范學政，李翠，寧宜寶，曲鴻飛

（中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081）

病毒類疫苗中外源病毒污染、檢測方法與控制措施

范學政，李翠，寧宜寶*，曲鴻飛

（中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081）

就疫苗中污染外源病毒的情況、外源病毒傳統(tǒng)檢測技術及新型分子檢測技術等進行了綜述，并提出通過嚴格按照GMP規(guī)范組織生產(chǎn)，加強對菌（種）毒和細胞庫的質(zhì)量控制，嚴格控制生產(chǎn)檢驗原材料質(zhì)量，進一步完善標準方法、提高檢驗水平，開展外源因子風險評估研究等措施以降低污染風險。

疫苗；外源病毒；檢測方法；控制措施

疫苗是預防傳染性疾病有效手段之一。在過去幾十年里，由于傳代細胞系和大規(guī)模培養(yǎng)技術的使用，疫苗生產(chǎn)技術已取得了令人矚目的成就。然而，由于疫苗生產(chǎn)用原材料如動物組織、細胞基質(zhì)、血清、胰蛋白酶等來源于動物，存在外源因子（extraneous agents，EA）污染的風險。外源因子是指生物制品生產(chǎn)過程中存在于菌毒種、細胞基質(zhì)及生產(chǎn)制品所用的原材料及制品中的污染物，包括細菌、真菌、支原體和病毒，如源于牛血清的牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）是疫苗中最常見的污染物之一［1］。通常外源因子主要指病毒性外源因子（簡稱外源病毒），在過去60年中，發(fā)生過多起疫苗污染外源病毒事件。因部分外源病毒具有致病性，污染可能會引起生物安全問題。

目前經(jīng)鑒定的病毒數(shù)量約2300種。然而，地球上的病毒種類可能超過150000種［2］。另外，病毒常以持續(xù)突變的方式進化，并產(chǎn)生許多突變株，形成病毒準種以快速適應環(huán)境［3］。因此，尚有大量病毒有待于發(fā)現(xiàn)和研究。但隨著科學的發(fā)展，建立了許多新型檢驗技術，有些過去未發(fā)現(xiàn)的外源病毒逐漸引起人們的重視。本文就疫苗中污染外源病毒的歷史與現(xiàn)狀及外源病毒檢驗技術進行了綜述，并提出了控制獸用疫苗質(zhì)量的建議措施。

1 疫苗污染外源病毒情況回顧

20世紀50年代，用于疫苗生產(chǎn)的原代猴腎細胞培養(yǎng)基質(zhì)發(fā)現(xiàn)了泡沫病毒（Spumaretroviridae）污染，引起細胞培養(yǎng)物中出現(xiàn)泡沫樣融合，導致細胞裂解和細胞培養(yǎng)物破壞，但它不引起動物任何臨床癥狀，被感染動物會終生持續(xù)帶毒［4］。20世紀60年代，發(fā)現(xiàn)雞胚成纖維細胞生產(chǎn)的黃熱弱毒活苗污染了禽白血病毒（ALV）［5－6］；1990年在犬苗中發(fā)現(xiàn)可引起母狗流產(chǎn)和死胎的藍舌病毒污染［7－9］；1996／1997年在丹麥使用的禽用活疫苗中發(fā)現(xiàn)了I型副粘病毒（APMV－1）污染［10］；2003年在CHO細胞傳代過程中發(fā)現(xiàn)污染了杯狀病毒（又名卡里西病毒，Calicivirus）［11］。

RD114是另一種新發(fā)現(xiàn)的EA，是一種復制型貓內(nèi)源性γ－逆轉(zhuǎn)錄病毒，可感染貓科以外的宿主［12］，近幾年在貓細小病毒疫苗［13］、犬細小病毒2型疫苗［14－15］等多種疫苗中被發(fā)現(xiàn)。RD114可來源于內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒敏感細胞系，如CrFK細胞系［16］，該細胞系被廣泛用于生產(chǎn)犬用疫苗。

目前為止最有名的人用疫苗污染事件當屬20世紀小兒麻痹癥疫苗中污染猿猴空泡病毒40（Simian vacuolating virus 40，SV40）事件。SV40是一種多瘤DNA病毒，有造成腫瘤發(fā)生的潛在能力，不過通常會維持于潛伏感染狀態(tài)。由于用來培養(yǎng)疫苗病毒的猴腎細胞污染了SV40，導致疫苗污染。1955－1963年間，在美國、英國、澳大利亞、前蘇聯(lián)以及其他許多國家數(shù)千萬人接受過小兒麻痹癥疫苗注射，由于SV40存在潛在的致癌性，免疫后的癌癥發(fā)生是否與此次疫苗污染事件有關，一直不明確，直到目前，也未發(fā)現(xiàn)污染疫苗與人腫瘤病例之間的聯(lián)系［17］，盡管如此，此次事件還是引起了不小的恐慌和公眾的高度關注。

