聶國(guó)明 鄒敏書 余 健 羅莉漫 徐洪濤 毛嬌嬌

在腎小球選擇性濾過過程中，腎小球?yàn)V過屏障阻止蛋白尿的濾出。濾過屏障由3層組成:內(nèi)皮細(xì)胞、基膜(GBM)和足細(xì)胞，后者是阻止蛋白漏出最主要的細(xì)胞，足細(xì)胞合成nephrin，其位于足突裂孔隔膜區(qū)，是防止白蛋白濾出的關(guān)健及中心結(jié)構(gòu)。Nephrin是腎小球裂孔隔膜上發(fā)現(xiàn)的第1個(gè)跨膜蛋白，是NPHS1的基因產(chǎn)物，此基因突變出現(xiàn)芬蘭型腎病綜合征，在維持足細(xì)胞正常功能過程中起至關(guān)重要的作用。Nephrin不僅是黏附分子，而且是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，參與足細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［1］。Nephrin磷酸化被認(rèn)為是維持正常足細(xì)胞形態(tài)和功能的起始事件，主要是指酪氨酸磷酸化，其胞內(nèi)段含有9個(gè)酪氨酸殘基，是潛在的磷酸化位點(diǎn)［2］。研究發(fā)現(xiàn)，nephrin的胞內(nèi)段磷酸化與Src家庭激酶Fyn和適配蛋白Nck相關(guān)，F(xiàn)yn是Src激酶，在Y1204位點(diǎn)磷酸化nephrin。Nck含有3個(gè)SH3區(qū)和1個(gè)SH2區(qū)，可結(jié)合到nephrin磷酸化位點(diǎn)Y1204，募集信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，誘導(dǎo)肌動(dòng)蛋白聚合［3］。在Fyn和Nck敲除鼠，足細(xì)胞出現(xiàn)足突融合及蛋白尿，證實(shí)體內(nèi)足細(xì)胞信號(hào)瀑布的重要性［4］。

糖皮質(zhì)激素是治療腎小球蛋白尿的主要藥物。然而其對(duì)足細(xì)胞的精確作用機(jī)制尚不十分明確。阿霉素動(dòng)物模型表現(xiàn)為足細(xì)胞足突融合、肌動(dòng)蛋白重排、大量蛋白尿，而Dex可直接保護(hù)阿霉素誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷，穩(wěn)定α-輔肌動(dòng)蛋白4的表達(dá)［5］。既往研究顯示，Dex可維持腎小球nephrin的表達(dá)，減輕尿白蛋白的排泄，抑制腎小球上皮間制動(dòng)轉(zhuǎn)化［6］。本實(shí)驗(yàn)觀察Dex對(duì)nephrin磷酸化的影響，探討Fyn和Nck在nephrin磷酸化中的作用及Dex可能作用機(jī)制。

材料與方法

1．足細(xì)胞的培養(yǎng):小鼠永生化足細(xì)胞株(MPC5)由美國(guó)Peter Mundel教授惠贈(zèng)，細(xì)胞于含20U/ml γ-干擾素的1640培養(yǎng)液中，33℃、5%CO2培養(yǎng)。細(xì)胞傳代后轉(zhuǎn)入不含γ-干擾素培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)使足細(xì)胞分化10～14天后使用。

2．地塞米松處理:實(shí)驗(yàn)分組方法如下:體外培養(yǎng)的足細(xì)胞給予不同濃度 Dex 處理(0、1、10、100nmol/L)24h，100nmol/L Dex處理足細(xì)胞不同時(shí)間(0、12、24、36h)，Dex(100nmol/L)與足細(xì)胞一起培養(yǎng)，分別加入糖皮質(zhì)激素受體拮抗劑RU-486及鹽皮質(zhì)激素受體拮抗劑RU-26572。對(duì)照組加緩沖液培養(yǎng)。磷酸化nephrin用兔抗pY1228 nephrin抗體測(cè)定。兔抗pY1228 nephrin抗體、RU-486及RU-26572購自Sigma公司。

