副雞禽桿菌3個(gè)血清型參考菌株生長曲線的測定和比較

姚東璧，李復(fù)煌，謝三磊，李桂萍，徐福州，房慧伶，孫惠玲＊

（1．北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，北京畜禽疫病防控技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100097；2．廣西大學(xué)

動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧530004；3．北京市畜牧獸醫(yī)總站，北京100107；4．甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州730070）

副雞禽桿菌3個(gè)血清型參考菌株生長曲線的測定和比較

姚東璧1，2，李復(fù)煌3，謝三磊4，李桂萍1，徐福州1，房慧伶2，孫惠玲1＊

（1．北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，北京畜禽疫病防控技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100097；2．廣西大學(xué)

動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧530004；3．北京市畜牧獸醫(yī)總站，北京100107；4．甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州730070）

為探索副雞禽桿菌生長特性，比較不同血清型菌株生長特性的差異，采用分光光度法和菌落計(jì)數(shù)法分別測定副雞禽桿菌血清A型（221株）、血清B型（0222株）、血清C型（Modesto株）3個(gè)參考菌株的生長曲線，對兩種方法測定的生長曲線進(jìn)行比較。結(jié)果表明，兩種方法繪制的生長曲線差異較大，對數(shù)生長期和穩(wěn)定期菌液OD 600 nm值與活菌數(shù)對數(shù)之間呈現(xiàn)一元二次多項(xiàng)式回歸關(guān)系。另外，3個(gè)血清型菌株的生長穩(wěn)定期都比較短暫，各型菌株達(dá)到生長高峰的時(shí)間和活菌數(shù)都有差異。該試驗(yàn)為副雞禽桿菌生物學(xué)特性的比較研究及疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。

副雞禽桿菌；生長曲線；生長特性

副雞禽桿菌（Avibacteriumparagallinarum）原稱副雞嗜血桿菌（Haemophilusparagallinarum），是一種無芽胞的革蘭陰性桿菌，兼性厭氧，于固體培養(yǎng)基接種培養(yǎng)時(shí)需要5%～10%的CO2環(huán)境，最適生長溫度為37℃，單個(gè)菌落在45°光照下呈藍(lán)色透明狀，但隨著體外傳代次數(shù)的增加，菌落色澤將減弱或消失。該菌在體外培養(yǎng)的生長要求苛刻，需要NAD（輔酶Ⅰ）的參與，但不是所有菌型都需要，南非和墨西哥對NAD非依賴性菌株已有報(bào)道［1－2］。

該菌是雞傳染性鼻炎的病原菌，主要引起雞的上呼吸道疾病，表現(xiàn)為雞的生長停滯和蛋雞產(chǎn)蛋率下降，且呈世界性分布，可導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。最常用的Page分型法將副雞禽桿菌分為A、B、C 3個(gè)血清型，Kume法將Av．paragallinarum分為3個(gè)血清群Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ群，其Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ群分別相當(dāng)于Page A型、C型和B型。我國分離株多為A型和B型，C型只有一例報(bào)道［3］。該病發(fā)生后的治愈率高，但易復(fù)發(fā)，目前主要采取多價(jià)滅活疫苗來控制其發(fā)生和傳播。

細(xì)菌生長曲線的繪制方法主要有分光光度法和菌落計(jì)數(shù)法兩種。分光光度法是通過測定菌液的OD 600 nm值，得出的是菌液中包含的總菌數(shù)，該方法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡便。菌落計(jì)數(shù)法得出的是菌液中的活菌數(shù)，相對來說要準(zhǔn)確得多，但是操作復(fù)雜而且耗時(shí)、耗力。對于一些細(xì)菌兩種方法繪制的生長曲線有很好的相關(guān)性［4－6］。本研究的目的是在同樣的條件下培養(yǎng)3個(gè)不同血清型副雞禽桿菌參考菌株，采用分光光度法和活菌計(jì)數(shù)法測定菌株的生長曲線，了解其生長特性并比較菌株之間的差異，另外，通過試驗(yàn)評價(jià)是否可以用分光光度法的OD 600 nm值來衡量菌液中的活菌數(shù)量，為副雞禽桿菌的生物特性比較研究和疫苗生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 菌株 副雞禽桿菌A、B、C 3個(gè)血清型參考菌株，A型（221株）、B（0222株）和 C（Modesto株）由澳大利亞昆士蘭州動物研究所Blackall博士惠贈。