近年來，發(fā)現(xiàn)嬰兒廣泛使用的輪狀病毒疫苗Rotarix中有PCV1污染，引起了公眾對疫苗生物安全的極大關注。葛蘭素史克公司（GSK）確認在細胞庫和種毒中存在PCV1，可能是生產(chǎn)過程中使用的豬胰酶帶毒所致。PCV1對人體無害，對自然宿主豬也不致病，也沒有任何一個國家出現(xiàn)Rotarix疫苗嚴重不良反應的報道。除了Rotarix疫苗外，在另一種抗輪狀病毒疫苗Rotateq中發(fā)現(xiàn)污染了（Simian retrovirus，SRV）的DNA片斷［18］。

我國生物制品生產(chǎn)用細胞也曾出現(xiàn)過外源因子污染［19］。20世紀80年代，普通雞胚生產(chǎn)的禽用活疫苗中經(jīng)常檢出支原體污染［20］；禽用活疫苗中曾檢出ALV、REV和CAV等外源病毒；豬瘟活疫苗（脾淋源）中檢出兔出血癥病毒（RHDV）［21］，而以前用原代牛睪丸細胞生產(chǎn)的豬瘟活疫苗（細胞源）污染BVDV比較嚴重［22］。

有些外源病毒的副作用和影響目前尚不能全面評估，如新型肝炎病毒（又名細環(huán)病毒，Torque teno virus，TTV），經(jīng)PCR檢測證實在含豬源原輔材料的生物制品（包括豬用疫苗）中普遍存在［23］，目前還未發(fā)現(xiàn)有害，還未作為控制的對象。然而，人為因素將病原引入新的宿主可能會帶來十分復雜的病毒學情況，如用污染了圓環(huán)病毒的疫苗免疫豬時，對于斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）的發(fā)生和擴散起到了重要作用［24］，而用羊腦生產(chǎn)的預防羊震顫?。↙ouping Ill）的滅活疫苗，與羊瘙癢?。⊿crapie）蔓延有明確的關系［24］。因此，對于此類外源病毒還需長期關注。

2 外源病毒檢測方法

2.1 傳統(tǒng)檢測方法 傳統(tǒng)檢測外源病毒的方法主要有血吸附檢查法、細胞培養(yǎng)法、雞胚檢查法和實驗動物抗體檢測法。幾十年來，傳統(tǒng)的檢測法已經(jīng)成為廣泛篩查外源病毒的標準方法。血凝抑制試驗、免疫熒光等方法也可用來檢測外源病毒。細胞培養(yǎng)在病毒檢測中具有核心地位，大大方便了下游實驗室分析。但是，許多潛在外源致病因子不能在細胞上復制，或者沒有建立合適的動物模型，使得傳統(tǒng)檢測方法受到嚴重束縛。

2.2 常規(guī)PCR檢測方法 核酸檢測方法非常敏感，能檢測到未出現(xiàn)發(fā)病癥狀時的少量病毒，但需要先知道待檢測病毒的核酸序列［25］。此外，因為PCR等分子檢驗技術只檢測核酸，不能證明是否感染，對于PCR陽性結(jié)果的解釋較為復雜，經(jīng)常需要進一步檢測。如果PCR之前用RNase／DNase消化消除背景DNA，而病毒粒子的核酸會受到保護，不被降解，這種方法會改善檢測敏感性，這樣得到的PCR陽性結(jié)果就會準確表明完整病毒粒子（可能是感染性病毒粒子）的存在［26］，這可能會有助于解釋PCR檢測的是非感染性基因片斷，還是病毒粒子。

