趙鳳霞，高相彬，王正平，李海峰，宋學(xué)立，冀敏

1 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，河南許昌 461000；

2 河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，河南鄭州 450000；

3 國家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局專利局專利審查協(xié)作北京中心，北京 100190

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在煙草研究中的應(yīng)用進(jìn)展

趙鳳霞1，高相彬1，王正平1，李海峰2，宋學(xué)立1，冀敏3

1 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，河南許昌 461000；

2 河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，河南鄭州 450000；

3 國家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局專利局專利審查協(xié)作北京中心，北京 100190

綜述了蛋白質(zhì)組學(xué)作為后基因組時(shí)代功能基因組學(xué)研究的重要組成部分和前沿研究領(lǐng)域，在煙草研究中的應(yīng)用進(jìn)展，探討了煙草根系、葉片等器官的蛋白質(zhì)分離提取方法，蛋白質(zhì)組學(xué)在低溫、鹽脅迫和機(jī)械損傷等逆境脅迫研究中的應(yīng)用，煙株應(yīng)對(duì)施肥、紫外線輻射、打頂和病害入侵等環(huán)境變化所發(fā)生的生理、病理反應(yīng)的內(nèi)在調(diào)控機(jī)制研究，以及蛋白質(zhì)組學(xué)在提高煙葉品質(zhì)研究中的應(yīng)用。最后提出了目前煙草蛋白質(zhì)組學(xué)研究所面臨的幾個(gè)問題，并對(duì)下一步的研究和發(fā)展前景進(jìn)行了展望。

煙草；蛋白質(zhì)組學(xué)；脅迫反應(yīng)；調(diào)控機(jī)制

蛋白質(zhì)組（proteome）由蛋白質(zhì)的“Prote”和基因組的“ome”字母拼接而成，指一個(gè)基因組或一類細(xì)胞、組織表達(dá)的所有蛋白質(zhì)的總和[1]，由澳大利亞學(xué)者Wilkins和Williams于1994年在意大利的一次電泳會(huì)議上首次提出。同基因組相似，蛋白質(zhì)組為復(fù)雜發(fā)育過程中同時(shí)發(fā)生的蛋白質(zhì)相關(guān)變化提供了重要的高通量研究手段[2]，與基因組相比，蛋白質(zhì)組反映的是直接影響細(xì)胞生理生化變化的蛋白質(zhì)。此外，比較RNA的表達(dá)水平，蛋白質(zhì)水平整合了轉(zhuǎn)錄后加工和翻譯后加工的過程，而這些過程對(duì)細(xì)胞中最終產(chǎn)物的數(shù)量、定位和效率都會(huì)產(chǎn)生影響[3]。蛋白質(zhì)組學(xué)是一項(xiàng)使用日漸廣泛的研究方法，對(duì)兩種不同的材料或處理，可以從蛋白質(zhì)表達(dá)譜的寬度進(jìn)行比較研究，揭示其中的內(nèi)在機(jī)理?；谛盘?hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和代謝途徑的上下游網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)組的研究不僅具有高通量的寬度，而且為生命過程的上下游節(jié)點(diǎn)研究提供了良好的機(jī)會(huì)。蛋白質(zhì)組概念的提出，為科學(xué)家對(duì)于生命活動(dòng)規(guī)律的研究開拓了新的領(lǐng)域。進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究是大勢(shì)所趨，也是后基因組時(shí)代的重要研究前沿和熱點(diǎn)領(lǐng)域[4]。

蛋白質(zhì)組學(xué)的主要研究?jī)?nèi)容為蛋白質(zhì)間的相互作用、翻譯后的修飾、蛋白質(zhì)在不同部位、不同環(huán)境條件下以及生命過程不同階段的表達(dá)等方面[5]，闡明組織、器官或者生物體全部或者部分蛋白質(zhì)的表達(dá)模式及功能模式，揭示特定的生命現(xiàn)象和某些生命過程的內(nèi)在機(jī)制，它是在更深層次上探索生命活動(dòng)的規(guī)律和生理、病理現(xiàn)象。自1997年第一篇植物蛋白質(zhì)組學(xué)文章發(fā)表以來,伴隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)體系的不斷完善,植物蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)展迅速，多種植物組織(器官)的蛋白質(zhì)表達(dá)譜分析相繼完成，植物不同發(fā)育階段的蛋白質(zhì)組變化，以及此過程中植物響應(yīng)各種環(huán)境因子和逆境脅迫的差異表達(dá)蛋白質(zhì)組也被大量報(bào)道[6-8]。