1．1．2 培養(yǎng)基 TSA 固體培養(yǎng)基（含0．025 g／L NAD和100 m L／L雞血清）；TSB液體培養(yǎng)基（含0．025 g／L NAD和100 m L／L雞血清）。

1．2 方法

1．2．1 合成引物和PCR擴(kuò)增 根據(jù)文獻(xiàn)［7］合成擴(kuò)增副雞禽桿菌500 bp基因片段的引物序列，對培養(yǎng)的細(xì)菌進(jìn)行PCR檢測，判斷培養(yǎng)物是否為副雞禽桿菌。上游引物為：5′－TGA GGG TAG TCT TGC ACG CGA AT －3′，下 游 引 物 為：5′－CAA GGT ATC GAT CGT CTC TCT ACT －3′。反應(yīng)體 系為：2×buffer 12．5μL，Taq（5 U／μL）0．5μL，d NTP（2．5 mmol／L）2μL，N1（10μmol／L）1μL，R1（10μmol／L）1μL，樣品4μL，滅菌去離子水4μL，總體積為25μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃5 min；94℃45 s，56℃45 s，72℃1 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72℃10 min，4℃結(jié)束反應(yīng)。

1．2．2 細(xì)菌培養(yǎng) 將800 m L／L甘油保存的菌種復(fù)蘇，無菌接種于TSA培養(yǎng)基，于37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h～30 h。經(jīng)PCR驗(yàn)證后挑取單個(gè)菌落轉(zhuǎn)接至5 m L TSB液體培養(yǎng)基，于37℃搖振培養(yǎng)12 h，再按1∶60體積比例轉(zhuǎn)接至100 m L TSB中擴(kuò)大培養(yǎng)，于180 r／min 37℃搖振培養(yǎng)24 h。

1．2．3 菌液OD 600 nm值測定和活菌計(jì)數(shù) 每隔1 h～2 h在無菌條件下收獲少量菌液，用于測量OD 600 nm值，并用滅菌生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋后各取3個(gè)稀釋度的菌液50μL涂布TSA平板，于37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至48 h，然后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，根據(jù)稀釋倍數(shù)和平板上的菌落數(shù)來計(jì)算活菌數(shù)（cfu／m L）。

1．2．4 菌液純檢 收獲菌液的同時(shí)取少量菌液進(jìn)行普通營養(yǎng)瓊脂平板劃線培養(yǎng)，于37℃培養(yǎng)48 h，觀察有無雜菌長出，以判定菌液在培養(yǎng)期間是否被污染。

2 結(jié)果

2．1 菌液的特異性與純度檢驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)純檢，48 h后普通營養(yǎng)瓊脂平板表面無細(xì)菌長出，表明細(xì)菌培養(yǎng)過程中無污染；菌落PCR檢測在500 bp處出現(xiàn)了清晰的電泳條帶（圖1），表明本試驗(yàn)培養(yǎng)的3個(gè)菌株皆為副雞禽桿菌。

圖1 副雞禽桿菌A、B、C 3個(gè)血清型參考菌株的PCR檢測結(jié)果Fig．1 PCR detection results of three reference strains of Avibacteriumparagallinarum serotype A，B and C

2．2 分光光度法和菌落計(jì)數(shù)法繪制副雞禽桿菌A、B、C 3個(gè)血清型參考菌株的生長曲線

采用菌液OD 600 nm值和活菌計(jì)數(shù)值（cfu／m L）的對數(shù)為縱坐標(biāo)分別繪制3個(gè)血清型參考菌株的生長曲線（圖2，圖3）。圖2是以菌液OD 600 nm值為縱坐標(biāo)繪制的生長曲線，3個(gè)血清型參考菌株生長規(guī)律基本一致，即在監(jiān)測之初5 h即進(jìn)入了對數(shù)生長期，13 h達(dá)到穩(wěn)定期，持續(xù)到14 h后OD 600 nm值開始急劇下降進(jìn)入衰退期，15 h以后OD 600 nm值開始下降得比較緩慢。如圖2所示，3個(gè)血清型菌株的生長穩(wěn)定期都很短。