2.3 基于探針的核酸檢測方法 除了傳統(tǒng)的PCR方法外，還有多種實時PCR（real－time PCR）方法，這些方法用的試劑變化也很大，如TaqMan、分子信標（MB）、蝎形引物、雙探針、染料標記寡核苷酸連接或引物探針能量轉(zhuǎn)移系統(tǒng)（PriProET）等。在獸醫(yī)領域，實時PCR正在替代傳統(tǒng)的PCR。PriProET是實時PCR方法中診斷能力最強的，因為PriProET需要的保守區(qū)更短，對于單個堿基突變更敏感［27－29］。另外，鄰近連接技術（proximity ligation assay，PLA）是一種特殊的免疫分析方法，可用于檢測目標蛋白及蛋白相互作用等。該方法通過一對標記有一段寡聚脫氧核苷酸（單鏈DNA）的單克隆或多克隆抗體的探針，即PLA探針，識別目的蛋白。當這兩個探針識別同一個蛋白時，兩個探針之間的距離靠近，此時通過加入一段分別與在抗體連接的DNA互補的DNA短片段，PLA探針上的DNA與該段DNA互補，然后在連接酶的作用下，PLA探針上的DNA形成一條新的DNA片段，通過熒光PCR就可以擴增并進行定量［30－31］。

2.4 深度測序分析技術 最新技術的使用，如不依賴序列的分子技術與高通量測序或基因芯片分析可能會改善并加速病毒的檢測，為疫苗質(zhì)量控制提供了新的方法，使目前一些未知致病因子和可疑污染因子在預先沒有任何基因信息的情況下被發(fā)現(xiàn)。Rotarix疫苗中污染的PCV1以及Rotateq疫苗中污染的SRV核酸片段均是利用RNase／DNase消化樣本，通過大規(guī)模并行測序（Massive Parallel Sequencing，MPS）結(jié)合不依賴核酸序列的分子技術以及基因芯片檢驗技術發(fā)現(xiàn)的［18］。隨機PCR結(jié)合MPS和基因芯片技術與細胞培養(yǎng)或病原特異性PCR等現(xiàn)有法定方法相比，能檢測出范圍更廣的潛在外源因子。

3 減少外源病毒污染的技術措施

為保證生物制品安全，所有起始材料和最終產(chǎn)品都必需檢測潛在污染物。盡管如此，污染風險還不能完全排除，只是盡可能降低。對于新發(fā)現(xiàn)的因子并沒有具體規(guī)定和檢測方法，應該采取什么措施才能最大程度地提高安全性值得考慮。對于獸用疫苗，筆者建議從以下幾個方面減少外源病毒污染風險：

3.1 嚴格按照GMP規(guī)范組織生產(chǎn) 獸藥GMP即獸藥生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范，是獸藥生產(chǎn)行業(yè)的質(zhì)量管理執(zhí)行準則，是在生產(chǎn)中用科學管理、規(guī)范化的條件和程序來保證生產(chǎn)優(yōu)良藥品的整套科學管理體系。疫苗生產(chǎn)企業(yè)必須嚴格按照GMP規(guī)范組織生產(chǎn)，對疫苗生產(chǎn)全過程進行質(zhì)量控制，重點加強對原輔材料質(zhì)量控制，制定嚴格的內(nèi)控質(zhì)量標準，認真開展原輔材料入廠檢測工作。

3.2 加強對菌（種）毒和細胞庫的質(zhì)量控制 疫苗種子直接關系到最終產(chǎn)品的質(zhì)量。因此，疫苗的菌（毒）種應作系統(tǒng)鑒定，每批基礎種子均應嚴格按規(guī)定進行鑒定，以保證其同質(zhì)性、安全性、有效性和純凈性。鑒于用新型分子技術證實原始種子污染外源因子的事件，建議對現(xiàn)有基礎種子用基因組測序等最新分子技術進行系統(tǒng)鑒定，盡可能排除潛在外源因子污染。對生產(chǎn)和檢驗用細胞庫，建議分析是否存在內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒，并根據(jù)疫苗特性和細胞使用目的進行外源因子擴散的風險分析。對于準備注冊的生物制品，在細胞庫和種毒庫制備環(huán)節(jié)適當采用現(xiàn)代分子生物學方法輔助檢測等。

3.3 嚴格控制生產(chǎn)檢驗原材料質(zhì)量 獸用生物制品的生產(chǎn)常用到牛血清、胰酶及牛血清白蛋白等，這些原材料具有生物活性，其生物安全較難控制。對于牛血清、細胞，不應帶有BVDV、PCV、PPV等外源病毒污染。禽源細胞特別是不要污染ALV、REV及CAV等外源病毒。目前我國已強制要求獸用活疫苗生產(chǎn)必需用SPF雞胚，徹底杜絕用非免疫雞胚制備活疫苗。對于牛血清的來源，建議結(jié)合全球流行病學數(shù)據(jù)，對牛血清原產(chǎn)地和生產(chǎn)工藝等制定指導性原則，防止牛血清帶來的BVDV等污染。重要生物源材料生產(chǎn)企業(yè)需遵循特定標準，如ISO認證等，建議疫苗生產(chǎn)企業(yè)采購通過認證企業(yè)生產(chǎn)的生物源材料。

