診斷和有效的治療。因膠質(zhì)瘤具有高度的侵襲性，幾乎不可能進行完整的手術(shù)切除，所以常會導(dǎo)致患者的殘疾甚至死亡［2］。

PTTG1是于1997年發(fā)現(xiàn)的一種原癌基因，在人類的睪丸和胸腺組織中高表達，在其他的組織中低表達，并且在很多的腫瘤組織和腫瘤細胞系中高表達。研究證明，PTTG1蛋白的表達與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的惡性程度和不良預(yù)后成正相關(guān)。因此，本研究考慮PTTG1與膠質(zhì)瘤的高侵襲性有一定關(guān)系。本實驗結(jié)果表明，成功將PTTG1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進U87細胞后，對siPTTG1/ U87細胞和SCR/U87細胞進行體外侵襲實驗。染色后顯微鏡下觀察，siPTTG1/U87與Scr/U87相比鏡下細胞數(shù)目明顯減少。說明敲除PTTG1后，膠質(zhì)瘤細胞系U87的侵襲力顯著減弱，證明PTTG1與膠質(zhì)瘤的侵襲性有影響。

ARK5作為AMPK亞家族的成員之一，是Akt的下游信號分子［11］。有研究證明，Akt與ARK5在腫瘤細胞的侵襲中有重要作用［12-13］。本研究前期的研究也已經(jīng)證明，ARK5影響了膠質(zhì)瘤細胞的侵襲性［9］。因此，PTTG1導(dǎo)致的人惡性膠質(zhì)瘤的高侵襲性可能與Akt-ARK5通路有關(guān)。

EGF是人體內(nèi)的一種活性物質(zhì)，由刺激表皮細胞生長因子受體(epithelial growth factor receptor，EGFR)使酪氨酸磷酸化，促進細胞的增值分化。EGFR是酪氨酸激酶受體，EGF與EGFR結(jié)合后，引起下游PI3K/Akt的磷酸化激活。本研究的前期研究表明ARK5位于Akt的下游［9］。本研究結(jié)果顯示，對SCR/U87細胞進行EGF刺激5 min后，ARK5的磷酸化明顯升高。而對siPTTG1/U87細胞進行EGF刺激5 min后，ARK5的磷酸化并沒有顯著變化。說明PTTG1影響膠質(zhì)瘤細胞的侵襲性可能是通過Akt-ARK5通路是實現(xiàn)的。

綜上所述，本研究證實，PTTG1在惡性膠質(zhì)瘤的侵襲性中扮演重要角色，并且這種調(diào)控可能是通過Akt-ARK5通路實現(xiàn)的。糾正PTTG1蛋白在膠質(zhì)瘤細胞中的高表達不僅可以有效的降低其侵襲性，而且可以提高惡性膠質(zhì)瘤患者的生存率并改善預(yù)后。

［1］李莉, 馬秀梅, 曹鴻斌, 等. 惡性腦膠質(zhì)瘤三維適形放療與調(diào)強適形放療劑量學對比研究 ［J］. 中國癌癥雜志, 2008, 18(12): 907-912.

［2］STEWART L A. Chemotherapy in adult high-grade glioma: a systematic review and meta-analysis of individual patient data from 12 randomised trials ［J］. Lancet, 2002, 359: 1011-1018.

［3］STUPP R, MASON W P, VAN DEN BENT M J, et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma ［J］. N Engl J Med, 2005, 352: 987-996.

［4］PEI L, MELMED S. Isolation and characterization of a pituitary tumor-transforming gene (PTTG) ［J］. Mol Endocrinol, 1997, 11: 433-441.

［5］KAKAR S S. Molecular cloning, genomic organization, and identification of the promoter for the human pituitary tumor transforming gene (PTTG) ［J］.Gene, 1999, 240: 317-324.

［6］LI H, YIN C, ZHANG B, et al. PTTG1 promotes migration and invasion of human non-small cell lung cancer cells and is modulated by miR-186 ［J］.Carcinogenesis, 2013, 34: 2145-2155.