圖3是以活菌計(jì)數(shù)值（cfu／m L）的對數(shù)為縱坐標(biāo)繪制的生長曲線，3個(gè)血清型參考菌株在監(jiān)測之初5 h即進(jìn)入了對數(shù)生長期，C型菌株達(dá)到生長高峰的時(shí)間最短，為10 h，但是C型達(dá)到生長高峰時(shí)的活菌數(shù)卻最少，為15億；其次是A型，培養(yǎng)11 h達(dá)到活菌數(shù)高峰，為31．6億；B型培養(yǎng)至12 h達(dá)到活菌數(shù)高峰，為43億。3個(gè)血清型菌株達(dá)到生長高峰后的1 h內(nèi)，A型和C型活菌數(shù)衰減大約2／3，B型活菌數(shù)衰減了14倍。因?yàn)樵诰晟L高峰時(shí)段采用了1 h的監(jiān)測頻率，因此，3個(gè)血清型菌株的生長穩(wěn)定期都短于1 h。

圖2 副雞禽桿菌A、B、C 3個(gè)血清型參考菌株的生長曲線（分光光度法）Fig．2 Growth curves of of three reference strains of Avibacterium paragallinarum serotype A，B and C （spectrophotometry method）

圖3 副雞禽桿菌A、B、C 3個(gè)血清型參考菌株的生長曲線（活菌計(jì)數(shù)法）Fig．3 Growth curves of of three reference strains of Avibacterium paragallinarum serotype A，B and C （colony count method）

2．3 3個(gè)血清型參考菌株在對數(shù)生長期和穩(wěn)定期OD 600 nm值和活菌數(shù)之間的函數(shù)關(guān)系

由圖2和圖3可看出，分光光度法和菌落計(jì)數(shù)法的生長曲線差異較大，當(dāng)菌液OD 600 nm值達(dá)到最高值時(shí)活菌數(shù)已不是最多，二者之間不呈線性相關(guān)。取3個(gè)血清型菌株對數(shù)生長期至穩(wěn)定期的數(shù)據(jù)，以O(shè)D 600 nm值為橫坐標(biāo)，菌液中活菌數(shù)對數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制兩者的回歸曲線，結(jié)果為一元二次多項(xiàng)式回歸，見圖4、圖5和圖6。3個(gè)血清型參考菌株的回歸方程分別為y＝－25．60x2＋34．75x－1．789，相關(guān)指數(shù) R2＝0．913（A 型）；y＝－42．90x2＋50．04x－4．513，相關(guān)指數(shù)R2＝0．995（B型）；y＝－23．03x2＋30．31x－0．715，相關(guān)指數(shù) R2＝0．936（C型）。3個(gè)血清型回歸方程的擬合度都比較高，其中，以B型回歸方程估測的可靠程度最高，其次是C型和A型。

圖4 A型參考菌株OD 600 nm值與活菌數(shù)對數(shù)之間的函數(shù)關(guān)系圖Fig．4 Relationship between OD 600 nm value and log10 cfu／m L of reference strain of Avibacteriumparagallinarum serotype A

圖5 B型參考菌株OD 600 nm值與活菌數(shù)對數(shù)之間的函數(shù)關(guān)系圖Fig．5 Relationship between OD 600 nm value and log10 cfu／m L of reference strain of Avibacteriumparagallinarum serotype B

圖6 C型參考菌株OD 600 nm值與活菌數(shù)對數(shù)之間的函數(shù)關(guān)系圖Fig．6 Relationship between OD 600 nm value and log10 cfu／m L of reference strain of Avibacteriumparagallinarum serotype C

3 討論

細(xì)菌的生長曲線反映了細(xì)菌在培養(yǎng)過程中生長、繁殖和衰亡的規(guī)律，在適宜條件下培養(yǎng)，會出現(xiàn)延滯期、對數(shù)生長期、穩(wěn)定期和衰退期4個(gè)階段。在研究細(xì)菌的各種特性時(shí)，生長曲線有助于選擇到生長狀態(tài)比較一致的細(xì)菌，一般選擇剛開始進(jìn)入平臺期的細(xì)菌。因此，在進(jìn)行細(xì)菌生物特性比較研究之前，找到細(xì)菌的穩(wěn)定期，對于試驗(yàn)結(jié)果的可靠性有著重要的意義。