3．足細(xì)胞轉(zhuǎn)染:將足細(xì)胞接種于25cm2的培養(yǎng)瓶中，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到50%～60% 時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。足細(xì)胞分成以下3組:(1)未轉(zhuǎn)染組:未經(jīng)任何處理的足細(xì)胞;(2)轉(zhuǎn)染NcksiRNA組:100nmol/L Dex與足細(xì)胞孵育24h，加Nck-siRNA表達(dá)質(zhì)粒pGenesil/siRNA-Nck培養(yǎng)24h;(3)轉(zhuǎn)染Fyn-siRNA組:100nmol/L Dex與足細(xì)胞孵育24h，加Fyn-siRNA表達(dá)質(zhì)粒 pGenesil/siRNA-Fyn培養(yǎng)24h。利用JetPRIMETM進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染方法參照J(rèn)etPRIMETM轉(zhuǎn)染試劑的說明書。簡(jiǎn)述如下:將細(xì)胞種在3孔板上，每孔約40×104，待分化成熟后，將質(zhì)粒按3微克/孔，轉(zhuǎn)染試劑 JetPRIMETM按9．6微克/孔稀釋，并等體積混合，室溫反應(yīng)30min后加入含培養(yǎng)基的3孔板中，培養(yǎng)24h熒光顯微鏡觀測(cè)其轉(zhuǎn)染率。分別采用 Western blot法檢測(cè) nephrin磷酸化的表達(dá)率。JetPRIMETM為法國(guó)Polyplus公司產(chǎn)品。Nck-siRNA、Fyn-siRNA由廣州銳博生物科技構(gòu)建。

4．Western blot測(cè)定nephrin的磷酸化:RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，每組取50μg蛋白上樣，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，分別加入一抗(兔抗pY1228 nephrin抗體)，4℃過夜。辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗37℃孵育1h。利用 UVP化學(xué)熒光成像系統(tǒng)(ChemiDoc-ItTM600 Imaging System)進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影，以β-actin作為內(nèi)參校正。

5．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用 SPSS 13．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組比較用one-way ANOVA方差分析，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1．Dex改變 nephrin的磷酸化:與對(duì)照組相比，10、100nmol/L Dex處理足細(xì)胞明顯增加nephrin的磷酸化水平，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0．05，圖1)。100nmol/L Dex 與足細(xì)胞孵育 0、12、24、36h。與對(duì)照組相比，12h沒有明顯增加nephrin的磷酸化水平(P＞0．05)，而24、36h明顯增加 nephrin的磷酸化(P 均＜0．05，圖2)。

圖1 不同Dex濃度與足細(xì)胞培養(yǎng)24h的pY1228nephrin的表達(dá)

圖2 100nmol/L Dex濃度與足細(xì)胞培養(yǎng)不同時(shí)間pY1228 nephrin的表達(dá)

2．糖皮質(zhì)激素受體拮抗劑(RU-486)對(duì)Dex誘導(dǎo)nephrin磷酸化水平的影響:Dex(100nmol/L)與足細(xì)胞培養(yǎng)24h明顯誘導(dǎo)nephrin磷酸化，這種效應(yīng)可被糖皮質(zhì)激素受體拮抗劑RU-486(1μmol/L)所抑制，而不被1μmol/L鹽皮質(zhì)激素受體拮抗劑 RU-26752所抑制(圖3)。與對(duì)照組相比，Dex明顯增加nephrin的磷酸化水平(P＜0．05)，而RU-486明顯抑制Dex誘導(dǎo)nephrin磷酸化效應(yīng)(P＞0．05)，RU-486組較Dex組nephrin的磷酸化水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。與 Dex及 RU-26752組相比，RU-26752組nephrin磷酸化水平明顯升高(P＜0．05)，但與Dex組相比，不影響Dex誘導(dǎo)nephrin磷酸化效應(yīng)(P＞0．05，圖3)。

圖3 糖皮質(zhì)激素受體拮抗劑(RU-486)和鹽皮質(zhì)激素受體拮抗劑(RU-26752)對(duì)Dex誘導(dǎo)nephrin磷酸化水平的影響

3．siRNA沉默Nck或Fyn對(duì)Dex誘導(dǎo)nephrin磷酸化的影響:100nmol/L Dex與足細(xì)胞一起培養(yǎng)，分別加特異性siRNA沉默Nck或Fyn，培養(yǎng)24h。Dex明顯誘導(dǎo)nephrin磷酸化，特異性siRNA沉默Nck，可部分抑制Dex誘導(dǎo)nephrin磷酸化增加，與Dex組相比，Dex+Nck-siRNA組nephrin磷酸化水平下降22．2%(P＜0．05)。特異性siRNA沉默F(xiàn)yn則完全抑制Dex誘導(dǎo)nephrin磷酸的化，特異性siRNA沉默Nck及Fyn，亦完全抑制Dex誘導(dǎo)nephrin磷酸化(圖4)。