［7］SOLBACH C, ROLLER M, FELLBAUM C, et al. PTTG mRNA expression in primary breast cancer: a prognostic marker for lymph node invasion and tumor recurrence ［J］. Breast, 2004, 13: 80-91.

［8］SANCHEZ-TEJADA L, SANCHEZ-ORTIGA R, MORENOPEREZ O, et al. Pituitary tumor transforming gene and insulin-like growth factor 1 receptor expression and immunohistochemical measurement of Ki-67 as potential prognostic markers of pituitary tumors aggressiveness ［J］. Endocrinol Nutr, 2013, 60: 358-367.

［9］LU S, NIU N, GUO H, et al. ARK5 promotes glioma cell invasion, and its elevated expression is correlated with poor clinical outcome ［J］. Eur J Cancer, 2013, 49: 752-763.

［10］姬靜, 張寶剛, 張偉棟, 等. ARK5與乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究 ［J］. 臨床與實驗病理學雜志, 2012: 382-385.

［11］SUZUKI A, KUSAKAI G, KISHIMOTO A, et al. Identification of a novel protein kinase mediating Akt survival signaling to the ATM protein ［J］. J Biol Chem, 2003, 278: 48-53.

［12］SUZUKI A, LU J, KUSAKAI G, et al. ARK5 is a tumor invasion-associated factor downstream of Akt signaling ［J］. Mol Cell Biol, 2004, 24: 3526-3535.

［13］SUZUKI A, OGURA T, ESUMI H. NDR2 acts as the upstream kinase of ARK5 during insulin-like growth factor-1 signaling［J］. J Biol Chem, 2006, 281: 13915-13921.

Effect of PTTG1 in the invasion of glioma cells

CHEN Wei-yi1, LI Xiao-long1, QI Yue-liang1, LI Hongli2, YIN Chong-gao3, LIU Xiao-li3, ZHANG Bao-gang1, GUO Wen-jun1(1. Department of Pathology, Weifang Medical University, Weifang Shandong 261053, China; 2. Medicine Research Center, Weifang Medical University, Weifang Shandong 261053, China; 3. College of Nursing, Weifang Medical University, Weifang Shandong 261053, China)

Background and purpose:Numerous researches indicated that the expression of pituitary tumor transforming gene1 (PTTG1) was correlated with the severity of glioma tumors. However the specific mechanism of PTTG1 is not clear in glioma. In this study, we explored the role and significance of PTTG1 in the invasion of glioma cells.Methods:Western blot was used to detect the expression of PTTG1 protein in various glioma cell lines. siRNA plasmid was used to transfect U87 cells. Western blot was used to analyze the expression of PTTG1 protein in transfected U87 cells. Matrigel invasion assay was used to detect the invasive ability in the cells being transfected in vitro. Western blot was used to analyze epithelial growth factor (EGF) induced protein phosphorylation of ARK5 and Akt in the cells being transfected PTTG1 plasmid (siPTTG1/U87) and scrambled siRNA (Scr/U87).Results:The expression of PTTG1 protein was higher in all glioma cell lines. After transfection, the invasion of siPTTG1/U87 was obviously decreased after 5 min with EGF stimulation than the Scr/U87, the phosphorylation of ARK5 and Akt was significantly enhanced. However, whether or not the existence of EGF, the phosphorylation of ARK5 and Akt had

Glioma; Invasiveness; PTTG1; ARK5; siRNA

10.3969/j.issn.1007-3969.2014.05.002

R739.41

A

1007-3639(2014)05-0329-04

2013-11-18

2014-04-06）

國家自然科學基金(No: 81072068)；山東省中青年科學家科研獎勵基金(No:2010BSB14050、BS2011YY060)；山東省高等學?？萍加媱?No: J12LK03、J13LK03)；濰坊醫(yī)學院青年科技創(chuàng)新基金(No: K11QC1002)。

郭文君 E-mail:13963669930@163.com

no differences in siPTTG1/U87.Conclusion:In glioma cells, PTTG1 protein is high expressed and maybe have an important function in glioma cells invasion through Akt-ARK5 signaling pathway.