本試驗(yàn)比較了3個(gè)不同血清型副雞禽桿菌參考菌株在體外培養(yǎng)條件下的生長曲線，采用分光光度法和活菌計(jì)數(shù)法兩種方法，兩種方法獲得的生長曲線差異較大，不能用菌液OD 600 nm值來直接衡量活菌數(shù)的多少。在對數(shù)生長期和穩(wěn)定期，菌液OD 600 nm值和活菌數(shù)之間不呈現(xiàn)線性關(guān)系，而是呈現(xiàn)比較復(fù)雜的一元二次多項(xiàng)式回歸關(guān)系，這一特性與其他菌的相關(guān)報(bào)道不一致［4－6］。這與菌種本身的特性有關(guān)，因?yàn)楦彪u禽桿菌是一種非常敏感的細(xì)菌，對外界溫度及理化因素的抵抗力均較弱，在固體培養(yǎng)基上的菌落，4℃下存放超過5 d～7 d，就不再有存活的細(xì)菌。在適宜液體培養(yǎng)基中，常溫下衰亡的速度也很快，反復(fù)凍融會大大降低菌液中的活菌數(shù)。

另外，副雞禽桿菌在體外培養(yǎng)的生長要求苛刻，大多數(shù)菌株需要還原型輔酶A，即使如此，本菌的生長和繁殖能力也無法和其他禽類的致病菌相比，3個(gè)血清型菌株達(dá)到生長高峰時(shí)的活菌數(shù)只能與靜置培養(yǎng)的大腸埃希菌［8］、鴨疫里默菌活菌數(shù)相當(dāng)，只有搖振培養(yǎng)的鴨疫里默菌活菌數(shù)的1／10［9］。而且，該菌的生長穩(wěn)定期非常短暫，因此，在培養(yǎng)副雞禽桿菌進(jìn)行滅活疫苗生產(chǎn)時(shí)，一定要把握好收獲菌液的時(shí)間。

本試驗(yàn)結(jié)果不但為進(jìn)一步菌株生物學(xué)特性比較奠定了基礎(chǔ)，而且為今后的副雞禽桿菌毒力比較試驗(yàn)及疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。

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Determination and Comparative Analysis of Growth Curves of Three Reference Strains ofAvibacteriumparagallinarumSerotype A，B and C

YAO Dong－bi1，2，LI Fu－h(huán)uang3，XIE San－lei4，LI Gui－ping1，XU Fu－zhou1，F(xiàn)ANG Hui－ling2，SUN Hui－ling1
（1．BeijingKeyLaboratoryforPreventionandControlofInfectiousDiseasesinLivestockandPoultry，InstituteofAnimal HusbandryandVeterinaryMedicineofBeijingAcademyofAgricultureandForestrySciences，Beijing，100097，China；
2．CollegeofAnimalScienceandTechnology，GuangxiUniversity，Nanning，Guangxi，530004，China；
3．BeijingGeneralStationofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine，Beijing，100107，China；
4．FacultyofVeterinaryMedicine，GansuAgriculturalUniversity，Lanzhou，Gansu，730070，China）

To explore and compare the growth changes and growth characteristics of different serotype ofAvibacteriumparagallinarum，growth curves of three reference strains of serotype A （221 strain），B（0222 strain）and C （Modesto strain）were determined by spectrophotometry and colony count methods under the same culture conditions．Then two methods were compared．Results showed that the growth curves made by two methods were different．OD 600 nm and the logarithm of colony count in logarithmic phases and stationary phase showed a quadratic polynomial regression．In addition，stationary phases of three serotypes were short and differences were observed on reaching the growth peak and viable colony counts in three serotypes．This experiment laid a foundation for the further comparative study on the biological characteristics and vaccine development ofAvibacteriumparagallinarum．

Avibacteriumparagallinarum；growth curve；growth characteristic

S852．613

A

1007－5038（2014）07－0043－04

2013－12－26

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30871867）；北京市新世紀(jì)百千萬人才工程項(xiàng)目

姚東璧（1988－），女，廣西人，碩士研究生，主要從事細(xì)菌分子生物學(xué)與免疫學(xué)研究。＊通訊作者