煙草是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，具有悠久的栽培歷史，其生產(chǎn)行業(yè)已經(jīng)成為國民經(jīng)濟(jì)的一個(gè)重要組分,也是一些地方省市的財(cái)政支柱。同時(shí)，煙草還是一種重要的模式植物，在植物遺傳、發(fā)育和轉(zhuǎn)基因等領(lǐng)域的研究中具有特殊意義。蛋白質(zhì)雙向電泳、質(zhì)譜、酵母雙雜交系統(tǒng)、蛋白質(zhì)微陣列、支持大規(guī)模數(shù)據(jù)處理的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)和軟件、軟電離以及生物信息學(xué)等蛋白質(zhì)組技術(shù)的快速發(fā)展，為煙草蛋白質(zhì)組學(xué)研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)[9]。近年來科研工作者對(duì)煙草進(jìn)行了大量研究，作為一種新興手段，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在煙草研究中取得了豐碩的成果。本文對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)在煙草中的應(yīng)用相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

1 蛋白質(zhì)提取、分離方法研究

蛋白質(zhì)組學(xué)是隨著蛋白質(zhì)研究技術(shù)的快速發(fā)展而發(fā)展起來的。蛋白質(zhì)分離技術(shù)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的三大核心技術(shù)之一[10]，其中最常用的分離技術(shù)是蛋白質(zhì)雙向電泳(Two-dimensional electrophoresis，2-DE)，而蛋白質(zhì)的提取和樣品制備對(duì)雙向電泳的分辨率和重復(fù)性起著舉足輕重的作用[11-13]。目前蛋白質(zhì)的提取方法很多，但由于不同植物具有特異的生理生化特性，蛋白質(zhì)的最適提取方法差異較大，甚至同一植物不同組織(器官)的最適提取方法也不盡相同。采用恰當(dāng)?shù)奶崛》椒ㄊ谦@得具有良好分離效果2-DE圖譜的前提條件[14]。因此探索煙草不同組織(器官)的高質(zhì)量蛋白質(zhì)提取分離技術(shù)具有迫切的現(xiàn)實(shí)意義。

煙草根系既是水分和養(yǎng)分吸收的主要器官，又是煙堿等重要次生代謝物質(zhì)合成的主要場(chǎng)所，與煙株發(fā)育和煙葉產(chǎn)量、品質(zhì)密切相關(guān)。研究煙草特殊生長環(huán)境下或某個(gè)發(fā)育時(shí)期根系蛋白質(zhì)的表達(dá)情況，對(duì)于及時(shí)了解煙草生長發(fā)育過程中某些代謝途徑具有重要意義。然而煙草根系中蛋白質(zhì)含量相對(duì)較低，并且含有大量的多糖、多酚、蛋白酶、氧化酶、酯類、醛類和其它次生代謝物質(zhì)，為根系蛋白質(zhì)的提取增加了一定的難度。林世鋒等以栽培煙草品種K326生長期根系為材料，對(duì)常規(guī)裂解液法、TCA/丙酮沉淀法、Trizol抽提法和酚法等4種總蛋白的提取方法進(jìn)行了比較[15]，并通過后續(xù)的2-DE對(duì)蛋白質(zhì)分離效果進(jìn)行了檢測(cè)。研究結(jié)果表明，Trizol抽提法和酚法能夠有效地抑制蛋白酶活性，防止蛋白降解和高分子量蛋白缺失，其中酚法雖然過程復(fù)雜，操作步驟繁瑣，但是該提取方法得到的2-DE圖譜中的分離蛋白數(shù)量較多，雜質(zhì)較少，凝膠圖像條帶清晰，分離效果較好，更適合后續(xù)分析。

煙草是葉用作物，煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)是廣大煙農(nóng)追求的終極目標(biāo)。煙葉蛋白質(zhì)提取和分離方法的確立為產(chǎn)量和品質(zhì)相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。王紹美等[16]以干旱敏感型煙草品種中煙100和易感黑脛病煙草品種小黃金1025為試材，參照Damerval等的方法[17-19]，研究了旺長后期和苗期煙草葉片蛋白質(zhì)樣品的制備方法，并參照Huang[20]和Laemmli[21]等的方法對(duì)第一向等電聚焦和第二向聚丙烯酰胺凝膠電泳條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，采用TCA-丙酮沉淀法提取旺長后期煙草葉片蛋白質(zhì)樣品，提取之前進(jìn)行兩次丙酮預(yù)冷，選用pH 4-7 的17cm IPG 預(yù)制膠條，上樣170 μL(總上樣量1 mg)，可以得到重復(fù)性較好，蛋白質(zhì)點(diǎn)清晰的雙向電泳圖譜；苗期煙草葉片總蛋白質(zhì)樣品通過蛋白質(zhì)分級(jí)提取、酚抽提及丙酮洗滌相結(jié)合的方法獲得，選用pH 4-7 的24cm線性IPG 膠條，水化12 h上樣，上樣450 μL(總蛋白量1.5 mg)，可得到背景干凈，蛋白質(zhì)點(diǎn)清晰的雙向電泳圖譜。