圖4 siRNA沉默Nck及Fyn降低Dex誘導(dǎo)nephrin磷酸化

討 論

nephrin是裂孔隔膜上的重要分子，相鄰足細(xì)胞足突之間通過nephrin相互連接，形成拉鏈樣結(jié)構(gòu)，阻止白蛋白濾出，其不僅是一種黏附分子，而且具有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能。最近研究發(fā)現(xiàn)，nephrin磷酸化在維持其足細(xì)胞的生理功能上起重要作用［7］。nephrin胞內(nèi)段可被Src家族激酶Fyn磷酸化，磷酸化后的nephrin能招募含SH2結(jié)構(gòu)的蛋白分子(如Nck等)，并與之結(jié)合，進(jìn)一步調(diào)節(jié)足細(xì)胞凋亡信號(hào)或骨架肌動(dòng)蛋白重組等［8］。因此，足細(xì)胞nephrin磷酸化是維持正常腎小球?yàn)V過屏障的重要開關(guān)。

地塞米松是治療原發(fā)性腎小球疾病的常見藥物，但其減輕蛋白尿的機(jī)制尚不十分明確，其對(duì)nephrin磷酸化的調(diào)節(jié)作用知之甚少。有研究顯示，在正常情況下體內(nèi)nephrin在Y1204和Y1228位點(diǎn)磷酸化均表明，在嘌呤霉素腎病(PAN)和人類微小病變腎病時(shí)這兩位點(diǎn)磷酸化相類似減少，在PAN腎病模型中，這種減少在大量蛋白尿之前出現(xiàn)［9］。因檢測(cè)Y1228位點(diǎn)磷酸化較Y1204位點(diǎn)更敏感，故本研究應(yīng)用抗Y1228抗體檢測(cè)nephrin的磷酸化水平。本研究結(jié)果顯示，Dex作用的12h未能使nephrin磷酸化明顯增加，而在24、36h nephrin磷酸化增加。低濃度(0、1nmol/L)nephrin磷酸化不明顯，而 10、100nmol/L Dex使nephrin磷酸化明顯增加，提示糖皮質(zhì)激素增加nephrin的磷酸化與其濃度及作用時(shí)間有關(guān)。本研究進(jìn)一步表明，Dex誘導(dǎo)nephrin磷酸化增加可被糖皮質(zhì)激素受體阻斷劑RU-486所阻斷，而不被鹽皮質(zhì)激素受體阻斷劑RU-26752所阻斷，表明Dex誘導(dǎo)nephrin磷酸化是通過與糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合的基因組作用方式實(shí)現(xiàn)，而不是通過非受體的非基因組作用方式來實(shí)現(xiàn)，與Ohashi等［10］報(bào)道相一致。

在對(duì)足細(xì)胞Nck或Fyn特異性敲除小鼠模型的研究中發(fā)現(xiàn)，足細(xì)胞失去正常的足突間連接結(jié)構(gòu)，并出現(xiàn)大量蛋白尿［11，12］。磷酸化nephrin能通過與適配蛋白Nck結(jié)合，調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白微絲重組。本研究結(jié)果顯示，siRNA抑制Nck或Fyn，前者可部分抑制Dex誘導(dǎo)nephrin磷酸化增加，后者完全抑制Dex誘導(dǎo)nephrin磷酸化，提示Fyn在nephrin磷酸化過程中的核心地位，而Nck可能參與調(diào)節(jié)nephrin磷酸化。與既往報(bào)道的在足細(xì)胞脂筏結(jié)構(gòu)中，Nck的SH3區(qū)與Fyn結(jié)合激活Fyn，形成正反饋，F(xiàn)yn活性增加導(dǎo)致毗鄰的nephrin分子多個(gè)酪氨酸殘基磷酸化相一致［13］。

綜上所述，本研究結(jié)果提示Dex與其受體結(jié)合促進(jìn)nephrin的磷酸化，對(duì)激素治療腎小球性蛋白尿機(jī)制有了進(jìn)一步理解，但控制nephrin磷酸化的最佳水平及藥物對(duì)nephrin磷酸化的影響，將是未來需要進(jìn)一步闡明的問題。

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