3.4 進一步完善標準方法，提高檢驗水平 實施GMP以來，我國獸用生物制品企業(yè)檢驗水平不斷提高，《獸用生物制品質(zhì)量標準》中規(guī)定的大部分檢驗項目能夠?qū)嵤＝鼛啄晡覈F用疫苗的質(zhì)量在不斷提高，但也有部分獸用生物制品企業(yè)檢驗技術不夠規(guī)范，檢驗項目不全，新增的檢驗項目或檢驗技術、檢驗條件要求較高的項目難以開展，檢驗用原材料或試劑不符合標準，如檢驗用雞、雞胚達不到SPF級。因此，需不斷完善生物原材料和檢驗用動物標準，規(guī)范檢驗試劑的生產(chǎn)，保障檢驗試劑質(zhì)量。建議由主管門協(xié)調(diào)官方權威實驗室對外源因子檢驗方法、檢驗試劑和參考品進行比較驗證，確定最佳檢驗方案。

3.5 開展外源因子風險評估研究 建議國家設立專項對新發(fā)因子流行情況、危害及檢測方法等開展研究，并基于風險－收益評估理論制定疫苗生產(chǎn)中外源因子污染控制方案。

4 結(jié)語

外源病毒污染會影響疫苗的使用效果，甚至會引起生物安全問題。關注疫苗外源病毒污染，降低潛在風險，是生物制品行業(yè)和管理部門的重要責任。只有不斷提高生產(chǎn)管理規(guī)范化程度，提高生產(chǎn)企業(yè)和官方實驗室檢驗水平，建立可靠的和標準的檢驗體系，提高發(fā)現(xiàn)污染、鑒定新發(fā)外源因子的能力，才能將外源因子污染風險降至最低，保障疫苗質(zhì)量和安全性。

［1］ Falcone E，Tollis M，Conti G.Bovine viral diarrhea disease associated with a contaminated vaccine［J］.Vaccine，1999，18：387－388.

［2］ Pastoret P P.Human and animal vaccine contaminations［J］.Biologicals，2010，38：332－334.

［3］ Domingo E.Mechanisms of viral emergence［J］.Vet Res，2010，41：38.

［4］ Meiering C D，Linial M L.Historical perspective of foamy virus epidemiology and infection［J］.Clin Microbiol Rev，2001，14：165－176.

［5］ Harris R J，Dougherty R M，Biggs P M，et al.Contaminant viruses in two live virus vaccines produced in chick cells［J］.J Hyg（Lond），1966，64（1）：1－7.

［6］ Draper C C.A yellow fever vaccine free from avian leucosis viruses［J］.J Hyg（Lond），1967，65（4）：505－513.

［7］ Levings R L，Wilbur L A，Evermann J F，et al.Abortion and death in pregnant bitches associated with a canine vaccine contaminated with bluetongue virus［J］.Dev Biol Stand，1996，88：219－220.

［8］ O’Toole D，Van Campen H，Woodard L.Bluetongue virus：contamination of vaccine［J］.J Am Vet Med Assoc，1994，205：407－408.

［9］ Wilbur L A，Evermann J F，Levings R L，et al.Abortion and death in pregnant bitches associated with a canine vaccine contaminated with bluetongue virus［J］.J Am Vet Med Assoc，1994，204：1762－1765.

［10］Jorgensen P H，Handberg K J，Ahrens P，et al.Similarity of avian paramyxovirus serotype 1 isolates of low virulence for chickens obtained from contaminated poultry vaccines and from poultry flocks［J］.Vet Rec，2000，146：665－668.

［11］Oehmig A，Buttner M，Weiland F，et al.Identification of a calicivirus isolate of unknown origin［J］.J Gen Virol，2003，84：2837－2845.

［12］Reeves R H，O’Brien S J.Molecular genetic characterization of the RD－114 gene family of endogenous feline retroviral sequences［J］.J Virol，1984，52：164－171.

［13］Miyazawa T，Yoshikawa R，Golder M，et al.Isolation of an infectious endogenous retrovirus in a proportion of live attenuated vaccines for pets［J］.J Virol，2010，84：3690－3694.