蛋白質(zhì)的提取和分離技術(shù)是進(jìn)行后續(xù)蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)研究的前提和基礎(chǔ)，提取和分離效果直接影響最終的研究結(jié)果。得到煙草各組織(器官)的蛋白質(zhì)提取方法，建立蛋白質(zhì)組研究適用的雙向電泳實(shí)驗(yàn)體系并獲得清晰的雙向電泳圖譜，可以為進(jìn)一步開展煙草根系、葉片等組織(器官)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供有力的技術(shù)支撐。

2 煙草脅迫蛋白質(zhì)組學(xué)研究

煙草在生長發(fā)育過程中會(huì)受到各種生物和非生物脅迫，如干旱、洪澇、鹽堿、高溫、低溫、病蟲草害、機(jī)械損傷等等，這些逆境條件會(huì)對(duì)煙草的正常生長發(fā)育產(chǎn)生不利影響，進(jìn)而導(dǎo)致煙葉產(chǎn)量降低，品質(zhì)下降。蛋白質(zhì)是基因功能的最終執(zhí)行者，是細(xì)胞增殖、分化、衰老和凋亡等所有生命活動(dòng)的直接體現(xiàn)者，它具有表達(dá)時(shí)間、表達(dá)量的差異，而且對(duì)外界的環(huán)境刺激可以能動(dòng)地產(chǎn)生反應(yīng)，逆境條件下煙草蛋白質(zhì)的種類和表達(dá)量發(fā)生顯著改變，形成各種內(nèi)在調(diào)控機(jī)制，以適應(yīng)或者抵御環(huán)境條件的改變。研究煙草脅迫條件下的蛋白質(zhì)組學(xué)，為我們更加深入地了解特定條件下煙株應(yīng)對(duì)環(huán)境變化所發(fā)生的生理、病理過程的內(nèi)在機(jī)理、信號(hào)應(yīng)答機(jī)制以及環(huán)境脅迫和抗逆性之間的關(guān)系提供了一個(gè)有力的手段，為全面地掌握抗逆相關(guān)蛋白和基因，系統(tǒng)地分析脅迫造成的煙株傷害機(jī)理，充分地了解煙株應(yīng)對(duì)脅迫的反應(yīng)機(jī)制具有重要意義。

鹽脅迫是植物最嚴(yán)重的非生物逆境脅迫之一[22]，進(jìn)行煙草響應(yīng)鹽脅迫的蛋白質(zhì)組研究，鑒定鹽脅迫反應(yīng)蛋白并了解其功能，對(duì)于通過遺傳學(xué)方法改良煙草耐鹽抗逆性具有重要作用。Roya Razavizadeh通過蛋白質(zhì)組學(xué)的方法研究了苗期煙草葉片在鹽脅迫條件下蛋白質(zhì)表達(dá)譜的情況[23]。150mM外源NaCl處理的煙草葉片中檢測(cè)到205個(gè)重復(fù)性較好的蛋白點(diǎn)，有18個(gè)蛋白點(diǎn)差異表達(dá)，這些蛋白質(zhì)的功能涉及光合作用、防御功能、新陳代謝、蛋白質(zhì)的折疊和運(yùn)輸?shù)确矫?，其中上調(diào)表達(dá)的蛋白質(zhì)有8個(gè)，主要是RuBisCO大亞基和RuBisCO小亞基等光合作用相關(guān)蛋白，而下調(diào)表達(dá)的10個(gè)蛋白質(zhì)主要是防御和能量代謝相關(guān)蛋白，包括熱休克蛋白、超氧化物歧化酶、三磷酸腺苷等，其中一個(gè)70KD基質(zhì)熱休克蛋白表達(dá)量顯著下調(diào)。

我國北方林區(qū)主要由混交林和天然林組成?；旖涣趾吞烊涣指滤俣戎苯佑绊懼謽I(yè)資源的利用效率。因此，加快混交林和天然林的更新速度，將顯著提高北方林業(yè)資源的利用效率，進(jìn)而促進(jìn)北方經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。加快混交林和天然林更新對(duì)促進(jìn)生態(tài)平衡有積極作用，現(xiàn)階段我國北方混交林和天然林更新速度正在加快。

低溫是限制煙株地理分布和煙葉產(chǎn)量提高的重要環(huán)境因素[24]。煙株受到低溫脅迫后誘導(dǎo)脅迫應(yīng)答基因表達(dá)，合成特殊的蛋白質(zhì)來響應(yīng)低溫，提高抗寒能力[25]。低溫脅迫對(duì)煙株生長發(fā)育和代謝途徑影響的分子機(jī)制目前尚不清楚。Jin等采用2-DE和毛細(xì)管液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(CapLC-MS/MS analysis)的方法研究了煙草幼苗受到4℃低溫傷害4h以后葉片的蛋白質(zhì)表達(dá)情況[26]。101個(gè)蛋白點(diǎn)的表達(dá)存在顯著差異，其中22個(gè)蛋白點(diǎn)只在處理葉片中表達(dá)，50個(gè)蛋白點(diǎn)只在對(duì)照葉片中表達(dá)，處理葉片中下調(diào)表達(dá)的蛋白點(diǎn)有21個(gè)，上調(diào)表達(dá)的蛋白點(diǎn)8個(gè)。質(zhì)譜鑒定出73個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，按功能分為兩大類，一類是調(diào)控類蛋白質(zhì)，主要與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、核酸的加工、翻譯、蛋白質(zhì)的加工等過程相關(guān)，另一類是脅迫類蛋白質(zhì)，主要與氧化還原反應(yīng)、光合作用、光呼吸、碳氮代謝和能量代謝相關(guān)。與調(diào)控過程相關(guān)的蛋白質(zhì)差異表達(dá)表明煙草響應(yīng)低溫以后存在一系列復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制。葉片受到低溫傷害以后，光合作用相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)量明顯降低，說明低溫傷害以后，煙草葉片的光合系統(tǒng)和葉綠體細(xì)胞器受到了嚴(yán)重?fù)p害，這是低溫對(duì)煙葉造成傷害的主要原因之一，也很好地解釋了為什么煙草對(duì)低溫傷害敏感。另外，植物受到低溫脅迫以后，活性氧作為低溫的信號(hào)分子大量產(chǎn)生，這些活性氧會(huì)導(dǎo)致正常細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷，植物體內(nèi)存在活性氧清除系統(tǒng)，將活性氧維持在正常水平。Jin的研究中得到了過氧化氫酶、硫氧還蛋白過氧化物酶等活性氧清除系統(tǒng)相關(guān)酶類的上調(diào)表達(dá)，解釋了低溫導(dǎo)致煙草發(fā)生氧化損傷的調(diào)控機(jī)制。

煙草生長發(fā)育過程中會(huì)發(fā)生多種病蟲草害，目前對(duì)煙草自身抗病機(jī)理的研究主要集中在抗病基因定位和分子標(biāo)記輔助育種[27-29]、基因組學(xué)[30-32]和抗性基因的轉(zhuǎn)化[33-35]等方面，針對(duì)蛋白質(zhì)水平上煙草抗病機(jī)理進(jìn)行的研究較少。煙草生長過程中可能發(fā)生的毀滅性病害-青枯菌的致病機(jī)理是當(dāng)前植物病理學(xué)研究的重要課題之一[36]。宋浩等通過非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，對(duì)煙草青枯病的致病性以及病菌侵染煙草后誘導(dǎo)機(jī)體的蛋白質(zhì)應(yīng)答進(jìn)行了系統(tǒng)性研究[37]。利用蛋白質(zhì)組學(xué)鳥槍法技術(shù)，在致病菌株和非致病菌株中分別鑒定出1346和1628個(gè)蛋白質(zhì)，對(duì)這些差異表達(dá)蛋白質(zhì)水平進(jìn)行評(píng)估，得到了它們?cè)诠δ軐W(xué)上的分類信息，為進(jìn)一步研究青枯病侵染煙草的生物學(xué)和病理學(xué)機(jī)制提供了一個(gè)新的研究思路。崔宏偉等研究了煙草受野火病菌侵染后蛋白質(zhì)表達(dá)變化的情況，在蛋白質(zhì)水平上分析了煙草抗野火病機(jī)制[38]。其研究共檢測(cè)到10個(gè)差異蛋白質(zhì)，其中6個(gè)下調(diào)表達(dá)，4個(gè)上調(diào)表達(dá)。下調(diào)表達(dá)的蛋白質(zhì)主要參與葉片光合作用，他認(rèn)為煙株受到病菌侵染后，物質(zhì)和能量代謝相關(guān)蛋白表達(dá)量下降，光合作用降低；糖代謝相關(guān)蛋白表達(dá)量增加，加速了碳循環(huán)，從而提高了煙株抗病能力；氨基酸代謝相關(guān)蛋白表達(dá)量也增加，產(chǎn)生更多的氨基酸來修復(fù)被病原菌破壞的蛋白質(zhì)，提高煙株抗病性。

紫外線輻射對(duì)煙草來講不僅僅是一種脅迫因子，還是香氣風(fēng)格形成的重要調(diào)控因子[39]，因此紫外線輻射強(qiáng)度的變化會(huì)對(duì)煙葉品質(zhì)產(chǎn)生一定的影響。陳宗瑜等利用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，以云南普栽烤煙品種K326為試材，深入研究了低緯高原種植條件下不同紫外線輻射對(duì)烤煙生理代謝和調(diào)控途徑的影響[40]。紫外線照射會(huì)產(chǎn)生活性氧，對(duì)細(xì)胞造成氧化脅迫，煙株防御機(jī)制最重要的一條途徑是抗氧化酶的大量表達(dá)來清除活性氧，抵御活性氧的毒害作用，維持體內(nèi)平衡，減少傷害。另外，煙株為了修復(fù)紫外線照射造成的葉片損傷，提高富含甘氨酸的RNA結(jié)合蛋白表達(dá)水平，加速信號(hào)傳導(dǎo)過程，降低傷害程度。