［14］Yoshikawa R，Sato E，Miyazawa T.Contamination of infectious RD－114 virus in vaccines produced using non－feline cell lines［J］.Biologicals，2011，39：33－37.

［15］Yoshikawa R，Shimode S，Sakaguchi S，et al.Contamination of live attenuated vaccines with an infectious feline endogenous retrovirus（RD－114 virus）［J］.Arch Virol，2014，159：399－404.

［16］Baumann J G，Gunzburg W H，Salmons B.CrFK feline kidney cells produce an RD114－like endogenous virus that can package murine leukemia virus－based vectors［J］.J Virol，1998，72：7685－7687.

［17］Shah K V.SV40 and human cancer：a review of recent data［J］.Int J Cancer，2007，120：215－223.

［18］Victoria J G，Wang C，Jones M S，et al.Viral nucleic acids in live－attenuated vaccines：detection of minority variants and an adventitious virus［J］.J Virol，2010，84：6033－6040.

［19］孟淑芳，李修蘭，馮建平，等.我國生物制品生產(chǎn)用細胞外源因子污染情況檢測［J］.中國生物制品學雜志，2006，06：627－629，632.

［20］寧宜寶，冀錫霖.國內(nèi)禽用活病毒疫苗中支原體污染的調(diào)查報告［J］.中國獸藥雜志，1993，01：34－36.

［21］高金源，陳曉春，韓玉玲，等.豬瘟活疫苗（脾淋源）污染外源性兔出血癥病毒的檢測與啟示［J］.中國獸藥雜志，2011，12：16－18.

［22］范學政，寧宜寶，王琴，等.用RT－PCR方法檢測豬瘟細胞苗中污染牛病毒性腹瀉病毒［J］.中國獸醫(yī)雜志，2010，01：8－10.

［23］Dodet B，Hesselink W，Jungback C，et al.Viral safety and extraneous agents testing for veterinary vaccines［J］.Biologicals，2010，38：326－331.

［24］Farsang A，Kulcsár G.Extraneous agent detection in vaccinesa review of technical aspects［J］.Biologicals，2012，40（4）：225－230.

［25］Rose T M.CODEHOP－mediated PCR－a powerful technique for the identification and characterization of viral genomes［J］.Virol J，2005，2：20.

［26］Allander T，Emerson S U，Engle R E，et al.A virus discovery method incorporating DNase treatment and its application to the identification of two bovine parvovirus species［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2001，98：11609－11614.

［27］Belak S.Molecular diagnosis of viral diseases，present trends and future aspects a view from the OIE collaborating centre for the application of polymerase chain reaction methods for diagnosis of viral diseases in veterinary medicine［J］.Vaccine，2007，25：5444－5452.

［28］Barfoed A M，Ostergaard E，F(xiàn)randsen P L，et al.Development of a primer－probe energy transfer based real－time PCR for detection of Marek＇s disease virus［J］.J Virol Methods，2010，165：21－26.

［29］Hakhverdyan M，Rasmussen T B，Thoren P，et al.Development of a real－time PCR assay based on primer－probe energy transfer for the detection of swine vesicular disease virus［J］.Arch Virol，2006，151：2365－2376.

［30］Gustafsdottir S M，Nordengrahn A，F(xiàn)redriksson S，et al.Detection of individual microbial pathogens by proximity ligation［J］.Clin Chem，2006，52：1152－1160.

［31］Hansen M C，Nederby L，Henriksen M O，et al.Sensitive ligand－based protein quantification using immuno－PCR：a critical review of single－probe and proximity ligation assays［J］.Biotechniques，2014，56：217－228.

（編輯：李文平）

Contamination of Extraneous Virus in Viral Vaccine and Detection Methods，Purification Control Strategies

FAN Xue－zheng，LI Cui，NING Yi－bao*，QU Hong－fei
（China Institute of Veterinery Drug Control，Beijing 100081，China）

The history and present situation，convetional detection assays and new molecular assays about were reviewed in this paper.Purification control strategies including operation strictly according GMP specification，enhancing management of virus seeds，strict quality control of raw material，improving and constituting standard assays，improving test level，and carrying out some risk analysis on extraneous pathogens were suggested in order to ensure purity of vaccine.

vaccine；extraneous pathogens；detection methods；control strategies

2014－07－08

A

1002－1280（2014）11－0057－05

S859.79＋7

948項目－獸藥監(jiān)察關鍵技術引進［（2011）－G（3）］

范學政，副研究員，博士，從事動物傳染病防控技術研究。

寧宜寶。E－mail：ningyibao＠ivdc.gov.cn