氮素對(duì)煙株生長發(fā)育和煙葉品質(zhì)形成發(fā)揮著舉足輕重的作用，氮素營養(yǎng)一直是烤煙栽培研究中的熱點(diǎn)問題。施肥時(shí)間、施氮水平和氮素形態(tài)等均會(huì)造成煙葉中蛋白質(zhì)表達(dá)和調(diào)控的差異，進(jìn)而影響煙堿合成等重要代謝過程。梁景霞以翠碧一號(hào)煙草為試材，采用比較蛋白質(zhì)組學(xué)的方法對(duì)低氮與高氮兩種供氮水平下的煙草根系蛋白、葉片蛋白進(jìn)行了系統(tǒng)分析[41]，在蛋白質(zhì)水平上較為準(zhǔn)確和直觀地了解了煙草根系、葉片在低氮脅迫下蛋白質(zhì)表達(dá)的種類及豐度變化。研究結(jié)果共鑒定出21個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)，涉及蛋白質(zhì)代謝和降解、碳代謝、抗性與環(huán)境互作、光合反應(yīng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等不同的功能組群，從而在蛋白表達(dá)水平上更深入地解析了煙草對(duì)低氮環(huán)境的多代謝途徑響應(yīng)機(jī)制。

目前關(guān)于植物響應(yīng)機(jī)械損傷蛋白質(zhì)組學(xué)的分析報(bào)道較少?？緹熒a(chǎn)上通過打頂，去除頂端生長優(yōu)勢(shì)，不僅影響根尖煙堿合成等重要代謝途徑，對(duì)煙葉也會(huì)產(chǎn)生多方面的調(diào)節(jié)和影響。楊惠娟等應(yīng)用2-DE對(duì)打頂前后葉片蛋白質(zhì)表達(dá)的差異變化進(jìn)行了研究[42]，經(jīng)過進(jìn)一步的質(zhì)譜鑒定和生物信息學(xué)分析，鑒定出了9個(gè)蛋白質(zhì)在打頂前后10天的葉片中差異表達(dá)。其中上調(diào)表達(dá)的蛋白有4個(gè)，主要是光合作用中的光反應(yīng)相關(guān)蛋白，即葉綠體放氧復(fù)合蛋白、Atfkbp13、PsbP 家族蛋白，另外一個(gè)與植物抗病性相關(guān)(β-1，3-葡聚糖酶前體蛋白)，下調(diào)表達(dá)的蛋白質(zhì)分別是SHM1、SHM2、乙醇酸氧化酶、葉綠體核糖體蛋白L1和60S 核糖體蛋白，主要涉及光呼吸和煙株的生長發(fā)育、細(xì)胞分裂等方面。這些蛋白質(zhì)表達(dá)的差異表明，煙株打頂可以在蛋白質(zhì)水平上增強(qiáng)煙草葉片的光合作用，提高葉片的抗性，同時(shí)降低葉片的能量代謝，調(diào)節(jié)煙葉生長。

3 煙葉品質(zhì)相關(guān)蛋白質(zhì)組學(xué)研究

煙葉品質(zhì)好壞不僅直接影響煙草產(chǎn)品的質(zhì)量和效益，而且對(duì)煙草經(jīng)濟(jì)的發(fā)展起著舉足輕重的作用。國內(nèi)外科研工作者通過分子生物學(xué)的方法對(duì)煙葉的香氣風(fēng)格以及煙堿等有害物質(zhì)的代謝調(diào)控進(jìn)行了大量研究。目前有關(guān)蛋白質(zhì)組學(xué)在這方面的研究并不多見。

蔡永占利用比較蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，對(duì)云南省的昆明市和麗江市兩個(gè)不同氣候環(huán)境的生態(tài)試驗(yàn)點(diǎn)團(tuán)棵期烤煙品種云煙87的葉片蛋白質(zhì)表達(dá)情況進(jìn)行了研究[46]，鑒定出33個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，防御/抗脅迫、蛋白質(zhì)合成，礦質(zhì)代謝相關(guān)的差異蛋白在昆明點(diǎn)的煙草葉片中表達(dá)較高，增強(qiáng)光合效率相關(guān)的蛋白質(zhì)在麗江點(diǎn)的煙草葉片中表達(dá)較高。該結(jié)果與昆明點(diǎn)平均降水量顯著低于麗江點(diǎn)的氣候特點(diǎn)一致，說明昆明點(diǎn)的煙草為了適應(yīng)干旱的環(huán)境條件，合成較多的防御/抗脅迫相關(guān)蛋白來調(diào)適各種代謝途徑，加強(qiáng)礦質(zhì)代謝，維持煙株的正常生長發(fā)育。該研究結(jié)果在蛋白質(zhì)表達(dá)水平揭示了團(tuán)棵期煙草對(duì)不同氣候環(huán)境響應(yīng)的分子機(jī)理。

煙堿是煙草根系合成的重要次生代謝物質(zhì)，其含量高低是評(píng)價(jià)煙葉品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，如何在不影響煙葉產(chǎn)量、品質(zhì)和煙農(nóng)利益的前提下降低中上部煙葉煙堿含量是煙草行業(yè)迫切需要解決的問題。煙堿的合成和積累過程存在一個(gè)異常復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控體系，有關(guān)煙堿合成和調(diào)控的研究一直是次生代謝研究領(lǐng)域的焦點(diǎn)之一。煙草科研工作者對(duì)煙堿生物合成的分子調(diào)控進(jìn)行了大量研究[47-48]，但是關(guān)于其蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)機(jī)制的研究鮮有報(bào)道。為了深入了解打頂對(duì)煙堿合成的影響，Liu等通過2-DE對(duì)打頂前后烤煙根尖差異表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行了分析鑒定[50]，得到4個(gè)與煙堿代謝相關(guān)的差異蛋白質(zhì)，其中氨甲酰磷酸轉(zhuǎn)移酶、精胺/亞精胺合成酶和內(nèi)含子成熟酶(mature enzyme K)表達(dá)量上調(diào)， 6-磷酸山梨醇脫氫酶（S6PDH）表達(dá)量下調(diào)。煙堿的生物合成和氮素代謝密切相關(guān)，而氨甲酰磷酸轉(zhuǎn)移酶催化氨甲酰磷酸的形成，該過程不但為核苷酸的合成提供氨基，同時(shí)為氨基酸的生物合成提供氨基，在氮素代謝過程中起著非常重要的作用。精胺/亞精胺對(duì)煙堿代謝具有正調(diào)控作用，其含量增加有利于煙堿的生物合成。內(nèi)含子成熟酶與翻譯水平上的基因表達(dá)直接相關(guān)，打頂以后，內(nèi)含子成熟酶通過影響碳氮代謝相關(guān)酶基因表達(dá)水平的變化，進(jìn)而促進(jìn)煙堿的生物合成?？傮w來講，打頂導(dǎo)致煙株原始庫源關(guān)系發(fā)生改變[51]，上述差異蛋白質(zhì)表達(dá)水平的變化，均促進(jìn)氮代謝向煙堿合成的方向進(jìn)行。

王茂等為了探索打頂對(duì)煙堿合成的影響以及茉莉酸信號(hào)途徑在煙堿合成過程中的作用，通過茉莉酸處理模擬煙草打頂，采用差異蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)烤煙根尖組織細(xì)胞蛋白質(zhì)組進(jìn)行了分析[52]。結(jié)果表明，打頂和茉莉酸處理后，S6PDH表達(dá)量下調(diào)，可能導(dǎo)致其調(diào)控產(chǎn)物蔗糖-6-磷酸（S6P）含量降低，S6P對(duì)蔗糖磷酸合成酶（SPS）的抑制作用降低，從而導(dǎo)致煙株根系蔗糖產(chǎn)生量增加，這不僅為煙堿合成提供碳骨架和能量，還有可能促進(jìn)煙堿合成相關(guān)基因的表達(dá)。3-磷酸甘油醛脫氫酶（G3PDH）表達(dá)量下調(diào)，表明會(huì)有大量3-磷酸甘油醛積累，用于煙堿的生物合成。同打頂處理的結(jié)果一致，茉莉酸處理后氨甲酰磷酸轉(zhuǎn)移酶和精胺/亞精胺合成酶表達(dá)量上調(diào)，它們?cè)诘x過程中發(fā)揮重要作用。

普通煙草葉片表面著生大量毛狀體，這些毛狀體對(duì)煙葉品質(zhì)有重要影響[53]，它們分泌大量次生代謝物質(zhì)，與煙葉化學(xué)成分、香吃味和抗蟲性關(guān)系密切[54-58]。目前人們對(duì)煙葉表面毛狀體的代謝途徑了解較少，van Cutsem等為了研究它們?cè)谔岣邿熑~品質(zhì)及增強(qiáng)抗性方面的作用，通過冰凍研磨獲得了絨毛狀煙草葉表毛狀體，然后利用2-DE結(jié)合MALDI-TOFMS-MS二級(jí)質(zhì)譜（基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜）和高效液相色譜串聯(lián)二級(jí)質(zhì)譜兩種方法分別獲得了1373和858個(gè)蛋白點(diǎn)[59]。經(jīng)過進(jìn)一步研究，鑒定出這些蛋白質(zhì)的功能主要涉及次生代謝、（非）生物脅迫反應(yīng)和初生代謝三個(gè)方面。次生代謝相關(guān)蛋白質(zhì)主要是與萜類代謝有關(guān)的酶類，這也是van Cutsem鑒定出的最主要的一類蛋白質(zhì)。異戊烯基二磷酸和烯丙基二磷酸通過甲羥戊酸(MVA)途徑形成倍半萜和三萜，通過類萜合成代謝（MEP）途徑形成單萜和二萜。MEP途徑所需要的七個(gè)酶在van Cutsem的研究中全部被鑒定出，催化該反應(yīng)最后一步的1-羥基-2-甲基-2-丁烯基-4-磷酸還原酶是表達(dá)量最高的蛋白質(zhì)之一，從而很好地解釋了煙草毛狀體含有豐富的類異戊二烯前體物質(zhì)；鑒定出的萜類代謝相關(guān)蛋白質(zhì)還包括異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶、牛兒基二磷酸合酶和環(huán)化酶等。鑒定得到的非生物脅迫反應(yīng)相關(guān)蛋白質(zhì)主要包括植物解毒相關(guān)酶類，如谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶，它將細(xì)胞內(nèi)毒性分子與谷胱甘肽結(jié)合，然后將結(jié)合產(chǎn)物送入液泡，在異生物質(zhì)的脫毒過程發(fā)揮作用，同時(shí)它還在植物對(duì)病原入侵的超敏反應(yīng)過程中發(fā)揮作用，病原入侵后植物體爆發(fā)大量H2O2等活性氧來抵御病原菌的侵害，H2O2會(huì)誘導(dǎo)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)，以此來保護(hù)細(xì)胞內(nèi)DNA和脂肪免受氧化脅迫的損傷；非生物脅迫反應(yīng)相關(guān)蛋白質(zhì)還包括超氧化物歧化酶、過氧化物還原酶、硫氧還蛋白過氧化物酶和谷胱甘肽過氧化物酶等，它們?cè)诳箟难?谷胱甘肽循環(huán)等活性氧清除過程中發(fā)揮作用，保護(hù)細(xì)胞免受活性氧的傷害；生物脅迫反應(yīng)相關(guān)蛋白質(zhì)主要包括幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶等，說明毛狀體作為煙葉的“第一線”，的確在防御系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用；van Cutsem的研究還鑒定得到了最近在煙草上剛剛發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新的蛋白質(zhì)phylloplanins，它可以抑制孢子萌發(fā)，在感病早期防止病原菌入侵。該研究鑒定出的初生代謝相關(guān)蛋白質(zhì)中，磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶和果糖-1,6-二磷酸酶這兩種酶主要存在于糖異生途徑中，可能為蔗糖酯的合成提供碳水化合物；類酯代謝相關(guān)蛋白質(zhì)與蠟質(zhì)的形成有關(guān)；氨基酸代謝相關(guān)酶類主要參與S-腺苷蛋氨酸循環(huán)和支鏈氨基酸的代謝過程。

4 小結(jié)

隨著越來越多的生物全基因組測(cè)序工作的完成，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)得到了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，為進(jìn)一步揭示生物體生長發(fā)育及響應(yīng)外界環(huán)境因子的關(guān)鍵代謝途徑的分子機(jī)制提供了蛋白質(zhì)組水平的證據(jù)，更加貼近了人們對(duì)生命現(xiàn)象和生命活動(dòng)本質(zhì)的認(rèn)識(shí)。煙草科研工作者利用該技術(shù)，在煙株不同組織(器官)發(fā)生的特殊生理生化變化的內(nèi)在機(jī)制以及抵御脅迫反應(yīng)的分子基礎(chǔ)等方面取得了豐碩的研究成果，具備廣闊的發(fā)展前景。但仍存在不足之處，主要表現(xiàn)在：

首先，蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，蛋白質(zhì)的分離主要通過2-DE來實(shí)現(xiàn)，但是2-DE存在某些技術(shù)性的挑戰(zhàn)，比如蛋白樣品制備效率偏低，特別是疏水性膜蛋白提取比較困難，一些低豐度蛋白在制備過程中可能會(huì)丟失，多種可能具有重要功能的痕量調(diào)控蛋白很難分離；強(qiáng)堿性等蛋白質(zhì)的分離存在一定困難，選用窄范圍的膠條水合上樣容易產(chǎn)生背景橫紋，影響進(jìn)一步檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。尤其對(duì)于煙草來講，由于其特殊的生物學(xué)特性，導(dǎo)致煙草根系中蛋白質(zhì)含量相對(duì)較低，同時(shí)富含多糖、多酚以及多種酶類、酯類、醛類和其它次生代謝物質(zhì)，因而根系蛋白質(zhì)的提取相對(duì)比較困難。

第二，煙草蛋白質(zhì)組學(xué)主要側(cè)重的是對(duì)組織(器官)生長發(fā)育過程和響應(yīng)脅迫的蛋白質(zhì)表達(dá)特征的研究，對(duì)蛋白質(zhì)功能、蛋白質(zhì)翻譯后修飾和蛋白質(zhì)互作等方面的研究較少；由于低豐度和膜蛋白的分離鑒定比較困難，對(duì)亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)的研究較少，葉綠體等作為煙草葉片最重要的細(xì)胞器，其在代謝活動(dòng)等生命過程中的意義尚未充分揭示。

第三，目前煙草蛋白質(zhì)組學(xué)的檢測(cè)技術(shù)一般都是質(zhì)譜等非定量檢測(cè)，對(duì)于定量研究煙草組織(器官)蛋白質(zhì)表達(dá)的正調(diào)控或負(fù)調(diào)控報(bào)道較少。

針對(duì)上述問題，筆者認(rèn)為下一步煙草蛋白質(zhì)組學(xué)研究工作應(yīng)該重點(diǎn)在以下幾個(gè)方面進(jìn)行：

煙株內(nèi)蛋白質(zhì)間密切互作，通過復(fù)雜的信息傳遞形成網(wǎng)絡(luò)體系，影響煙株生長發(fā)育和代謝過程。將煙草蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)與轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)、生理組學(xué)和代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有機(jī)結(jié)合，使煙株的生理表現(xiàn)與基因、轉(zhuǎn)錄、蛋白、代謝等層面上的分析相結(jié)合，將更有利于發(fā)揮蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在生命現(xiàn)象研究中的樞紐作用，進(jìn)一步明確基因調(diào)控與蛋白質(zhì)表達(dá)的關(guān)系，明確煙堿等次生代謝物質(zhì)的合成途徑、煙株抗逆的深層機(jī)理，為相關(guān)理論研究和育種工作作出更大貢獻(xiàn)。

加強(qiáng)對(duì)蛋白質(zhì)功能方面的研究，運(yùn)用功能基因組學(xué)、生化反應(yīng)等手段進(jìn)一步證實(shí)新蛋白質(zhì)在煙株生長發(fā)育過程中以及特殊環(huán)境條件下的功能。比如在基因組學(xué)充分發(fā)展的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探索未知功能的蛋白結(jié)構(gòu)，深入研究結(jié)構(gòu)與功能的相關(guān)性，探索蛋白的未知功能，揭示目標(biāo)蛋白在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的地位及作用機(jī)理；把DNA微陣列與蛋白質(zhì)組學(xué)分析相結(jié)合，進(jìn)一步確定基因調(diào)控是在轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行還是在翻譯水平或者蛋白質(zhì)積累水平進(jìn)行，更深入地研究基因功能；加強(qiáng)對(duì)煙草亞細(xì)胞(細(xì)胞器)蛋白質(zhì)組進(jìn)行研究，建立相應(yīng)的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫，有利于進(jìn)一步研究蛋白質(zhì)的差異表達(dá)、功能、定位和翻譯后的修飾，有助于迅速確定優(yōu)良表現(xiàn)型的性狀基因，推進(jìn)品種改良，加快煙草育種步伐。

在充分利用現(xiàn)有方法和技術(shù)的基礎(chǔ)上，煙草蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，將會(huì)在進(jìn)一步揭示基因組功能和結(jié)構(gòu)，闡明煙草生長發(fā)育、代謝調(diào)控和進(jìn)化規(guī)律等各生命活動(dòng)機(jī)理方面取得重大突破。

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Research and application of proteomics in tobacco

ZHAO Fengxia1,GAO Xiangbin1,WANG Zhengping1,LI Haifeng2,SONG Xueli1,JI Min3
1 Tobacco Institute,Henan Academy of Agricultural Sciences,Xuchang 461000,China;
2 College of Bioengineering,Henan University of Technology,Zhengzhou 450000,China;
3 Patent Examination Cooperation Center of the Pat ent Office,Beijing 100190,China

Proteomics and its application were considered as an important part of research frontier in functional genomics in post-geomic era.The following aspects were investigated such as protein separation and extraction method from tobacco roots and leaves,application of proteomics in stress research under low-temperature,salty and mechanically-damaged environment,regulation mechanism of physiological and pathological reactions when tobacco reponded to fertilization,ultraviolet radiation,decapitation and invasion of diseases，and application of proteomics in improving leaf quality.Issues of critical signi ficance to current tobacco proteomics research were discussed and key research areas and prospects were suggested.

tobacco; proteomics; stress response; regulation mechanism

10.3969/j.issn.1004-5708.2014.01.019

TS413

A

1004-5708（2014）01-0103-08

河南省博士科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目（無編號(hào)）；河南省煙草公司“河南省煙草產(chǎn)品質(zhì)量安全標(biāo)準(zhǔn)制訂” (HYKJ 201112)

趙鳳霞（1982—），女，博士，助理研究員，主要研究方向?yàn)闊煵萆砩?。Tel：0374- 4518006，Email：fxzhao1982@gmail.com

高相彬（1982—），男，博士，助理研究員，主要研究方向?yàn)闊煵莺婵菊{(diào)制。Tel：0374- 4518006，Email：xbgao1982@163.com

2013-06-04